枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，首先進行干擾試驗，確定使用何種靈敏度的鱟試劑對枸櫞酸原料進行細菌內(nèi)毒素檢查；然后將待測的枸櫞酸原料稀釋配制成待測溶液，加入上述干擾試驗中確定的鱟試劑，進行細菌內(nèi)毒素檢測。本發(fā)明的枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，解決了新開發(fā)注射液產(chǎn)品中枸櫞酸原料的細菌內(nèi)毒素檢查問題；從源頭上對無菌產(chǎn)品質(zhì)量進行控制，對保證輸液產(chǎn)品的安全性有重要意義。該方法有生物化學(xué)的理論基礎(chǔ)，更科學(xué)；利用酶的分子生化反應(yīng)，專屬性高，重現(xiàn)性強，準確度和靈敏度高；操作簡單快速，無需特殊儀器設(shè)備，實用性強。
【專利說明】枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 輸液產(chǎn)品是醫(yī)院日常的必備基礎(chǔ)藥品。目前國內(nèi)輸液市場正處于價格戰(zhàn)，產(chǎn)品的 升級換代是關(guān)鍵，產(chǎn)品升級換代必然要對其使用的原料進行嚴格的控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量。 細菌內(nèi)毒素是控制項目之一。
[0003] 細菌內(nèi)毒素是熱原的主要代表物質(zhì)。熱原注入人體后產(chǎn)生熱原反應(yīng)。熱原反應(yīng)給 臨床治療帶來極大的危害，一般熱原進入人體后數(shù)分鐘至1小時內(nèi)，即會出現(xiàn)高熱癥狀，反 應(yīng)嚴重者會造成死亡，故必須嚴格控制。
[0004] 傳統(tǒng)的熱原檢查通常是在動物體內(nèi)進行實驗，實驗過程復(fù)雜繁瑣，且存在個異性， 不宜普遍推廣?，F(xiàn)在，醫(yī)藥工業(yè)普遍接受控制細菌內(nèi)毒素等于控制熱原。細菌內(nèi)毒素檢查 法通常采用凝膠法，其原理是：細菌內(nèi)毒素會激活凝固酶，形成凝膠反應(yīng)。這種檢測方法更 科學(xué)，更準確。
[0005] 枸櫞酸作為一種新的藥品原料，采用傳統(tǒng)的檢測方法不能準確地檢查出樣品中的 細菌內(nèi)毒素含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供一種枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法。
[0007] 本發(fā)明為解決這一問題所采取的技術(shù)方案是： 本發(fā)明的枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，包括如下步驟：首先選取L < 0. 25EU/ mg作為枸櫞酸原料的細菌內(nèi)毒素限值，進行干擾試驗，確定使用何種靈敏度的鱟試劑對枸 櫞酸原料進行細菌內(nèi)毒素檢查；然后將待測的枸櫞酸原料稀釋配制成待測溶液，最大有效 稀釋倍數(shù)MVD=20,加入上述干擾試驗中確定的鱟試劑，在37土 1°C的溫度下反應(yīng)60±2分 鐘，而后緩緩倒轉(zhuǎn)180°觀察管內(nèi)凝膠情況，管內(nèi)凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；管 內(nèi)凝膠不能保持完整從管壁滑脫者為陰性； 當鱟試劑，供試品的配方，生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境發(fā)生變化時，須重新進行干擾試 驗。
[0008] 干擾試驗的具體步驟如下： 步驟一、供試品溶液的制備 取枸櫞酸原料50mg加入到試管中，加入10ml細菌內(nèi)毒素檢查用水，震蕩，使原料充 分溶解，即為樣品溶液；用細菌內(nèi)毒素檢查用水將樣品溶液稀釋10倍，生成S1(l溶液；再用 Na2HP04溶液將S1(l溶液稀釋2倍，生成S2(l溶液；稀釋后的S 2(l溶液作為供試品溶液，即溶液 A； 步驟二、三組對照溶液的制備 將供試品溶液與細菌內(nèi)毒素標準品制成分別含細菌內(nèi)毒素濃度2.0 λ、1. Ο λ、〇. 5 λ 和0. 25 λ的內(nèi)毒素溶液，作為溶液Β ;每一濃度平行各做4支； 用細菌內(nèi)毒素檢查用水與細菌內(nèi)毒素標準品制成分別含細菌內(nèi)毒素濃度2. 〇λ、 1. 0 λ、〇. 5 λ和〇. 25 λ的內(nèi)毒素溶液，作為溶液c ;每一濃度平行各做4支； 取細菌內(nèi)毒素檢查用水，作為溶液D ; 步驟三、細菌內(nèi)毒素檢測 向盛裝有上述四組溶液的各個試管中加入一定靈敏度的鱟試劑，輕輕混勻后，垂直放 入37±1°C試管恒溫儀中，保溫60±2分鐘；將試管從恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°， 觀察并記錄各個試管的細菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果； 步驟四、統(tǒng)計分析 當溶液A和溶液D所有試管均為陰性；溶液B和溶液C中的最大濃度2.0 λ管均 為陽性，最低濃度的〇.25λ管均為陰性時，試驗結(jié)果有效；按統(tǒng)計學(xué)方法分別計算溶 液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Es和溶液Β的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Et ;當 0· 5 λ彡Es彡2. 0 λ、且〇· 5Es彡Et彡2. OEs時，則試驗有效，認為供試品在該濃度下不存 在干擾作用，確定該靈敏度的鱟試劑；如Et不在此規(guī)定范圍內(nèi)，則應(yīng)重新更換靈敏度更高 的鱟試劑重復(fù)進行以上試驗內(nèi)容。
[0009] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是： 本發(fā)明的枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，解決了新開發(fā)注射液產(chǎn)品中枸櫞酸原 料的細菌內(nèi)毒素檢查問題；從源頭上對無菌產(chǎn)品質(zhì)量進行控制，對保證輸液產(chǎn)品的安全性 有重要意義。該方法有生物化學(xué)的理論基礎(chǔ)，更科學(xué)；利用酶的分子生化反應(yīng)，專屬性高，重 現(xiàn)性強，準確度和靈敏度高；操作簡單快速，無需特殊儀器設(shè)備，實用性強。

【具體實施方式】
[0010] 以下參照具體實施例對本發(fā)明的枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法進行詳細 的說明。
[0011] 本發(fā)明的枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，包括如下步驟：首先進行干擾試 驗，確定使用何種靈敏度的鱟試劑對枸櫞酸原料進行細菌內(nèi)毒素檢查；然后將待測的枸櫞 酸原料稀釋配制成待測溶液，最大有效稀釋倍數(shù)MVD=20,加入上述干擾試驗中確定的鱟試 齊IJ，在37± 1°C的溫度下反應(yīng)60±2分鐘，而后緩緩倒轉(zhuǎn)180°觀察管內(nèi)凝膠情況，管內(nèi)凝膠 不變形、不從管壁滑脫者為陽性；管內(nèi)凝膠不能保持完整從管壁滑脫者為陰性； 當鱟試劑，供試品的配方，生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境發(fā)生變化時，須重新進行干擾試 驗。
[0012] 干擾試驗的具體步驟如下： 步驟一、供試品溶液的制備 取枸櫞酸原料50mg加入到試管中，加入10ml細菌內(nèi)毒素檢查用水，震蕩，使原料充 分溶解，即為樣品溶液；用細菌內(nèi)毒素檢查用水將樣品溶液稀釋10倍，生成S1(l溶液；再用 Na2HP04溶液將S1(l溶液稀釋2倍，生成S2(l溶液；稀釋后的S 2(l溶液作為供試品溶液，即溶液 A； 步驟二、三組對照溶液的制備 將供試品溶液與細菌內(nèi)毒素標準品制成分別含細菌內(nèi)毒素濃度2.0 λ、1. Ο λ、〇. 5 λ 和0. 25 λ的內(nèi)毒素溶液，作為溶液Β ;每一濃度平行各做4支； 用細菌內(nèi)毒素檢查用水與細菌內(nèi)毒素標準品制成分別含細菌內(nèi)毒素濃度2. 〇λ、 1. 0 λ、〇. 5 λ和〇. 25 λ的內(nèi)毒素溶液，作為溶液c ;每一濃度平行各做4支； 取細菌內(nèi)毒素檢查用水，作為溶液D ; 步驟三、細菌內(nèi)毒素檢測 向盛裝有上述四組溶液的各個試管中加入一定靈敏度的鱟試劑，輕輕混勻后，垂直放 入37±1°C試管恒溫儀中，保溫60±2分鐘；將試管從恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°， 觀察并記錄各個試管的細菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果； 步驟四、統(tǒng)計分析 當溶液A和溶液D所有試管均為陰性；溶液B和溶液C中的最大濃度2.0 λ管均 為陽性，最低濃度的〇.25λ管均為陰性時，試驗結(jié)果有效；按統(tǒng)計學(xué)方法分別計算溶 液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Es和溶液Β的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Et ;當 0· 5 λ彡Es彡2. 0 λ、且〇· 5Es彡Et彡2. OEs時，則試驗有效，認為供試品在該濃度下不存 在干擾作用，確定該靈敏度的鱟試劑；如Et不在此規(guī)定范圍內(nèi)，則應(yīng)重新更換靈敏度更高 的鱟試劑重復(fù)進行以上試驗內(nèi)容。
[0013] 實施例1 目前，原料的細菌內(nèi)毒素檢查主要是參考《中國藥典》的標準進行，當《中國藥典》中未 收載該原料的細菌內(nèi)毒素檢測標準時，可參考其它國家等法定藥典標準或相關(guān)文獻，《中國 藥典》中并未收載枸櫞酸原料。《英國藥典》中枸櫞酸原料的細菌內(nèi)毒素限值：L < 0. 5EU/ mg。建立枸櫞酸原料的內(nèi)控標準，將細菌內(nèi)毒素限值分別設(shè)定為L < 0. 25EU/mg和L < 0. 125EU/mg，對比試驗結(jié)果。
[0014] 由于枸櫞酸偏酸性，需使用無熱原碳酸鈉減弱其酸性使其供試品溶液pH值在 6. 0-8. 0之間，以滿足細菌內(nèi)毒素檢查法要求?？紤]到無熱原碳酸鈉可能會影響試驗結(jié)果， 選取NA2HP04與無熱原碳酸鈉同時進行試驗，對比試驗結(jié)果。Na 2HP04溶液主要是調(diào)節(jié)供試 液的酸堿度。
[0015] 依據(jù)以上兩點，進行細菌內(nèi)毒素初篩試驗，對比無熱原碳酸鈉和NA2HP04的試驗 效果。
[0016] 分別使用Na2HP04溶液、無熱原碳酸鈉減弱供試液的酸性，細菌內(nèi)毒素限值分別設(shè) 定為L < 0. 25EU/mg和L < 0. 125EU/mg進行初篩試驗。初篩試驗結(jié)果如表1所示。
[0017] 表1初篩試驗結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：首 先選取L < 0. 25EU/mg作為枸櫞酸原料的細菌內(nèi)毒素限值進行干擾試驗，確定使用何種靈 敏度的鱟試劑對枸櫞酸原料進行細菌內(nèi)毒素檢查；然后將待測的枸櫞酸原料稀釋配制成待 測溶液，最大有效稀釋倍數(shù)MVD=20,加入上述干擾試驗中確定的鱟試劑，在37土 1°C的溫度 下反應(yīng)60±2分鐘，而后緩緩倒轉(zhuǎn)180°觀察管內(nèi)凝膠情況，管內(nèi)凝膠不變形、不從管壁滑 脫者為陽性；管內(nèi)凝膠不能保持完整從管壁滑脫者為陰性； 當鱟試劑，供試品的配方，生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境發(fā)生變化時，須重新進行干擾試 驗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的枸櫞酸原料中細菌內(nèi)毒素的檢測方法，其特征在于，干擾試 驗的具體步驟如下： 步驟一、供試品溶液的制備 取枸櫞酸原料50mg加入到試管中，加入10ml細菌內(nèi)毒素檢查用水，震蕩，使原料充 分溶解，即為樣品溶液；用細菌內(nèi)毒素檢查用水將樣品溶液稀釋10倍，生成S1(l溶液；再用 Na2HP04溶液將S1(l溶液稀釋2倍，生成S2(l溶液；稀釋后的S 2(l溶液作為供試品溶液，即溶液 A； 步驟二、三組對照溶液的制備 將供試品溶液與細菌內(nèi)毒素標準品制成分別含細菌內(nèi)毒素濃度2.0 λ、1.〇 λ、〇. 5 λ 和0. 25 λ的內(nèi)毒素溶液，作為溶液Β ;每一濃度平行各做4支； 用細菌內(nèi)毒素檢查用水與細菌內(nèi)毒素標準品制成分別含細菌內(nèi)毒素濃度2. 〇λ、 1. 0 λ、〇. 5 λ和〇. 25 λ的內(nèi)毒素溶液，作為溶液c ;每一濃度平行各做4支； 取細菌內(nèi)毒素檢查用水，作為溶液D ; 步驟三、細菌內(nèi)毒素檢測 向盛裝有上述四組溶液的各個試管中加入一定靈敏度的鱟試劑，輕輕混勻后，垂直放 入37土1°C試管恒溫儀中，保溫60±2分鐘；將試管從恒溫儀中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°， 觀察并記錄各個試管的細菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果； 步驟四、統(tǒng)計分析 當溶液A和溶液D所有試管均為陰性；溶液B和溶液C中的最大濃度2.0 λ管均 為陽性，最低濃度的〇.25λ管均為陰性時，試驗結(jié)果有效；按統(tǒng)計學(xué)方法分別計算溶 液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Es和溶液Β的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值Et ;當 0· 5 λ彡Es彡2. 0 λ、且〇· 5Es彡Et彡2. OEs時，則試驗有效，認為供試品在該濃度下不存 在干擾作用，確定該靈敏度的鱟試劑；如Et不在此規(guī)定范圍內(nèi)，則應(yīng)重新更換靈敏度更高 的鱟試劑重復(fù)進行以上試驗內(nèi)容。
【文檔編號】C12Q1/56GK104232739SQ201410403423
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】陳瑩, 孫毅, 金麗, 武曉飛 申請人:中國大冢制藥有限公司