高通量str序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高效快捷的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)的方法，包括首先在已擴(kuò)增到檢測(cè)基片的STR序列簇上雜交一對(duì)檢測(cè)引物，其中終引物上修飾熒光基團(tuán)；隨后利用核苷酸組合進(jìn)行分步延伸，同時(shí)在每輪延伸后檢測(cè)熒光信號(hào)，直至終引物上帶熒光的堿基被聚合酶切除，信號(hào)消失為止；最終分析熒光信號(hào)的情況，得到相應(yīng)的STR序列核心重復(fù)數(shù)。本發(fā)明采用通用的生物化學(xué)試劑，廣泛適用于生物芯片及高通量測(cè)序等檢測(cè)平臺(tái)，且信噪比很高，明顯提高了STR檢測(cè)的準(zhǔn)確性和對(duì)雜合STR的分辨率，同時(shí)其高通量特性使得該方法可以通過檢測(cè)更多STR基因座得到更加確信的結(jié)果以及檢測(cè)更多樣本實(shí)現(xiàn)快速的群體STR檢測(cè)。
【專利說明】高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種高效快捷的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù) 檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 十九世紀(jì)八十年代發(fā)現(xiàn)的DNA指紋圖譜，開創(chuàng)了檢測(cè)DNA多態(tài)性（生物的不同個(gè) 體或不同種群在DNA結(jié)構(gòu)上存在著差異）的多種多樣的手段，如RFLP(限制性內(nèi)切酶酶切 片段長(zhǎng)度多態(tài)性）分析、串聯(lián)重復(fù)序列分析、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)分析等等。各種 分析方法均以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)，產(chǎn)生具有高度個(gè)體特異性的DNA指紋圖譜，由于DNA指 紋圖譜具有高度的變異性和穩(wěn)定的遺傳性，且仍按簡(jiǎn)單的孟德爾方式遺傳，成為當(dāng)時(shí)最具 吸引力的遺傳標(biāo)記。
[0003] 1985年Jefferys博士首先將DNA指紋技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)鑒定。1989年該技術(shù)獲美 國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)作為正式法庭物證手段。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技 術(shù)的出現(xiàn)使對(duì)樣品量的需求大大降低，將分析目標(biāo)集中到VNTR(可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)）中的 較短的重復(fù)序列（STR)，使得較短的核酸片段也能夠用于分析。后來進(jìn)一步出現(xiàn)了多重PCR 技術(shù)，使STR基因分型檢測(cè)在法醫(yī)和刑偵中迅速推廣。
[0004] 短串聯(lián)重復(fù)序列又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR)或微衛(wèi)星DNA (microsatellite DNA)， 由2?6bp的核心序列組成，重復(fù)次數(shù)通常在15?30次。STR廣泛存在于真核生物基因 組中。由于STR核心序列的重復(fù)次數(shù)存在個(gè)體間差異，具有高度多態(tài)性，因而被作為一種遺 傳標(biāo)記廣泛地應(yīng)用于植物、動(dòng)物的種類鑒定中。在人類基因組中，STR分散在人的整個(gè)基因 組中，平均每15?20kb就存在一個(gè)STR基因座，約占人基因組的3%。STR標(biāo)記還具有多 態(tài)性豐富、易于檢測(cè)等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于人類遺傳制圖、基因定位、連鎖分析、親子鑒 定、罪犯鑒定和人類遺傳研究等方面。
[0005] 目前通用的STR檢測(cè)方法主要采用上世紀(jì)九十年代提出的分組多重?cái)U(kuò)增STR基因 座并通過熒光毛細(xì)管電泳對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè)，最后反饋出與核心重復(fù)數(shù)相應(yīng)的熒光 峰位。其基本原理是利用基因座內(nèi)等位基因長(zhǎng)度的不同以及擴(kuò)增的基因座之間片段長(zhǎng)度范 圍的不同，采用高分辨率的毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行分離。通常，對(duì)于每個(gè)基因座中一條引物進(jìn) 行熒光標(biāo)記，不同的基因座引物標(biāo)記不同的熒光，結(jié)合擴(kuò)增片段的遷移率和熒光的顏色，應(yīng) 用基因序列分析儀及采用相應(yīng)的分析軟件可自動(dòng)化檢出復(fù)合擴(kuò)增的眾多STR基因座的所 有信息。
[0006] 根據(jù)上述的檢測(cè)原理，不難判斷，目前的STR檢測(cè)方法具有如下的不足之處：（1) 檢測(cè)反應(yīng)基于第一代測(cè)序技術(shù)類似的熒光毛細(xì)管電泳法，該法的通量很低，無(wú)法對(duì)海量樣 本進(jìn)行大規(guī)模并行檢測(cè)；(2)由于需要根據(jù)產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度對(duì)STR進(jìn)行熒光分組，這意味著 該方法對(duì)檢測(cè)的基因座有數(shù)量上的限制，難以通過增加待測(cè)STR序列的手段，進(jìn)一步提高 生物學(xué)個(gè)體的識(shí)別率；（3)存在無(wú)效等位基因，致使不同的試劑盒有可能出現(xiàn)某些基因座 測(cè)定結(jié)果的差異；(4)由于是對(duì)片段長(zhǎng)度的檢測(cè)，對(duì)STR內(nèi)部核心重復(fù)中的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)位點(diǎn)無(wú)法檢測(cè)出來。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：提供一種高效快捷的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，以快速有 效地以較低成本對(duì)海量樣本的多個(gè)STR序列進(jìn)行大規(guī)模地并行檢測(cè)，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的 一個(gè)或多個(gè)問題。
[0008] 技術(shù)方案：一種高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0009] A.將一對(duì)引物雜交到待測(cè)STR序列上，其中下游引物帶熒光標(biāo)記；
[0010] B.重復(fù)交替地加入核苷酸單體組合，利用具有5' 一 3'外切酶活性的DNA聚合酶 合成待測(cè)STR序列的互補(bǔ)鏈，每次加入核苷酸單體組合完成聚合反應(yīng)后進(jìn)行清洗，然后檢 測(cè)熒光強(qiáng)度；
[0011] C.分析熒光信號(hào)的變化及信號(hào)變化發(fā)生的輪次，判斷STR序列的雜合情況并計(jì)算 出核心重復(fù)數(shù)。
[0012] 其具體操作過程包括以下步驟：
[0013] (1)樣本基因座STR序列的特異性擴(kuò)增
[0014] 選取相應(yīng)數(shù)量的STR序列，作為檢測(cè)對(duì)象；通過多重PCR技術(shù)，將上述STR序列從 人類DNA樣本的相應(yīng)基因座上擴(kuò)增出來；
[0015] 選取完待檢STR序列后，根據(jù)STR序列中核心重復(fù)單元的序列信息來設(shè)計(jì)聚合時(shí) 的核苷酸單體組合以及設(shè)計(jì)多組STR序列同時(shí)檢測(cè)的分組檢測(cè)方案，同時(shí)還需要設(shè)計(jì)每種 STR序列相應(yīng)的上下游檢測(cè)引物并合成；
[0016] (2)檢測(cè)基片上STR序列的固定及文庫(kù)制備
[0017] 檢測(cè)基片上的每一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)上僅有唯一樣本的同一種STR單鏈序列拷貝；
[0018] 上述STR單鏈序列拷貝可以直接固定于基片的固相載體表面，或者通過微媒介物 間接地先將單鏈序列拷貝固定在媒介物的表面，再將媒介物固定于檢測(cè)基片的表面；
[0019] (3) STR序列核心重復(fù)數(shù)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
[0020] 檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行前，首先讀取芯片上每個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)上的STR序列所屬的樣本信息以 及基因座信息；
[0021] 隨后加入混合后的上下游檢測(cè)引物進(jìn)行雜交，雜交完成后清洗并檢測(cè)熒光；
[0022] 不斷重復(fù)進(jìn)行加入核苷酸單體組合聚合的操作，并在每次聚合完全后清洗及檢測(cè) 熒光，直至整張反應(yīng)基片上所有反應(yīng)位點(diǎn)的熒光降低到下限閾值以下后結(jié)束檢測(cè)；
[0023] (4)突光信號(hào)分析
[0024] 根據(jù)檢測(cè)芯片上的每個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)在不同輪次下的熒光信號(hào)強(qiáng)度，找到熒光信號(hào)強(qiáng) 度發(fā)生衰減的反應(yīng)輪次，根據(jù)該輪次及核苷酸單體組合方式推導(dǎo)出該位點(diǎn)上STR序列的核 心重復(fù)數(shù)；
[0025] 同時(shí)需要對(duì)熒光信號(hào)衰減率進(jìn)行分析，判斷該位點(diǎn)的STR序列是否為雜合并根據(jù) 二次熒光衰減得到另一條等位STR序列的核心重復(fù)數(shù)；
[0026] 最終，通過對(duì)檢測(cè)芯片上海量位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到每個(gè)樣本的 每條STR序列的核心重復(fù)數(shù)及其純合比率。
[0027] 有益效果：本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 STR檢測(cè)技術(shù)從現(xiàn)有檢測(cè)平臺(tái)向高通量檢測(cè)平臺(tái)的轉(zhuǎn) 變，通過高通量地并行檢測(cè)，極大程度的減少了單個(gè)樣本的檢測(cè)時(shí)間和成本。本發(fā)明適用于 多種高通量檢測(cè)平臺(tái)，既可以適用于便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的生物芯片技術(shù)，又可以應(yīng)用于高通量 測(cè)序系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)大規(guī)模樣本的高速檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，檢測(cè)中的操作僅有 延伸聚合、清洗和檢測(cè)熒光三個(gè)步驟。涉及的生化反應(yīng)少且反應(yīng)間干擾小。本發(fā)明中的延 伸聚合反應(yīng)采用非專利保護(hù)的天然dNTP單體組合，可以降低延伸的錯(cuò)誤率，同時(shí)降低實(shí)驗(yàn) 的試劑成本。本發(fā)明在延伸反應(yīng)時(shí)不存在常規(guī)檢測(cè)方法中由于突光剪切帶來的突光信號(hào)的 衰減，延伸反應(yīng)可進(jìn)行非常多輪次，可以檢測(cè)多重復(fù)數(shù)的STR序列。本發(fā)明使用DNA聚合酶 自帶的5'外切酶活性，將包含熒光基團(tuán)的堿基整體切除。無(wú)需特意設(shè)計(jì)熒光的連接基團(tuán)以 及剪切試劑或者是淬滅方案，采用普通的熒光引物即可。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中直接固定在生物芯片固相載體表面的STR序列示意圖及其 功能分區(qū)。
[0029] 圖中：101表不檢測(cè)芯片的固相載體表面，102表不STR序列和固相載體表面的連 接基團(tuán)，103表示一對(duì)擴(kuò)增引物在STR序列上的位置，104表示一對(duì)檢測(cè)引物在STR序列上 的位置，105表示STR序列中待檢測(cè)的核心重復(fù)區(qū)域。
[0030] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中通過磁珠媒介固定于高通量測(cè)序芯片上的STR序列在檢測(cè) 過程中的示意圖。圖中合成鏈的延伸方向如圖示從右向左。
[0031] 圖中：201表不測(cè)序芯片的反應(yīng)基面，202表不磁珠，203表不連接基團(tuán)，204表不與 待檢STR序列雜交的帶熒光修飾的下游檢測(cè)引物，205表示DNA聚合酶，206表示經(jīng)之前輪 次的延伸聚合后已合成出的DNA鏈，207表示與待檢STR序列雜交的上游檢測(cè)引物。
[0032] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中通過磁珠媒介固定于高通量測(cè)序芯片上的STR序列在檢測(cè) 結(jié)束時(shí)熒光衰減的示意圖。圖中合成鏈的延伸方向如圖示從右向左。
[0033] 圖中：301表不測(cè)序芯片的反應(yīng)基面，302表不磁珠，303表不連接基團(tuán)，304表不被 聚合酶切除帶熒光堿基后的下游檢測(cè)引物，305表示DNA聚合酶，306表示經(jīng)之前輪次的延 伸聚合后已合成出的DNA鏈，307表示與待檢STR序列雜交的上游檢測(cè)引物，308表示被聚 合酶切除并沖洗離開反應(yīng)位點(diǎn)的帶熒光堿基。
[0034] 圖4a是本發(fā)明實(shí)施例中采用的物理區(qū)域分隔法將不同樣本的多種STR序列拷貝 簇固定在檢測(cè)基片上的示意圖。
[0035] 圖4b是圖4a的區(qū)域放大圖（含20個(gè)樣本的區(qū)域）。
[0036] 圖中：401表不檢測(cè)基片的固相載體表面，402表不固相載體表面上某個(gè)樣本的 STR拷貝簇構(gòu)成的檢測(cè)區(qū)域。
[0037] 圖4c是圖4b的區(qū)域放大圖（含16個(gè)STR拷貝簇）。
[0038] 圖4d是圖4c的簡(jiǎn)化示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 結(jié)合如圖1至圖4d描述本發(fā)明高效快捷的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法。
[0040] 實(shí)施例1 :基于生物芯片平臺(tái)的法醫(yī)學(xué)身份識(shí)別STR檢測(cè)
[0041] 該次實(shí)驗(yàn)為本發(fā)明在高通量芯片檢測(cè)平臺(tái)中的應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)數(shù)萬(wàn)個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的 并行檢測(cè)，相較于目前基于熒光毛細(xì)管電泳的96道并行檢測(cè)，單次運(yùn)行得到的檢測(cè)結(jié)果大 幅增多，這同時(shí)意味著單樣本的檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本的大幅下降。
[0042] 檢測(cè)步驟為：
[0043](一）芯片上檢測(cè)序列文庫(kù)的制備：
[0044] 首先，從待檢組織中提取出基因組DNA。選用如表1所示的16對(duì)擴(kuò)增引物，對(duì)基因 組DNA中的相應(yīng)基因座進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增。其中，Amelogenin為檢測(cè)性別的基因座，其余15種 為不同的STR基因座。
[0045] 該次實(shí)驗(yàn)選取的待檢STR序列為目前用于法醫(yī)學(xué)身份鑒定的16個(gè)標(biāo)準(zhǔn)序列，但本 方法檢測(cè)的序列種類并不局限于此，因?yàn)槊總€(gè)拷貝簇作為單獨(dú)的檢測(cè)位點(diǎn)，不存在位點(diǎn)間 的信號(hào)檢測(cè)范圍的相互交疊。
[0046] 表 1
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： A. 將一對(duì)引物雜交到待測(cè)STR序列上，其中下游引物帶熒光標(biāo)記； B. 重復(fù)交替地加入核苷酸單體組合，利用具有5' 一 3'外切酶活性的DNA聚合酶合成 待測(cè)STR序列的互補(bǔ)鏈，每次加入核苷酸單體組合完成聚合反應(yīng)后進(jìn)行清洗，檢測(cè)熒光強(qiáng) 度； C. 分析熒光信號(hào)的變化及信號(hào)變化發(fā)生的輪次，判斷STR序列的雜合情況并計(jì)算出核 心重復(fù)數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效快捷的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在 于：待測(cè)的STR序列簇固定于固相載體表面，其中所述固相載體表面包括測(cè)序流道或生物 芯片的基片，以及連接在檢測(cè)基片上的媒介物的表面。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于步驟A之 前還包括步驟： A0.對(duì)需要檢測(cè)的STR序列進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，將待測(cè)STR序列直接或是通過媒介物擴(kuò)增 并連接到檢測(cè)基片表面。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于，所述的媒 介物包括磁珠、微珠、微柱、微粒及微槽中的至少一個(gè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于，將海量樣 本的多個(gè)STR序列通過間隔區(qū)域編碼或者插入測(cè)序標(biāo)簽的方法，實(shí)現(xiàn)高通量地并行檢測(cè)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟A中 所述的一對(duì)引物分別位于STR序列核心區(qū)域的上游和下游，將檢測(cè)區(qū)域限定在STR核心區(qū) 域附近，減少反應(yīng)和檢測(cè)的輪次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟A中 所述的下游引物上修飾的熒光標(biāo)記位于下游引物5'端附近的堿基上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟B中 所述的核苷酸單體組合為常用脫氧核糖核苷三磷酸中的一種或幾種。
9. 一種高通量STR序列核心重復(fù)數(shù)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1 )樣本基因座STR序列的特異性擴(kuò)增 選取相應(yīng)數(shù)量的STR序列，作為檢測(cè)對(duì)象；通過多重PCR技術(shù)，將上述STR序列從人類 DNA樣本的相應(yīng)基因座上擴(kuò)增出來； 選取完待檢STR序列后，根據(jù)STR序列中核心重復(fù)單元的序列信息來設(shè)計(jì)聚合時(shí)的核 苷酸單體組合以及設(shè)計(jì)多組STR序列同時(shí)檢測(cè)的分組檢測(cè)方案，同時(shí)設(shè)計(jì)每種STR序列相 應(yīng)的上下游檢測(cè)引物并合成； (2) 檢測(cè)基片上STR序列的固定及文庫(kù)制備 檢測(cè)基片上的每一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)上僅有唯一樣本的同一種STR單鏈序列拷貝； 上述STR單鏈序列拷貝可以直接固定于基片的固相載體表面，或者通過微媒介物間接 地先將單鏈序列拷貝固定在媒介物的表面，再將媒介物固定于檢測(cè)基片的表面； (3) STR序列核心重復(fù)數(shù)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行前，讀取芯片上每個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)上的STR序列所屬的樣本信息以及基因座 信息； 加入混合后的上下游檢測(cè)引物進(jìn)行雜交，雜交完成后清洗并檢測(cè)熒光； 不斷重復(fù)進(jìn)行加入核苷酸單體組合聚合的操作，并在每次聚合完全后清洗及檢測(cè)熒 光，直至整張反應(yīng)基片上所有反應(yīng)位點(diǎn)的熒光降低到下限閾值以下后結(jié)束檢測(cè)； (4)熒光信號(hào)分析 根據(jù)檢測(cè)芯片上的每個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)在不同輪次下的熒光信號(hào)強(qiáng)度，找到熒光信號(hào)強(qiáng)度發(fā) 生衰減的反應(yīng)輪次，根據(jù)該輪次及核苷酸單體組合方式推導(dǎo)出該位點(diǎn)上STR序列的核心重 復(fù)數(shù)； 對(duì)熒光信號(hào)衰減率進(jìn)行分析，判斷該位點(diǎn)的STR序列是否為雜合并根據(jù)二次熒光衰減 得到另一條等位STR序列的核心重復(fù)數(shù)； 最終，通過對(duì)檢測(cè)芯片上海量位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到每個(gè)樣本的每條 STR序列的核心重復(fù)數(shù)及其純合比率。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104152568SQ201410410187
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】李俊吉, 陸祖宏, 涂景 申請(qǐng)人:東南大學(xué)