一種規(guī)?；苽涮囟ǚ肿恿啃》肿油该髻|(zhì)酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種規(guī)模化制備特定分子量小分子透明質(zhì)酸的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶，以水為反應(yīng)介質(zhì)，水解高分子透明質(zhì)酸，實(shí)現(xiàn)了高效制備370000Da、80000Da、30000Da、9000Da、4000Da特定分子量的透明質(zhì)酸，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵罐上制備小分子透明質(zhì)酸，適合于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種規(guī)?；苽涮囟ǚ肿恿啃》肿油该髻|(zhì)酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種規(guī)?；苽涮囟ǚ肿恿啃》肿油该髻|(zhì)酸的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,簡(jiǎn)稱HA),俗稱玻璃尿酸,是一種由D-葡萄糖醒酸和N-乙酰氨基葡萄糖為重復(fù)雙糖單位，通過β (1-3)和β (1-4)糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人從牛玻璃球眼中首次提取獲得，廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域。研究表明，分子量對(duì)透明質(zhì)酸的活性有很大影響，不同分子量的透明質(zhì)酸甚至表現(xiàn)出截然相反的活性。
[0003]透明質(zhì)酸以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等。尤為重要的是，透明質(zhì)酸具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質(zhì)，被稱為理想的天然保濕因子，由于HA具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，同時(shí)無(wú)任何免疫原性和毒性，被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng)域。
[0004]根據(jù)文獻(xiàn)研究表明，分子量大小對(duì)HA的生物活性影響較大，不同分子量范圍的HA表現(xiàn)出截然不同的生理學(xué)功能。高分子量的HA(Mr>2X106)由于具有較好的粘彈性、保濕性、抑制炎性反應(yīng)、潤(rùn)滑等功能，可應(yīng)用于高端化妝品行業(yè)、眼科手術(shù)黏彈劑和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療。中等分子量的HA(介于IXlO5-1O6)具有良好的保濕性、潤(rùn)滑和藥物緩釋作用，可廣泛用于化妝品、滴眼液、皮膚燒傷愈合及術(shù)后防粘連。低分子量的HA和寡聚透明質(zhì)酸，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的生物活性，具有抑制腫瘤擴(kuò)散、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)骨和血管生成、免疫調(diào)節(jié)等作用，且易于滲透到真皮中，免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子的激活劑。因此，小分子透明質(zhì)酸在食品保健、化妝品以及臨床醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]制備小分子量的方法有物理降解法、化學(xué)降解法、酶解法。物理法主要為加熱、機(jī)械剪切力、紫外線、超聲波、6°Co照射、Y-射線輻射等方法促使HA發(fā)生降解。物理降解法處理過程簡(jiǎn)單，產(chǎn)品易于回收。但是，這些方法都會(huì)帶來(lái)一定的影響，例如加熱法易使HA變色，紫外和超聲效率較低等，且產(chǎn)生的小分子分子量范圍較大，產(chǎn)品穩(wěn)定性較差。HA的化學(xué)降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCl)和堿水解(NaOH)，氧化降解常用的氧化劑為次氯酸鈉(NaClO)和過氧化氫(H2O2)15但化學(xué)降解法引入了化學(xué)試劑，反應(yīng)條件復(fù)雜，易給HA性質(zhì)產(chǎn)生影響和給產(chǎn)品的純化帶來(lái)困難，且產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水。酶解法是透明質(zhì)酸在透明質(zhì)酸酶的作用下，糖鏈上的糖苷鍵發(fā)生斷裂，但通常酶解的成本很高，不適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明為解決制備小分子HA的問題，采用生物酶法催化降解HA，產(chǎn)生分子量范圍均一的小分子透明質(zhì)酸。由于生物酶法反應(yīng)條件溫和、專一性高、且產(chǎn)品純度高，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)制備小分子透明質(zhì)酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明公開了一種規(guī)?；苽涮囟ǚ肿恿啃》肿油该髻|(zhì)酸的方法，是向水中加入高分子透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸酶，控制不同反應(yīng)時(shí)間制備不同分子量(聚糖單位)的小分子透明質(zhì)酸，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008]編碼所述透明質(zhì)酸酶的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID N0.1所示的序列。
[0009]所述高分子HA的分子量是104kDa以上。優(yōu)選2.212X 114Da0
[0010]所述方法優(yōu)選在帶有自動(dòng)溫控和攪拌裝置的發(fā)酵罐中進(jìn)行。
[0011]所述方法的反應(yīng)體系優(yōu)選含有透明質(zhì)酸酶1X106U/L_4X108U/L和高分子透明質(zhì)酸2-100g/L，在10°C -65°C,400-1000rpm攪拌速度條件下反應(yīng)l_13h，制備平均分子量在4000Da至370000Da的透明質(zhì)酸。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選含有透明質(zhì)酸酶3X 107U/L和高分子透明質(zhì)酸40g/L，在45°C，700rpm攪拌速度條件下反應(yīng)不同時(shí)間制備不同分子量的透明質(zhì)酸。
[0013]為制備出平均分子量為370000Da的透明質(zhì)酸，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選I小時(shí)。為制備出平均分子量為80000Da的透明質(zhì)酸，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選2.5小時(shí)。為制備出平均分子量為30000Da的透明質(zhì)酸，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選3.5小時(shí)。為制備出平均分子量為9000Da的透明質(zhì)酸，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選7小時(shí)。為制備出平均分子量為4000Da的透明質(zhì)酸，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選12.5小時(shí)。
[0014]本發(fā)明利用透明質(zhì)酸酶直接降解HA制備小分子透明質(zhì)酸，具有直接的目的性。與其他方式相比，該發(fā)明具有非常大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。首先，反應(yīng)條件極其簡(jiǎn)單，在常溫常壓下即可實(shí)施，透明質(zhì)酸溶解在水中，不需要緩沖液，生產(chǎn)成本低；其次酶水解工藝不需添加任何有機(jī)試劑，無(wú)任何污染廢棄物產(chǎn)生；最后，由于沒有添加鹽類，產(chǎn)物在水溶液中比較單一，易于純化回收，產(chǎn)量極高，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸?；趹?yīng)用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備單一寡聚透明質(zhì)酸及其衍生體具有潛在而非常廣泛的價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是酶促反應(yīng)過程中HA分子量變化趨勢(shì)圖；
[0016]圖2是分子量370000Da的透明質(zhì)酸的HPSEC (高效分子排阻色譜)圖；
[0017]圖3是分子量80000Da的透明質(zhì)酸的HPSEC圖；
[0018]圖4是分子量30000Da的透明質(zhì)酸的HPSEC圖；
[0019]圖5為分子量9000Da左右的透明質(zhì)酸的HPSEC圖；
[0020]圖6為分子量4000Da左右的透明質(zhì)酸的HPSEC圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021]水解產(chǎn)物檢測(cè)分析方法:使用安捷倫公司的高效液相色譜儀1260進(jìn)行分析，選擇示差檢測(cè)器RID,使用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear進(jìn)行分析。流動(dòng)相選擇0.1M硝酸鈉進(jìn)行洗脫，柱子溫度設(shè)定為40攝氏度，進(jìn)樣量40 μ L，每個(gè)樣品洗脫時(shí)間25min，使用中國(guó)食品藥品檢定研究院出產(chǎn)的右旋糖酐作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用GPC軟件進(jìn)行平均分子質(zhì)量的計(jì)笪
ο
[0022]透明質(zhì)酸酶活力單位定義:在pH5.5和38°C下，每小時(shí)從透明質(zhì)酸中釋放I μ g葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。DNS還原糖測(cè)定方法測(cè)定酶活。
[0023]實(shí)施例1透明質(zhì)酸酶的表達(dá)
[0024]全化學(xué)合成經(jīng)改造的透明質(zhì)酸酶基因序列(SEQ ID N0.1)，酶切連接至表達(dá)載體PPIC9K構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-His-HaseA3887，轉(zhuǎn)化至E.coil DH5 α中，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。將重組質(zhì)粒經(jīng)SalI線性化后電轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主P.pastoris GS115中，重組克隆子經(jīng)PCR驗(yàn)證正確。
[0025]重組P.pastoris GS115/pPIC9K-His_HaseA3887 克隆子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)。單克隆接種于5ml的YH)培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30°C、200rpm培養(yǎng)16h。按10%的接種量轉(zhuǎn)接于10ml的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMGY (酵母提取物1g/L，蛋白胨 20g/L, 3g/LK2HP04,11.8g/LKH2P04,10XYNB 100ml/L(13.4g/L)，500X 生物素lmL(4X10_4g/L)，甘油10mL)，30°C 200rpm培養(yǎng)至OD6c?值為4之間。離心收集菌體，更換至10mL 誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基 BMMY (酵母提取物 10g/L，蛋白胨 20g/L，3g/LK2HP04，11.8g/LKH2P04，100X YNB 100mL/L(13.4g/L)，500X 生物素 lmL(4X l(T4g/L)，甲醇 5mL)，30°C 200rpm 培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為1.0% (v/v)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)96h。
[0026]實(shí)施例2重組透明質(zhì)酸酶的純化制備
[0027]SEQ ID N0.1所示的基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后在透明質(zhì)酸酶N端融合了 6個(gè)連續(xù)組氨酸標(biāo)簽，根據(jù)親和層析原理，該標(biāo)簽?zāi)芴禺愋耘c葡聚糖鎳結(jié)合。葡聚糖鎳先用PH6.0、50mM的磷酸鹽緩沖液平衡30min，再加入經(jīng)過0.45 μ m過濾的發(fā)酵液，在4°C孵育2h，依次用相同緩沖液配置的0、10、20、30、40、50mM的咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫雜質(zhì)。最后用500mM的咪唑緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白。高濃度咪唑洗脫的目標(biāo)蛋白進(jìn)行過夜透析。獲得單一條帶的透明質(zhì)酸酶純蛋白，所得透明質(zhì)酸酶純蛋白，經(jīng)測(cè)定，具有透明質(zhì)酸酶活力。
[0028]實(shí)施例3小分子量透明質(zhì)酸的制備
[0029]以水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸酶對(duì)大分子量透明質(zhì)酸進(jìn)行水解，起始分子量大小是
2.212X 114Da0上罐體積1L，在發(fā)酵罐中加入900mL的水，并加入透明質(zhì)酸酶3X 17U和透明質(zhì)酸40g,最后加水至1L,在45°C、轉(zhuǎn)速為700rpm條件下反應(yīng)。每隔半小時(shí)取樣并在沸水中煮沸10分鐘將酶滅活，樣品采用0.22 μ m的濾膜過濾，使用凝膠柱進(jìn)行分子量測(cè)定，繪制出的分子量變化趨勢(shì)圖。發(fā)酵罐在I小時(shí)高溫滅活，可制備出分子量為370000Da的透明質(zhì)酸；發(fā)酵罐在2.5小時(shí)高溫滅活，可制備出分子量為SOOOODa的透明質(zhì)酸；發(fā)酵罐在3.5小時(shí)高溫滅活，可制備出分子量為30000Da的透明質(zhì)酸，發(fā)酵罐在7小時(shí)高溫滅活，可制備出分子量為9000Da的透明質(zhì)酸，發(fā)酵罐在12.5小時(shí)高溫滅活，可制備出分子量為4000Da的透明質(zhì)酸。如圖1所示，罐中HA分子量變化趨勢(shì)圖。如圖2所示,是分子量370000Da的HPSEC圖。如圖3所示，是分子量80000Da的HPSEC圖。如圖4所示，是分子量30000Da的HPSEC圖。如圖5所示，是分子量9000Da的HPSEC圖。如圖6所示，是分子量4000Da的HPSEC 圖。
[0030]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種制備特定分子量透明質(zhì)酸的方法，其特征在于，是向水中加入高分子透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸酶，控制不同反應(yīng)時(shí)間制備不同分子量的小分子透明質(zhì)酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述透明質(zhì)酸酶的核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高分子透明質(zhì)酸的分子量是104kDa以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系含有透明質(zhì)酸酶I X 106U/L-4 X 108U/L 和高分子透明質(zhì)酸 2-100g/L，在 10 V -65 V，400-1000rpm 攪拌速度條件下反應(yīng)l_13h，制備平均分子量在4000Da至370000Da的透明質(zhì)酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系含有透明質(zhì)酸酶3X107U/L和高分子透明質(zhì)酸40g/L,在45°C,700rpm攪拌速度條件下反應(yīng)l_13h,制備平均分子量在4000Da至370000Da的透明質(zhì)酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)I小時(shí)，制備平均分子量為370000Da的透明質(zhì)酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)2.5小時(shí)，制備出平均分子量為80000Da的透明質(zhì)酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)3.5小時(shí)，制備出平均分子量為30000Da的透明質(zhì)酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)7小時(shí)，制備出平均分子量為9000Da的透明質(zhì)酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)12.5小時(shí)，制備出平均分子量為4000Da的透明質(zhì)酸。
【文檔編號(hào)】C12P19/26GK104178539SQ201410409643
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 康振, 李江華, 原攀紅 申請(qǐng)人:江南大學(xué)