編碼雙峰駝細(xì)胞色素p450的核苷酸序列、雙峰駝細(xì)胞色素p450及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列、雙峰駝細(xì)胞色素P450及其應(yīng)用，涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的主要技術(shù)方案為：一種編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列，所述核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO:1第29-1580位?；蛘?，所述核苷酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ?ID?NO:1第29-1580位的核苷酸序列雜交且編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450。或者，所述核苷酸序列與SEQ?ID?NO:1第29-1580位所述的核苷酸序列具有90％以上同源性且編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450。一種雙峰駝細(xì)胞色素P450，由如上所述核苷酸序列編碼。
【專利說明】編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列、雙峰駝細(xì)胞色素P450及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列、所編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450，以及核苷酸序列的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞色素P450是(cytochromeP450，CYP450) 一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長450nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質(zhì)，為一類亞鐵血紅素一硫醇鹽蛋白的超家族，主要存在于哺乳動(dòng)物的微粒體和線粒體中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾乎1000種CYP廣泛分布于各種生物機(jī)體內(nèi)，在生理上有功能意義的就有約50種，根據(jù)氨基酸序列的統(tǒng)一性分為17個(gè)家族和許多亞家族。它參與內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝。近年來，對CYP450的結(jié)構(gòu)、功能特別是對其在藥物代謝中的作用的研究有了較大的進(jìn)展。最新研究表明CYP450還是藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶，而且對細(xì)胞因子和體溫調(diào)節(jié)都有重要影響。
[0003]CYP450對體溫調(diào)節(jié)有重要影響，駱駝的體溫調(diào)節(jié)是比較強(qiáng)的，駱駝生存的沙漠地區(qū)吸熱性強(qiáng)，夏季中午時(shí)氣溫可高達(dá)37°C~42°C，沙面溫度可達(dá)65°C~75°C，而駱駝在如此高溫下仍堅(jiān)持正常的勞役，表現(xiàn)正常的生理機(jī)能。脫水或氣候極為炎熱時(shí)，駱駝也能通過行為來適應(yīng)高溫環(huán)境及轉(zhuǎn)換熱量。
[0004]駱駝的體溫在一定范圍內(nèi)可隨環(huán)境溫度的變化而變化，例如在夏季的早晨，體溫只有34°C，而在午后可達(dá)40.6°C~40.7°C，這種體溫的變化特點(diǎn)在散熱上具有極為重要的意義。體溫升高后，身體與外界環(huán)境的溫差減小，可以減少水分的蒸發(fā)，白天獲得的熱量可貯存于體內(nèi)，在晚上大氣溫度降低時(shí)散失。目前的研究表明，駱駝的熱調(diào)節(jié)功能非常復(fù)雜。每天飲水的駱駝，晝夜體溫差可達(dá)2 V，脫水情況下，駱駝體溫的變化范圍可達(dá)6 V。駱駝體溫不恒定的特點(diǎn)在能量貯存和散熱以及對干旱的適應(yīng)上具有重要意義。
[0005]由于駱駝同其他動(dòng)物相比有較強(qiáng)的體溫調(diào)節(jié)能力，可以適應(yīng)沙漠中的惡劣環(huán)境，這與很多因素有關(guān)，盡管國內(nèi)外對于細(xì)胞色素P450的研究很多，但是，對于雙峰駝特殊的解毒能力和體溫調(diào)節(jié)的研究甚少。近年來研究發(fā)現(xiàn)CYP450對體溫調(diào)節(jié)有重要影響，所以研究駱駝的CYP450有非常重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列，即提供雙峰駝中雙峰駝細(xì)胞色素P450基因的cDNA序列，以及由該序列編碼的雙峰駝細(xì)胞色素P450。
[0007]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0008]一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列，所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO:1第29-1580位。
[0009]或者，所述核苷酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO:1第29-1580位的核苷酸序列雜交且編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450。
[0010]或者，所述核苷酸序列與SEQ ID NO:1第29-1580位所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450。
[0011]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種雙峰駝細(xì)胞色素P450，由如上所述核苷酸序列編碼。
[0012]優(yōu)選的雙峰駝細(xì)胞色素P450由序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸組成。
[0013]或者，雙峰駝細(xì)胞色素P450為序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加獲得的衍生蛋白質(zhì)。
[0014]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種重組表達(dá)載體，包含如上所述核苷酸序列，或編碼如上所述蛋白質(zhì)。
[0015]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有如上所述的重組表達(dá)載體。
[0016]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種獲取編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列的方法，該方法包括:
[0017]PCR的正向引物為:
[0018]SEQ ID NO:3:5，-CCAGGCGTCGCACTTGTAC-3，；
[0019]反向引物為:
[0020]SEQ ID N0:4:5，-TGGAAAACGTCGCCATAGC-3，。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0022]本發(fā)明克隆并測序得到了雙峰駝駝乳中CYP450基因的cDNA序列，并對八種物種基因的CDS序列進(jìn)行同源性比較并作進(jìn)化樹，為今后研究雙峰駝CYP450提供基礎(chǔ)資料。
[0023]本發(fā)明中的雙峰駝的細(xì)胞色素P450蛋白序列及進(jìn)化樹可以直觀的表現(xiàn)出雙峰駝細(xì)胞色素P450序列與其他物種此蛋白序列的差異，為以后研究雙峰駝微粒體和線粒體中參與的內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)對研究雙峰駝及其他物種以及人類藥物代謝以及細(xì)胞因子和體溫調(diào)節(jié)的研究提供一定的理論依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為實(shí)施例1中雙峰駝細(xì)胞色素P450基因RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0025]圖2a、2b為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹所用細(xì)胞色素P450氨基酸同源性比較；
[0026]圖3為不同物種細(xì)胞色素P450氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0028]以下實(shí)施例中，所用百分比濃度如未特定指明，均為體積百分比濃度。
[0029]實(shí)施例1:雙峰駝CYP450基因cDNA序列的克隆
[0030]1、組織分離(Isolat1n)
[0031]從內(nèi)蒙古阿拉善盟采得雙峰駝，快速屠宰并取肝臟樣，將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于_70°C保存，拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
[0032]2、總 RNA 的分離(Total RNA isolat1n)
[0033](I)提取RNA的準(zhǔn)備工作
[0034]玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180°C烘烤4小時(shí)。
[0035]勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0.1%的DEPC(焦碳酸二乙酯)水沖洗，由于未滅活的DEPC對PCR反應(yīng)有影響，可用0.5%的SDS(十二烷基硫酸鈉)處理。
[0036]Tip頭、EP管用0.1 %的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。
[0037]雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每10ml水或溶液加0.1mlDEPC液，室溫放置過夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
[0038](2)組織總RNA提取
[0039]取10mg在液氮中凍存的組織樣放入有 Iml Trizol (trizal reagent, invitrogenBRL, USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000g離心10分鐘，吸取上清液，15-30°C溫育5分鐘，加0.2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒，15-30°C溫育2_3分鐘，4°C 12000g離心15分鐘。吸取上清液，加0.8ml異丙醇，混合均勻。15-30°C溫育10分鐘，4°C 12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加lml75v/v%Z醇洗滌RNA，4°C 7500g離心10分鐘，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水(RNase free)中分裝，_70°C保存。
[0040](3)組織總RNA的鑒定
[0041]通過分光光度計(jì)上測定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下:電泳槽用RNA清洗液(10mM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小時(shí)，再用DEPC處理過的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入I X TBE待用，瓊脂糖凝膠用I X TBE配制。在1ul上樣緩沖液(2 X TBE,13%菲可，0.1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2 - 3分鐘，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
[0042]3.全長 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
[0043](I)引物設(shè)計(jì)及合成
[0044]根據(jù)GenBanK 發(fā)表的人(Access1n No:AAA35738.1)、鼠(Access1nNo:AAA37509.1)、牛(Access1n No:DAA17508.1)等物種的雙峰駝細(xì)胞色素P450基因mRNA序列ORF側(cè)翼同源序列，設(shè)計(jì)如下引物用于PCR擴(kuò)增，以獲得雙峰駝細(xì)胞色素P450基因cDNA序列。引物用Primer Premier5.0自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成,該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 3 (正向)和SEQ ID NO: 4 (反向)，序列信息如下:
[0045]SEQ ID NO: 3 (正向):5，-CCAGGCGTCGCACTTGTAC-3，
[0046]SEQ ID NO:4(反向):5，-TGGAAAACGTCGCCATAGC-3，
[0047](2) RT-PCR 擴(kuò)增
[0048]按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成:10ul2XBcalst Buffer,4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture,0.5ulRnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,IulRNA Sample, 1.5ul Rnase Free dH20，總體系為 20ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:65°C I 分鐘，30°C 5分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR擴(kuò)增條件:97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)；72°C延伸10分鐘，4 °C保存。
[0049](3)克隆和測序
[0050]PCR擴(kuò)增片段的回收。片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進(jìn)行，操作過程如下:盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1.5mlEP管中。按每10mg瓊脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，1000g離心I分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，1000g離心15秒。倒掉管中液體，在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，1000g離心15秒，倒掉管中液體。離心I分鐘，將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置I分鐘后，1000g離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。
[0051]回收片段同T載體的連接。連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下:在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液:pMD18-T Vector (50ng/ul)0.5ul, DNA 20_40ng，Solut1n 15ul，加dH20至1ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過夜也可以)，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
[0052]質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。從_70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。10ul感受態(tài)細(xì)胞加入1ul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加400ul液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘。取10ul鋪于LB平板上，平板含0.1 % (V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
[0053]轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)。用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物同Marker—起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(結(jié)果如附圖1所示)，鑒別T載體上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入0.1 % (V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥?。
[0054]質(zhì)粒的回收。質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下:將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1.5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘，將吸附柱放入一個(gè)干凈的
1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘，EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。
[0055]質(zhì)粒的酶切鑒定。為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定。本研究具體操作如下:根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d III,保證目的片段中無這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系:Bam H I lul,Hind III lul, 10XK Buffer 2ul，DNA lul，加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0056]重組質(zhì)粒的測序。取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測序。
[0057]實(shí)施例2:雙峰駝CYP450基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建
[0058]1、雙峰駝CYP450的序列信息與生物信息學(xué)分析
[0059]本發(fā)明新的雙峰駝嗅覺感受器⑶S的長度為1591bp，詳細(xì)序列見SEQ ID N0:1，其中29-31位為起始密碼子ATG，1578-1580位為終止密碼子TGA，29-1580位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(CDS)。根據(jù)全長CDS推導(dǎo)出雙峰駝嗅覺感受器的氨基酸序列，共516個(gè)氨基酸殘基，詳見 SEQ ID N0:2,在線預(yù)測(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)結(jié)果顯不，其分子量為31738.41道爾頓，等電點(diǎn)(pi)為8.36。
[0060]2、CYP450基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建
[0061]在GenBank上搜索并獲得人、鼠等八種物種的八條CYP450基因的編碼蛋白序列，加上本發(fā)明獲得的SEQ ID N0.2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(見附圖3)。結(jié)果顯示:雙峰駝CYP450基因同牛的親緣關(guān)系最近。與馬的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。
[0062]雙峰駝和人、鼠、牛等動(dòng)物用Clustal X中對齊的細(xì)胞色素P450基因編碼氨基酸序列同源性比較結(jié)果見附圖2a、2b。各物種細(xì)胞色素P450的氨基酸序列相似性見表1，各物種細(xì)胞色素P450氨基酸的個(gè)數(shù)及分子量見表2，各物種細(xì)胞色素P450氨基酸的比例)見表3。
[0063]表1:各物種細(xì)胞色素P450的氨基酸序列相似性
[0064]

【權(quán)利要求】
1.一種編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是序列表中 SEQ ID NO:1 第 29-1580 位。
2.一種編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與權(quán)利要求1所述的核苷酸序列雜交且編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450。
3.一種編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列與權(quán)利要求I所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450。
4.一種雙峰駝細(xì)胞色素P450，由權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述核苷酸序列編碼。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙峰駝細(xì)胞色素P450，其特征在于，由序列表中SEQID NO: 2所示的氨基酸組成。
6.一種雙峰駝細(xì)胞色素P450，其特征在于，為序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加獲得的衍生蛋白質(zhì)。
7.—種重組表達(dá)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述核苷酸序列，或編碼權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體。
9.獲取編碼雙峰駝細(xì)胞色素P450的核苷酸序列的方法，其特征在于: PCR的正向引物為:
SEQ ID NO:3:5， -CCAGGCGTCGCACTTGTAC-3’ ； 反向引物為:
SEQ ID NO:4:5’ -TGGAAAACGTCGCCATAGC-3’。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK104178501SQ201410409777
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】陳鋼糧 申請人:新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司