一種淋球菌檢測用引物組、含有該引物組的試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淋球菌檢測用引物組，述引物組以淋球菌PorA基因為靶基因、基于環(huán)介導等溫擴增技術(shù)設(shè)計，所述引物組包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，各引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID：2～5所示。本發(fā)明的引物組靈敏度高、特異性強，可滿足淋球菌的快速準確檢測的需求。本發(fā)明還公開了一種淋球菌檢測試劑盒，該試劑盒可快速檢測淋球菌，具有檢測時間短、成本低、準確率高等優(yōu)點。
【專利說明】—種淋球菌檢測用引物組、含有該引物組的試劑盒及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種淋球菌檢測用引物組、含有該引物組的試劑盒及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002]性病傳播快，危害大，其中淋病在世界廣泛流行，常年居性病發(fā)病率之首。其病原體是淋病奈瑟氏菌(簡稱淋球菌)。人是淋球菌的惟一自然宿主，淋球菌通常寄居于粘膜表面的柱狀上皮細胞內(nèi)，其主要致病物質(zhì)包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，主要通過性接觸直接感染泌尿生殖道、口咽部和肛門直腸粘膜，或在分娩時通過產(chǎn)道感染新生兒，臨床表現(xiàn)為單純性淋病、盆腔炎、口咽部和肛門直腸病、淋菌性結(jié)膜炎及播散性淋病。若不及時治療，可引起尿道狹窄、輸精管及輸卵管狹窄甚或閉鎖，繼發(fā)宮外孕和男女不育不孕癥。因此，對淋病的早期診斷和治療十分重要。
[0003]淋球菌感染后約有1%男性無任何癥狀，75%的女性患者無癥狀，因此，僅憑有無臨床癥狀作為判斷是否感染淋球菌的依據(jù)，漏診率極高，尤其是女性。目前，主要依靠涂片和培養(yǎng)檢查，涂片容易漏診，尤其是在淋病潛伏期，培養(yǎng)檢查程序繁瑣，耗時長，同樣易出假陰性。因此，建立準確可靠的檢測方法十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有的淋球菌檢測方法程序繁瑣、耗時長、準確率較低的問題。
[0005] 因此，本發(fā)明提供了一種淋球菌檢測用引物組，所述引物組以淋球菌PorA基因為靶基因、基于環(huán)介導等溫擴增技術(shù)設(shè)計，所述引物組包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，各引物的核苷酸序列分別為:
[0006]外引物F3: (SEQ ID NO:2)
[0007]CCATTGATCCTTGGGACAG
[0008]外引物B3: (SEQ ID NO:3)
[0009]CAGACCGGCATAATACACAT
[0010]內(nèi)引物FIP: (SEQ ID NO:4)
[0011 ] GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG
[0012]內(nèi)引物BIP: (SEQ ID NO:5)
[0013]AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA。
[0014]在上述技術(shù)方案中，對于淋球菌而言，常用于其核酸擴增檢測的基因有16SrRNA、cppB、orf 1、opa、porA,其中porA基因(其序列如SEQ ID N0:1所示)在臨床應用中顯示較好的敏感性、特異性和保守性，因此本發(fā)明選擇PorA作為檢測淋球菌的靶基因。
[0015]在上述技術(shù)方案中，環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)是一種快速、靈敏、準確的核酸檢測方式，它采用4-6條特異引物(針對基因的6-8個區(qū)域)及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在65°C左右對核酸進行等溫擴增，短時間擴增效率可達到19~1ltl個拷貝。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑盒儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。將恒溫基因擴增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實時定量PCR)進行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學指標上相當于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR技術(shù)。其中，引物是LAMP法實現(xiàn)擴增的關(guān)鍵。
[0016]在上述技術(shù)方案中，所述引物組是經(jīng)過對所有淋球菌不同菌株的porA基因進行比對，標出易突變的位點和突變頻率，選擇最保守的porA600-900bp區(qū)域作為引物設(shè)計的靶序列，使用軟件設(shè)計得出的。LAMP引物組至少含有4條引物，包括兩個外引物(F3和B3)和兩個內(nèi)引物(FIP和BIP，各約40bp)。其中，內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc (與Fl區(qū)域互補)和F2序列，內(nèi)引物BIP包含Blc (與BI區(qū)域互補)和B2序列。F3和B3在起始擴增反應時起作用；FIP和BIP在整個擴增過程中都起作用，是最關(guān)鍵的一對引物，導致產(chǎn)生環(huán)狀的莖環(huán)結(jié)構(gòu)無限擴增。本發(fā)明的引物組，能夠特異結(jié)合淋球菌PorA序列上的6個特異區(qū)域，進行淋球菌的LAMP檢測時，出峰時間早，信號強，靈敏度高、特異性強，本發(fā)明的引物組根據(jù)是否擴增就能該判斷靶標物質(zhì)存在與否，可滿足淋球菌的快速準確檢測的需求。
[0017]作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述引物組還包括環(huán)引物FLP和環(huán)引物BLP，兩個環(huán)引物的核苷酸序列分別為:
[0018]環(huán)引物FLP: (SEQ ID NO:6)
[0019]ATACCGTCGTGGCGTTTG
[0020]環(huán)引物BLP: (SEQ ID NO:7)
[0021 ] CGCCTATACGCCTGCTAC。
[0022]加入環(huán)引物(FLP和BLP)的引物組能夠特異結(jié)合靶序列上的8個特異區(qū)域，它不僅保持了原引物組(未加環(huán)引物之前的引物組)信號強、靈敏度高、特異性強的優(yōu)勢，還進一步使得LAMP反應加速,反應時間縮短,大大增加了擴增檢測的效率。
[0023]本發(fā)明還提供了一種淋球菌檢測試劑盒，所述淋球菌檢測試劑盒包含所述的引物組。引物組可以僅包含所述外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，還可以進一步包含所述環(huán)引物FLP和環(huán)引物BLP。為了提高檢測效率，優(yōu)選包含所述外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物FLP和環(huán)引物BLP的引物組。所述淋球菌檢測試劑盒可快速檢測淋球菌，靈敏性和特異性高、檢測時間短、準確率高。
[0024]作為對上述技術(shù)方案的進一步改進,所述淋球菌檢測試劑盒還包括BstDNA聚合酶、反應液、顯色液和陽性對照液。Bst DNA聚合酶、反應液、顯色液和陽性對照液是除引物組之外LAMP反應所必需的其他試劑，將這些試劑納入試劑盒中，可便于使用者操作。其中，Bst DNA聚合酶具有5’ 一 3’ DNA聚合酶活性，能在恒溫下擴增DNA核酸；Bst DNA聚合酶不具有3’ 一5’外切核酸酶活性，能將新合成的核酸單鏈從新生成的DNA雙鏈上置換(取代)下來，形成兩條獨立的核酸單鏈以開啟下一輪的DNA核酸合成，進而免去了每次擴增前的DNA變性環(huán)節(jié)。反應液一般包括LAMP反應時所需的dNTP、buffer、Mg2+和甜菜堿；顯色液用于核酸檢測，通常使用的顯色液有SYTO-9、SYBR Green I ,SYBR Green IKSYBR Gold、GelStar 等。
[0025]作為對上述技術(shù)方案的更進一步改進，所述BstDNA聚合酶的濃度為6-10U/ μ L ；
[0026]所述反應液含有:1.4 ~1.8mmol/LdNTP、15 ~25mmol/LTris-HCl、9 ~12mmol/LKC1、9 ~12mmol/L (NH4)2SO4'5 ~8mmol/LMgS04、0.1 ~0.12 體積 ％ TritonX-100,0.8 ~1.2mol/L甜菜堿；
[0027]所述顯色液為SYT0-9 或 SYBRGreen I ；
[0028]所述陽性對照為淋球菌PorA基因DNA片段；
[0029]所述引物組中各引物的濃度為:所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L,所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.4~1.8 μ mol/L ;或
[0030]所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L，所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.4~
1.8 μ mol/L,所述環(huán)引物 FLP 和 BLP 各 0.7 ~0.9 μ mol/L。
[0031]上述淋球菌檢測試劑盒使用方便，具體使用方法包括以下步驟:(I)準備待測樣品DNA; (2)在反應管中加入所述反應液10~14 μ L，所述BstDNA聚合酶0.8~1.2yL，ddH207~9μ L，所述引物組0.8~1.2μ L以及所述樣品DNA1.5~2.5 μ L，進行環(huán)介導等溫擴增反應；(3)在上述反應管和陽性對照組中分別加入所述顯色液，混勻，樣品組顯色與陽性對照組相同則為陽性，否則為陰性。
[0032] 作為對上述技術(shù)方案的更進一步改進，所述BstDNA聚合酶的濃度為8U/ μ L ;
[0033]所述反應液含有:1.6mmo I /LdNTP, 20mmo I /LTr i s-HC IU Ommo I /LKCIU Ommo I /L(NH4)2S04、6mmol/LMgS04、0.1% TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；
[0034]所述顯色液為0.2 μ mol/L SYT0-9 ；
[0035]所述弓丨物組中各引物的濃度為:所述外引物F3和B3各0.2 μ mol/L,所述內(nèi)引物FIP 和 BIP 各 1.6 μ mol/L ;或
[0036]所述外引物F3和B3各0.2 μ mol/L,所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ mol/L,所述環(huán)引物 FLP 和 BLP 各 0.8 μ mol/L。
[0037]為了保證LAMP反應的穩(wěn)定性，優(yōu)選地，所述淋球菌檢測試劑盒還包括穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為石臘油。
[0038]本發(fā)明還提供了所述的淋球菌檢測用引物組或所述的淋球菌檢測試劑盒在檢測淋球菌中的應用。本發(fā)明的引物組和試劑盒均可用于淋球菌的檢測，且具有檢測靈敏度高、特異性強、效率高、成本低等優(yōu)點。
[0039]作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述的應用包括以下步驟:
[0040]I)提取樣品中的DNA ；
[0041]2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行環(huán)介導等溫擴增反應；
[0042]3)檢測擴增產(chǎn)物。
[0043]所述步驟3)中，擴增產(chǎn)物的檢測可通過擴增產(chǎn)物凝膠電泳、擴增產(chǎn)物濁度觀測或擴增產(chǎn)物化學發(fā)光檢測的方法進行，優(yōu)選擴增產(chǎn)物化學發(fā)光檢測的方法，即使用熒光染料如SYT0-9、SYBRGreen I等直接對產(chǎn)物進行染色，可以通過肉眼直接觀察結(jié)果。
[0044]作為對上述技術(shù)方案的進一步改進，所述步驟2)中，所述環(huán)介導等溫擴增反應的起始階段溫度為60~65°C，持續(xù)時間為25~35s ;擴增循環(huán)階段溫度為60~65°C，共進行80~100個循環(huán)，每個循環(huán)的持續(xù)時間為40~60s。
[0045]所述環(huán)介導等溫擴增反應兩個階段的具體反應步驟如下:
[0046]I)起始階段:
[0047]I步:當雙鏈DNA處于65°C左右的動態(tài)平衡中時，引物組中的BIP引物就能通過互補結(jié)合到目標DNA雙鏈上，在Bst DNA聚合酶作用下，啟動DNA合成；
[0048]2步:從BIP的B2區(qū)域3’端開始合成DNA模板的互補鏈至F3C ；
[0049]3步:B3引物退火結(jié)合到模板DNA的互補區(qū)域B3C，啟動鏈取代合成，同時釋放由BIP引物引導合成的互補鏈；
[0050]4步:釋放的DNA的BIC區(qū)域結(jié)合BI區(qū)域，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；3步釋放的DNA鏈作為FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式啟動DNA的合成及鏈取代，釋放的DNA鏈的FIP端同樣形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。進而，形成啞鈴結(jié)構(gòu)擴增始發(fā)物。
[0051]2)擴增循環(huán)階段(延伸階段):
[0052]5步:啞鈴結(jié)構(gòu)通過自引導DNA合成迅速轉(zhuǎn)換成莖狀結(jié)構(gòu)DNA ；
[0053]6步:BIP引物與莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀單鏈區(qū)域結(jié)合并開始新的DNA合成，由于Fl及FlC的互補關(guān)系，再次形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，先前合成的DNA鏈得以釋放；
[0054]7步:FIP引物同樣與對應的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀單鏈區(qū)域結(jié)合，由于BI及BlC的互補關(guān)系，再次形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，先前合成的DNA鏈得以釋放；
[0055]8步:如此周而復始，最終形成不同長度(目的片段長度的自然倍數(shù))花椰菜cauliflower狀的反向重復序列。
[0056]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
[0057]本發(fā)明的引物組，在進行淋球菌的LAMP檢測時，出峰時間早，信號強，靈敏度高，檢測限可達Ipg/μ L，陰性的穩(wěn)定性良好，而且特異性強，對銅綠假單胞菌、大腸桿菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、陰溝腸桿菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、草綠色鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷白桿菌、溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、無名念珠菌、季頁蒙念珠菌、解脂酵母菌、克柔念珠菌、挪威念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、乳酸桿菌、灰色奈瑟氏菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌、彭氏變形桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌27種菌均無非特異擴增，可滿足淋球菌的快速準確檢測的需求。
[0058]本發(fā)明的淋球菌檢測試劑盒，只需一個恒定溫度就能進行擴增反應，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；本發(fā)明的淋球菌檢測試劑盒利用針對六個區(qū)段的四條引物或針對八個區(qū)段的六條引物，根據(jù)是否擴增即能判斷淋球菌存在與否，因此具有高度特異性；本發(fā)明的淋球菌檢測試劑盒擴增快速且高效，在不到一個小時即可完成擴增，且產(chǎn)率高；本發(fā)明的淋球菌檢測試劑盒鑒定簡便，加入顯色液后，陰陽性結(jié)構(gòu)顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1為本發(fā)明LAMP的引物組成及對應區(qū)域示意圖；
[0060]圖2為porAl、porA2’、porA3引物的LAMP反應結(jié)果圖；
[0061]圖3為porA2’引物引入環(huán)引物的LAMP反應結(jié)果圖；
[0062]圖4為LAMP引物porA2的靈敏度試驗圖；
[0063]圖5為porA2引物擴增28種菌的特異性試驗圖；
[0064]圖6為Ipg/ μ L精密度試驗圖；
[0065]圖7為陰性精密度試驗圖。

【具體實施方式】
[0066]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行更為詳細的描述，但是以下描述僅用于對本發(fā)明進行解釋性說明，并不對本發(fā)明的保護范圍進行任何的限制，凡依據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
所作的等同變換，均同理包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例中所用淋球菌為標準菌株ATCC49266，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，在廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院保存。
[0067]實施例1
[0068]淋球菌檢測用LAMP引物組的設(shè)計
[0069]設(shè)計步驟如下:
[0070]①查閱中外文文獻，常用于淋球菌核酸擴增檢測的基因有16SrRNA、cppB、orf Kopa、porA,其中porA在臨床應用中顯示較好的敏感性、特異性和保守性,本研究選擇porA作為檢測淋球菌的靶基因
[0071]②在NCBI搜索所有淋球菌不同菌株的porA基因進行比對，標出易突變的位點和突變頻率
[0072]③選擇最保守的porA 600_900bp區(qū)域作為引物設(shè)計的靶序列
[0073]④使用在線設(shè)計軟件Primer Explorer vers1n4設(shè)計特異引物。
[0074]本發(fā)明LAMP的引物組成及對應區(qū)域如圖1所示，設(shè)計得到的三組引物，其序列分別如下所示:
[0075](I)淋球菌引物組porAl,革巴基因:porA
[0076]表1-1淋球菌引物組porAl

【權(quán)利要求】
1.一種淋球菌檢測用引物組，其特征在于:所述引物組以淋球菌PorA基因為靶基因、基于環(huán)介導等溫擴增技術(shù)設(shè)計，所述弓丨物組包括外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP，各引物的核苷酸序列分別為: 外引物F3:
CCATTGATCCTTGGGACAG
外引物B3:
CAGACCGGCATAATACACAT
內(nèi)引物FIP:
GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG
內(nèi)引物BIP:
AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA。
2.如權(quán)利要求1所述的淋球菌檢測用引物組，其特征在于:所述引物組還包括環(huán)引物FLP和環(huán)引物BLP，兩個環(huán)引物的核苷酸序列分別為: 環(huán)引物FLP:
ATACCGTCGTGGCGTTTG
環(huán)引物BLP:
CGCCTATACGCCTGCTAC。
3.—種淋球菌檢測試劑盒，其特征在于:所述淋球菌檢測試劑盒包含權(quán)利要求1或2所述的引物組。
4.如權(quán)利要求3所述的淋球菌檢測試劑盒,其特征在于:所述淋球菌檢測試劑盒還包括Bst DNA聚合酶、反應液、顯色液和陽性對照液。
5.如權(quán)利要求4所述的淋球菌檢測試劑盒，其特征在于: 所述Bst DNA聚合酶的濃度為6-10U/ μ L ； 所述反應液含有:1.4 ~L 8mmol/LdNTP、15 ~25mmol/LTris-HCl、9 ~12mmol/LKCl、9 ~12mmol/L(NH4)2S04、5 ~8mmol/LMgS04、0.1 ~0.12 體積 ％ TritonX-100、0.8 ~1.2mol/L甜菜堿； 所述顯色液為SYT0-9或SYBRGreen I ； 所述陽性對照為淋球菌PorA基因DNA片段； 所述引物組中各引物的濃度為:所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L，所述內(nèi)引物 FIP 和 BIP 各 1.4 ~1.8 μ mol/L ;或 所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L,所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.4~1.8 μ mol/L,所述環(huán)引物 FLP 和 BLP 各 0.7 ~0.9 μ mol/L。
6.如權(quán)利要求5所述的淋球菌檢測試劑盒，其特征在于: 所述Bst DNA聚合酶的濃度為8U/ μ L ; 所述反應液含有:1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)2S04、6mmol/LMgS04、0.1% TritonX-100、lmol/L 甜菜堿； 所述顯色液為0.2 μ mol/L SYTO-9 ； 所述引物組中各引物的濃度為:所述外引物F3和B3各0.2ymol/L，所述內(nèi)引物FIP和BIP 各 1.6 μ mol/L ;或所述外引物F3和B3各0.2 μ mol/L,所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ mol/L,所述環(huán)引物 FLP 和 BLP 各 0.8 μ mol/L。
7.如權(quán)利要求3~6中任一權(quán)利要求所述的淋球菌檢測試劑盒，其特征在于:所述淋球菌檢測試劑盒還包括穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑為石蠟油。
8.如權(quán)利要求1或2所述的淋球菌檢測用引物組或權(quán)利要求3~6中任一權(quán)利要求所述的淋球菌檢測試劑盒在檢測淋球菌中的應用。
9.如權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于:包括以下步驟: 1)提取待測樣品中的DNA; 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行環(huán)介導等溫擴增反應； 3)檢測擴增產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于:所述環(huán)介導等溫擴增反應的起始階段溫度為60~65°C，持續(xù)時間為25~35s ;擴增循環(huán)階段溫度為60~65°C，共進行80~100個循環(huán)，每個循環(huán)的持續(xù)時間為40~60s。
【文檔編號】C12Q1/04GK104131112SQ201410404761
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】郭旭光, 夏勇, 江鏡全, 陳瓊, 劉美玲, 唐曉華 申請人:廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院