一種由尿液dna無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測胎兒染色體非整倍的方法，尤其涉及一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法。本發(fā)明通過孕婦尿液中游離DNA提取結(jié)合高通量測序及生物信息分析，可以檢測胎兒染色體是否非整倍，從而辨別胎兒是否患唐氏綜合癥，真正實(shí)現(xiàn)了檢測的無創(chuàng)傷性，被檢測者依從度更高。
【專利說明】一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測胎兒染色體非整倍的方法，尤其涉及一種由尿液DNA無創(chuàng)傷 性檢測胎兒染色體非整倍的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 染色體非整倍體異常在遺傳性疾病中發(fā)生率高且嚴(yán)重影響出生人口質(zhì)量，細(xì)胞遺 傳學(xué)分析是用于懷疑染色體異常胎兒高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的常規(guī)檢查，能準(zhǔn)確地檢測非整倍體異 常，準(zhǔn)確率高達(dá)99. 5%。但傳統(tǒng)的染色體疾病檢測多采用羊膜腔穿刺、絨毛取樣、臍血取樣等 方法獲取胎兒細(xì)胞，以培養(yǎng)其細(xì)胞用于核型分析，其操作帶有創(chuàng)傷性，還有可能造成宮內(nèi)感 染，流產(chǎn)等并發(fā)癥，而且還需要一段時(shí)間從培養(yǎng)的胎兒細(xì)胞中制備中期染色體，耗時(shí)長、技 術(shù)要求高，給病人造成一定的恐懼心理，為產(chǎn)前診斷帶來不便，正因?yàn)槿绱?，作為?chuàng)傷性診 斷時(shí)都要有一定指征，并不適合每一位孕婦，其推廣應(yīng)用有一定的局限性，因此尋找一種既 安全又準(zhǔn)確的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法是從事產(chǎn)前診斷工作者的當(dāng)務(wù)之急。
[0003] 自2008年，香港中文大學(xué)的盧煜明教授實(shí)驗(yàn)室率先采用新一代測序的方法，對母 體外周血中的游離DNA進(jìn)行高通量測序，然后利用生物信息的方法，分析母體和胎兒DNA中 21號染色體上DNA片段比例準(zhǔn)確分析胎兒是否患有唐氏綜合征[1]。從此開創(chuàng)了利用無 需羊穿、絨毛膜、臍血穿刺等創(chuàng)傷性檢測，直接測序分析母體外周血游離DNA來檢測胎兒染 色體疾病的技術(shù)。利用外周血的游離DNA來做檢測胎兒染色體疾病無需進(jìn)行侵入性檢測、 感染風(fēng)險(xiǎn)小、檢測周期短等優(yōu)點(diǎn)。但由于母體外周血中胎兒DNA的含量不高，一般為10% 左右，因此在樣本前處理的過程中，如果實(shí)驗(yàn)不當(dāng)、或樣本保存不周便會造成母體血細(xì)胞溶 血，大量的母體細(xì)胞DNA進(jìn)入血漿，進(jìn)而大大稀釋了胎兒DNA的含量，即會造成檢測難度加 大，降低了檢測靈敏度。故抽血后的樣本前處理非常重要，不管是立即離心分離血漿還是采 用streak公司生產(chǎn)的特殊血漿保存管，都有母體樣本潛在溶血的風(fēng)險(xiǎn)。因此尋找是否有更 好的無創(chuàng)檢測手段成為國內(nèi)外科學(xué)家共同的研究目標(biāo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法， 真正實(shí)現(xiàn)了檢測的無創(chuàng)傷性，被檢測者依從度更高。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決： 一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法，包括以下步驟： 1) 孕婦樣本選擇：選擇孕周大于12周、外周血胎兒游離DNA含量穩(wěn)定并隨著孕周逐步 增加的孕婦； 2) 孕婦尿液分離：留取孕婦中段尿50ml，立即平均轉(zhuǎn)移到兩個(gè)50ml的BD管，2000g離 心力離心20分鐘，吸取上清備用； 3) 孕婦尿液中游離DNA提??； 4) 通過若干正常孕婦尿液游離DNA高通量測序數(shù)據(jù)庫與若干唐氏綜合癥患兒孕婦尿 液游離DNA高通量測序數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建并對比建立21號染色體非整倍體數(shù)據(jù)； 5) 對待檢測者的尿液游離DNA進(jìn)行高通量測序； 6) 生物信息分析得出胎兒染色體是否非整倍：若待檢測者的尿液游離DNA的21號染 色體含量落入非整倍體數(shù)據(jù)范圍，則為非整倍體。
[0006] 通過孕婦尿液中游離DNA提取結(jié)合高通量測序及生物信息分析，可以檢測胎兒染 色體是否非整倍，從而辨別胎兒是否患唐氏綜合癥，真正實(shí)現(xiàn)了檢測的無創(chuàng)傷性，被檢測者 依從度更高。
[0007] 進(jìn)一步的，所述步驟3)采用磁珠法提取，具體包括以下步驟： (1) 裂解：在2-20ml尿液中中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振蕩混勻10秒，再向全血 中加入4ml裂解液，振蕩混勻，56°C下溫育10分鐘，獲得混合液； (2) 核酸吸附：向上述步驟（1)所得混合液中加入6ml結(jié)合液，充分混勻后再加入20 μ L 磁珠懸浮液，充分混勻2分鐘，形成含有磁珠-DNA的復(fù)合體溶液，將上述復(fù)合體溶液置于磁 架上靜置吸附1~2分鐘，棄上清液，獲得磁珠-DNA的復(fù)合體； (3) 漂洗：向上述磁珠-DNA的復(fù)合體中加入10ml終濃度組成為1?4 mol/L鹽酸胍、 0. 2?2mol/L醋酸鈉、體積終濃度3(Γ70%的無水乙醇、pH值4. (Γ 6. 0、以水為溶劑的漂洗夜， 振蕩重懸磁珠10秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘，棄上清，再加入10ml體積濃度為70%的 無水乙醇水溶液的漂洗液，振蕩重懸磁珠10秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘后，棄上清，室 溫靜置至無乙醇?xì)馕?，獲得漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體； (4) 洗脫：最后向步驟（3)漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體中加入0. 5-1. 5ml洗脫液，振蕩 混勻20秒，55°C孵育5分鐘，振蕩混勻5秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘，取上清，獲得所述 游離DNA。
[0008] 尿液中的DNA片段較短，因此現(xiàn)有的純化富集效果不理想，磁珠法提取對于尿液 中存在的5(Tl00bp左右的DNA純化效果較為理想。
[0009] 更進(jìn)一步的，所述磁珠懸浮液按如下方法制備：（1)磁性粒子的配制：首先對 4mol/L的氫氧化鈉水溶液通氮?dú)膺M(jìn)行除氧處理，然后將氫氧化鈉水溶液置于80°C的水浴 中并持續(xù)通入氮?dú)?；其次，?. 5mol/L氯化鐵水溶液與0. 5mol/L氯化亞鐵鹽酸溶液以體積 比2:1混合，緩慢倒入上述水浴中的氫氧化鈉水溶液中，攪拌反應(yīng)30分鐘，將反應(yīng)液靜置冷 卻沉淀，去除上清；最后取沉淀用無水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性 粒子；所述氫氧化鈉水溶液與氯化鐵水溶液和氯化亞鐵鹽酸溶液的總體積比為1:0. 6 ; (2) 磁性粒子修飾配基：取上述磁性粒子用去離子水進(jìn)行超聲分散，獲得磁性粒子分散液，向所 述磁性粒子分散液中分別加入無水乙醇、質(zhì)量濃度22~25%濃氨水、體積濃度40%的正硅酸 乙酯的乙醇溶液，在400rpm下攪拌24小時(shí)，將反應(yīng)混合液用乙醇與水分別清洗三次，最后 用4ml去離子水分散，獲得所述磁珠懸浮液；所述去離子水的體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì) 為100ml/g，所述無水乙醇體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為400ml/g，濃氨水體積用量以磁性 粒子質(zhì)量計(jì)為5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為5ml/g。
[0010] 利用這種方法制得的磁珠懸浮液，加強(qiáng)了小片段DNA的吸附能力，平均10ml尿液 含游離DNA 5ng，經(jīng)試驗(yàn)表明可以用于檢測胎兒染色體非整倍。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：通過孕婦尿液游離DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍， 真正實(shí)現(xiàn)了檢測的無創(chuàng)傷性，被檢測者依從度更高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明的尿液DNA提取效果圖； 圖2是正常人染色體組與唐氏綜合征胎兒染色體組的21號染色體百分含量對比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述： 實(shí)施例1 : 一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法，包括以下步驟： 1)孕婦樣本選擇：選擇孕周大于12周的孕婦，此時(shí)外周血胎兒游離DNA含量穩(wěn)定并隨 著孕周逐步增加。
[0014] 以下孕婦不在選擇之列： ?孕婦自身存在染色體結(jié)構(gòu)異常； ?懷有雙胎或者多胎的孕婦； ?一年內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、細(xì)胞治療或在四周內(nèi)接受過外源DNA治療的孕 婦； ?通過體外受精-胚胎移植（IVF-ET)方式受孕的孕婦； ?體重大于l〇〇Kg的孕婦； ?孕婦患惡性腫瘤患。
[0015] 2)孕婦尿液分離 留取孕婦中段尿50ml，立即平均轉(zhuǎn)移到兩個(gè)50ml的BD管，2000g離心力離心20分鐘， 吸取上清以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0016] 3)孕婦尿液DNA提取 (1) 裂解：在2-20ml尿液中中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振蕩混勻10秒，再向全血 中加入4ml裂解液，振蕩混勻，56°C下溫育10分鐘，獲得混合液； (2) 核酸吸附：向上述步驟（1)所得混合液中加入6ml結(jié)合液，充分混勻后再加入20 μ L 磁珠懸浮液，充分混勻2分鐘，形成含有磁珠 -DNA的復(fù)合體溶液，將上述復(fù)合體溶液置于磁 架上靜置吸附1~2分鐘，棄上清液，獲得磁珠 -DNA的復(fù)合體； (3) 漂洗：向上述磁珠 -DNA的復(fù)合體中加入10ml終濃度組成為1?4 mol/L鹽酸胍、 0. 2?2mol/L醋酸鈉、體積終濃度3(Γ70%的無水乙醇、pH值4. (Γ 6. 0、以水為溶劑的漂洗夜， 振蕩重懸磁珠10秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘，棄上清，再加入10ml體積濃度為70%的 無水乙醇水溶液的漂洗液，振蕩重懸磁珠10秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘后，棄上清，室 溫靜置至無乙醇?xì)馕?，獲得漂洗后的磁珠 -DNA的復(fù)合體； (4) 洗脫：最后向步驟（3)漂洗后的磁珠 -DNA的復(fù)合體中加入0. 5-1. 5ml洗脫液，振蕩 混勻20秒，55°C孵育5分鐘，振蕩混勻5秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘，取上清，獲得所述 游離DNA。
[0017] 磁珠懸浮液按如下方法制備：（1)磁性粒子的配制：首先對4mol/L的氫氧化鈉水 溶液通氮?dú)膺M(jìn)行除氧處理，然后將氫氧化鈉水溶液置于80°C的水浴中并持續(xù)通入氮?dú)猓黄?次，將0. 5mol/L氯化鐵水溶液與0. 5mol/L氯化亞鐵鹽酸溶液以體積比2:1混合，緩慢倒入 上述水浴中的氫氧化鈉水溶液中，攪拌反應(yīng)30分鐘，將反應(yīng)液靜置冷卻沉淀，去除上清；最 后取沉淀用無水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氫氧化鈉水 溶液與氯化鐵水溶液和氯化亞鐵鹽酸溶液的總體積比為1 :〇. 6 ; (2)磁性粒子修飾配基：取 上述磁性粒子用去尚子水進(jìn)行超聲分散，獲得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子分散液中 分別加入無水乙醇、質(zhì)量濃度22~25%濃氨水、體積濃度40%的正硅酸乙酯的乙醇溶液，在 400rpm下攪拌24小時(shí)，將反應(yīng)混合液用乙醇與水分別清洗三次，最后用4ml去離子水分散， 獲得所述磁珠懸浮液；所述去離子水的體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為l〇〇ml/g，所述無水 乙醇a體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為400ml/g，濃氨水體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為5ml/ g，正硅酸乙酯的乙醇溶液體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為5ml/g。
[0018] 利用本實(shí)施例中的磁珠懸浮液，加強(qiáng)了小片段DNA的吸附能力，平均10ml尿液含 游離DNA 5ng。Angilent 2100的檢測結(jié)果可以看到200bp以下有DNA條帶存在，如圖1所 /_J、1 〇
[0019] 4)通過10個(gè)正常孕婦尿液游離DNA高通量測序數(shù)據(jù)庫與9個(gè)唐氏綜合癥患兒孕 婦尿液游離DNA高通量測序數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建并對比建立21號染色體非整倍體數(shù)據(jù)： 利用BWA軟件將所有測序所得序列去人類基因組參考序列進(jìn)行基因組比對，比對序列 長度為36堿基，不允許有錯(cuò)配和Gap，得到每個(gè)染色體對應(yīng)的reads數(shù)目，計(jì)算每個(gè)樣品中 每條染色體所在的百分比，我們選用染色體核型分析正常的孕婦10個(gè)樣本的數(shù)據(jù)建立正 ?；蚪M的參考值，然后選用9個(gè)21三體樣本進(jìn)行t-test分析，發(fā)現(xiàn)21三體的人群中21 號染色體的百分含量與正常人有顯著差異（P=〇. 03502)，如圖2所示； 5) 對待檢測者的尿液游離DNA進(jìn)行高通量測序； 6) 生物信息分析得出待檢測者的胎兒染色體是否非整倍：若待檢測者的尿液游離DNA 的21號染色體含量落入非整倍體數(shù)據(jù)范圍，則為非整倍體。
[0020] 其中測序文庫的構(gòu)建采用以下步驟： (1)末端修整 a) 配制如下反應(yīng)體系：

【權(quán)利要求】
1. 一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法，其特征在于：包括以下步 驟： 1) 孕婦樣本選擇：選擇孕周大于12周、外周血胎兒游離DNA含量穩(wěn)定并隨著孕周逐步 增加的孕婦； 2) 孕婦尿液分離：留取孕婦中段尿50ml，立即平均轉(zhuǎn)移到兩個(gè)50ml的BD管，2000g離 心力離心20分鐘，吸取上清備用； 3) 孕婦尿液中游離DNA提?。? 4) 通過若干正常孕婦尿液游離DNA高通量測序數(shù)據(jù)庫與若干唐氏綜合癥患兒孕婦尿 液游離DNA高通量測序數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建并對比建立21號染色體非整倍體數(shù)據(jù)； 5) 對待檢測者的尿液游離DNA進(jìn)行高通量測序； 6) 生物信息分析得出待檢測者的胎兒染色體是否非整倍：若待檢測者的尿液游離DNA 的21號染色體含量落入非整倍體數(shù)據(jù)范圍，則為非整倍體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法，其 特征在于：所述步驟3)采用磁珠法提取，具體包括以下步驟： (1) 裂解：在2-20ml尿液中中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振蕩混勻10秒，再向全血 中加入4ml裂解液，振蕩混勻，56°C下溫育10分鐘，獲得混合液； (2) 核酸吸附：向上述步驟（1)所得混合液中加入6ml結(jié)合液，充分混勻后再加入20 μ L 磁珠懸浮液，充分混勻2分鐘，形成含有磁珠-DNA的復(fù)合體溶液，將上述復(fù)合體溶液置于磁 架上靜置吸附1~2分鐘，棄上清液，獲得磁珠-DNA的復(fù)合體； (3) 漂洗：向上述磁珠-DNA的復(fù)合體中加入10ml終濃度組成為1?4 mol/L鹽酸胍、 0. 2?2mol/L醋酸鈉、體積終濃度3(Γ70%的無水乙醇、pH值4. (Γ 6. 0、以水為溶劑的漂洗夜， 振蕩重懸磁珠10秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘，棄上清，再加入10ml體積濃度為70%的 無水乙醇水溶液的漂洗液，振蕩重懸磁珠10秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘后，棄上清，室 溫靜置至無乙醇?xì)馕叮@得漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體； (4) 洗脫：最后向步驟（3)漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體中加入0. 5-1. 5ml洗脫液，振蕩 混勻20秒，55°C孵育5分鐘，振蕩混勻5秒，在磁架上靜置吸附1~2分鐘，取上清，獲得所述 游離DNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種由尿液DNA無創(chuàng)傷性檢測胎兒染色體非整倍的方法，其 特征在于：所述磁珠懸浮液按如下方法制備：（1)磁性粒子的配制：首先對4mol/L的氫氧 化鈉水溶液通氮?dú)膺M(jìn)行除氧處理，然后將氫氧化鈉水溶液置于80°C的水浴中并持續(xù)通入氮 氣；其次，將〇. 5mol/L氯化鐵水溶液與0. 5mol/L氯化亞鐵鹽酸溶液以體積比2:1混合，緩 慢倒入上述水浴中的氫氧化鈉水溶液中，攪拌反應(yīng)30分鐘，將反應(yīng)液靜置冷卻沉淀，去除 上清；最后取沉淀用無水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氫 氧化鈉水溶液與氯化鐵水溶液和氯化亞鐵鹽酸溶液的總體積比為1:0. 6 ; (2)磁性粒子修 飾配基：取上述磁性粒子用去離子水進(jìn)行超聲分散，獲得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子 分散液中分別加入無水乙醇、質(zhì)量濃度22~25%濃氨水、體積濃度40%的正硅酸乙酯的乙醇 溶液，在400rpm下攪拌24小時(shí)，將反應(yīng)混合液用乙醇與水分別清洗三次，最后用4ml去離 子水分散，獲得所述磁珠懸浮液；所述去離子水的體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為l〇〇ml/g， 所述無水乙醇體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為400ml/g，濃氨水體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì) 為5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液體積用量以磁性粒子質(zhì)量計(jì)為5ml/g。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195241SQ201410406896
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】苗正友 申請人:嘉興市婦幼保健院