小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α（RORα）腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法，屬于疾病的基因治療領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的載體基因組小，含4.7～6kb之間的線狀單鏈DNA基因組，本發(fā)明采用降低腺病毒污染的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法以及不會破會AAV的肝素瓊脂糖純化法和利用AmiconUtra-15高效的濃縮作用包裝rAAV-RORα，且應(yīng)用于轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。該載體可感染分裂期及靜止期細(xì)胞，整合到宿主細(xì)胞基因組的特定區(qū)域，無致病性且免疫原性弱，可用于體內(nèi)試驗以及體外實驗，從而充分發(fā)揮AAV載體在基因治療中的作用，以及RORα于多種重要生理過程的調(diào)節(jié)作用。
【專利說明】小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α (R0R α )腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法，屬于疾病的基因治療領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]維甲酸相關(guān)孤核受體ct (retinoid acid receptor related orphan receptor,ROR a, NRIFI)，屬類固醇激素受體超家族成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與多種重要生理過程的調(diào)節(jié)，在形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、機體穩(wěn)態(tài)維持、生物代謝調(diào)控、高級神經(jīng)功能控制以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ROR a基因缺陷的模型小鼠，體內(nèi)出現(xiàn)了廣泛而嚴(yán)重的功能性障礙，尤其是容易發(fā)生自身免疫性疾病和過敏性疾病，或表現(xiàn)出明顯的免疫功能異常，如T和B細(xì)胞功能缺陷、巨噬細(xì)胞釋放致炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-a)等。RORa與免疫系統(tǒng)的密切關(guān)系還在多種動物模型的研究中得以證實，并被視為化學(xué)治療的潛在靶點。
[0003]基因治療的常用載體包括病毒載體和非病毒載體，非病毒載體轉(zhuǎn)染效率低、體內(nèi)表達(dá)不穩(wěn)定，包括脂質(zhì)體、多聚陽離子聚合物、納米粒、膠束、細(xì)菌質(zhì)粒等；病毒載體不僅有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，而且有實現(xiàn)外源基因穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢，故是目前基因治療中應(yīng)用最廣泛的載體類型。但因病毒載體有激活體內(nèi)原癌基因的可能性而存在安全隱患。逆轉(zhuǎn)錄病毒做為載體用于治療，也有引起死亡和誘發(fā)發(fā)白血病的報道，因此逐漸被淘汰。腺病毒載體表達(dá)外源基因時間短，免疫原性強，可引發(fā)機體產(chǎn)生強烈的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，不適于慢性免疫紊亂性疾病的治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述問題，本發(fā)明提供一種二型腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV2)載體，基因組小，含4.7飛kb之間的線狀單鏈DNA基因組，可感染分裂期及靜止期細(xì)胞，整合到宿主細(xì)胞基因組的特定區(qū)域，無致病性且免疫原性弱，是目前較為理想的基因治療載體。
[0005]本發(fā)明解決其上述問題所采用的技術(shù)方案如下:
1.小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體a (RORci )腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法，按照以下步驟進(jìn)行:
(I)克隆小鼠RORa基因(參考NCBI中提供的序列:ΝΜ_013646.2)，應(yīng)用PCR技術(shù)于小鼠的腦組織擴增出RORa mRNA的⑶S區(qū)，共1572bp，于⑶S區(qū)的上下游分別引入EcorI和XbaI酶切位點，將瓊脂糖凝膠電泳并膠回收后的RORa片段和PMD18T克隆載體(購自TARAKA)進(jìn)行T-A克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3 (購于上海邁其生物科技有限公司)并涂布于含有AMP的肉湯培養(yǎng)板進(jìn)行AMP抗性篩選，挑取陽性菌于液體培養(yǎng)菌增菌培養(yǎng)，提取菌液中的質(zhì)粒，PCR鑒定及測序正確后，該載體記為pMD18-T-R0R α克隆載體。
[0006](2)將pMD18-T_R0Ra以及PZAC2.1 (核心質(zhì)粒)(盤尼西亞大學(xué)贈送，本實驗室保存)進(jìn)行EcorI和XbalI雙酶切，再分別膠回收瓊脂糖凝膠后的PZAC2.1的載體片段和RORa片段，在T4DNA連接酶的作用下連接過夜，同樣轉(zhuǎn)化stbl3并涂布于含有AMP的肉湯培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，挑選陽性菌落，次日取菌液按照菌液與培養(yǎng)基比例為1:100接種于的肉湯增菌培養(yǎng)，提取菌液中的質(zhì)粒，PCR鑒定及測序正確后，該載體命名為PZAC2.1-RORa。
[0007]2.AAV2-R0RQ (小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒)的包裝，按照以下步驟進(jìn)行:
(1)首先制備各種質(zhì)粒:pZAC2.1-RORa、pAd_detaF6 (輔助質(zhì)粒)、p5E18 (包裝質(zhì)粒)(其中pAd-deltaF6和p5E18為盤尼西亞大學(xué)贈送，本實驗室保存)；
(2)復(fù)蘇并傳代HEK293細(xì)胞(購自ATCC)，采用磷酸鈣共沉淀的方法將pZAC2.1-R0R α、pAd_detaF6、p5E18 按一定比例(1:2:1)共轉(zhuǎn)染 70%_80% 匯合度的 HEK293細(xì)胞。
[0008](3)過夜更換新鮮完全培養(yǎng)液，48-72小時收獲細(xì)胞，其間于熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染的效率以及產(chǎn)毒的效果；收獲細(xì)胞，加DMEN重懸已含病毒的HEK293細(xì)胞，-80和_37°C反復(fù)凍融三次，加入40微升的Benzonase (250U/微升)，37°C 30min，去除非病毒核酸，以3000g常溫離心，收集的上清即為病毒粗制液。
[0009](4)加入10%D0C (脫氧膽酸),37°C孵育20min,先后經(jīng)過5 μ m和0.8 μ m的濾膜濾去細(xì)胞碎片，收集過濾液。
[0010]3.AAV2-R0R α的純化方法，按照以下步驟進(jìn)行:
(I)于用于純化的分離柱內(nèi)加入肝素瓊脂糖，用PBS分2次進(jìn)行平衡。而后加入步驟
(3)所得小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒的包裝濾液，調(diào)整流速為I滴/秒，直至濾液全部慮過瓊脂糖柱子，用洗脫液(0.1M NACL PBS)洗滌柱子，流速控制為I滴/秒，等洗脫液全部流過柱子，最后加入洗脫緩沖液(0.4Μ MACL PBS)，收集洗脫液，留作濃縮。
[0011](2)將離心過濾裝置放入離心管中，以滅菌的PBS漂洗濾器。將步驟(I)收集的純化后的洗脫液加入濾器，4°C、3000rpm離心5分鐘，根據(jù)流率再離心五分鐘，濃縮樣本至lmL。加入PBS進(jìn)行洗滌，離心混勻后收集于Eppendorf管中4°C保存。
[0012]4.AAV2-R0R α的滴度的測定，按照以下步驟進(jìn)行:
在離心管中依次加入病毒液10微升，1XDNaseI緩沖液10微升，40U無PNA酶的DNase I 4微升，無核酸酶的純Η2076微升，37°C孵育1，以去除未包裝成病毒而轉(zhuǎn)入細(xì)胞的質(zhì)粒的干擾而后立即煮沸五分鐘，使病毒衣殼裂解，立即冰浴備用。以純化的重組質(zhì)粒pZAC2.1-RORa為標(biāo)準(zhǔn)品DNA的模板，用純的H2010倍連續(xù)稀釋成101° -1O4水平，和rAAV2-R0R α (重組腺相關(guān)病毒載體)一起用熒光定量PCR檢測病毒的滴度。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明載體高度穩(wěn)定，易制備，可濃縮和純化，無毒性，有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長期表達(dá)；本研究應(yīng)用AAV2作為基因治療載體，AAV2進(jìn)入細(xì)胞的過程是由基礎(chǔ)受體(硫酸肝素蛋白多糖受體)和輔助受體[包括I型成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR-1)和整合素a νβ I整合素α 5β I]介導(dǎo)產(chǎn)生。AAV2載體對多種組織細(xì)胞(如表面具有硫酸肝素蛋白多糖受體的肌肉、視網(wǎng)膜、肝臟、神經(jīng)元細(xì)胞等)具有較好的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
[0014](2) AAV不能獨立復(fù)制，需在輔助病毒如腺病毒存在的條件下，才能在感染的宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制并合成蛋白，形成新的病毒顆粒。傳統(tǒng)包裝rAAV載體的方法為“雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染加輔助病毒(腺病毒)感染法”，即用重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染腺病毒感染的人胚腎293細(xì)胞。重組質(zhì)粒含有目的基因和兩端的ITR序列，輔助質(zhì)粒含有AAV的r印和cap基因，這種方法易被腺病毒污染。本研究為“三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法”，首先將小鼠RORa基因成功插入AAV2表達(dá)質(zhì)粒pZac2.1，形成重組質(zhì)粒Pzac2.1-RORa。其次是應(yīng)用腺病毒的E1A、E1B、E4、EZA以及VARNA基因片段所構(gòu)建的腺病毒輔助質(zhì)粒協(xié)P_deltaF6，代替輔助病毒感染，與重組質(zhì)粒Pzac2.1-T-bet和包裝質(zhì)粒p5E18 —起通過磷酸韓共沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,從而生成含目的基因RORci片段的重組腺相關(guān)病毒rAAV2-R0Ra，這種方法既減少了腺病毒污染，又簡化了 AAV2的包裝步驟。
[0015](3)本發(fā)明在病毒載體純化方法上，既往常用的氯化艷梯度密度離心法已被證明會破壞AAV2，由于硫酸乙酞肝素是AAV2的表面受體，因此，利用重力作用，通過肝素瓊脂糖親和層析法分離純化AAV2成為新方法，且在本研究中得到了成功應(yīng)用。純化的rAAV2病毒需要濃縮，因為rAAV2的滴度是影響靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的重要因素。Amicon Ultra-15離心過濾器為純化的rAAV2-R0Ra病毒液提供了簡單且快速的濃縮去鹽方法，病毒回收率大于95%,濃縮能力達(dá)到100倍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為RORa的PCR圖，圖中泳道I為Marker ;泳道2-3為為擴增出的RORa CDS
區(qū)片段。
[0017]圖2為pMD18T_R0Ra酶切圖，圖中泳道I為Marker，泳道2，4，5為雙酶切結(jié)果。 圖3為PZAC2.1-RORa酶切圖，圖中泳道I為Marker，泳道2_4為雙酶切結(jié)果。
[0018]圖4為病毒包裝過程中eGFP突光圖。
[0019]圖5為病毒感染小鼠Levis胃癌細(xì)胞圖,左圖為48h后的突光圖,右圖為3天后的熒光圖。

【具體實施方式】
[0020]以下通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述或作進(jìn)一步說明，其目的在于更好的理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)涵，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下的實施范圍。
[0021]實施例1:表達(dá)載體PZAC2.1-RORa的構(gòu)建
1.小鼠RORa基因的克隆及與pMD-18T克隆載體的連接。
[0022](I)應(yīng)用01igo6.0引物設(shè)計軟件，根據(jù)NCBI中小鼠RORa的cDNA序列(ΝΜ_013646.2)，和所要連接的表達(dá)載體pZAC2.1的酶切位點，設(shè)計擴增RORα全長基因的引物如下:
Pl (上游引物):5’ -GAATTCACATGGAGTCAGCTCCGGCAG -3’，于其 5’ 端引入 EcoRI 酶切位點；
P2 (下游引物):5’ -TCTAGAGCGCGACATTTACCCATCGATT-3’，于其 5’ 端引入 XbaI 酶切位點。
[0023](2)應(yīng)用RT-RCP (逆轉(zhuǎn)錄PCR)技術(shù)從小鼠的腦組織中擴增出小鼠RORa全長編碼基因。
[0024](3 ) PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1，圖中2和3為擴增出的ROR α⑶S區(qū)片段。切取含目的片段的凝膠，并采用promega公司的膠回收純化試劑盒，回收并純化PCR產(chǎn)物。
[0025](4)純化的產(chǎn)物與TAKARA公司的T載體進(jìn)行T-A克隆，16°C反應(yīng)一小時，而后轉(zhuǎn)化于本實驗室保存的大腸桿菌Stbl3并涂布于含有100 μ g/mL的AMP的肉湯培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，37°C培養(yǎng)16h。
[0026](5)挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到含100μ g/mL的AMP的6mL的肉湯培養(yǎng)基，37 °C(250rpm)培養(yǎng)12小時。
[0027](6)提取菌液質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見圖2，將鑒定正確的質(zhì)粒DNA送至上海生工測序，測序正確，并命名為pMD-18T_R0Ra。
[0028]2.AAV2系統(tǒng)的表達(dá)載體PZAC2.1-RORa的構(gòu)建
(I)將經(jīng)過測序驗證的pMD18T-R0Ra質(zhì)粒與AAV2系統(tǒng)的表達(dá)質(zhì)粒pZAC2.1 一同經(jīng)過EcoRI/Xbal 雙酶切，37°C，孵育 3h。
[0029](2)取50yL經(jīng)過1%瓊脂糖電泳，分別切取含目的片段以及pZAC2.1載體的凝膠，同樣按照以上方式純化目的片段和載體，應(yīng)用T4DNA連接酶連接，16°C連接過夜。
[0030](3)連接的產(chǎn)物同樣轉(zhuǎn)化于本實驗室保存的大腸桿菌Stbl3并涂布于含有100 μ g/mL的AMP的肉湯培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，37°C培養(yǎng)16h。
[0031](4)方法同前，液體增菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，酶切及測序鑒定，酶切結(jié)果見圖3，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為PZAC2.1-RORa。
[0032]實施例2: rAAV2-R0R α的包裝
(I)將本實驗室保存的HEK293細(xì)胞凍存管，于37°C中轉(zhuǎn)動至解凍，按照3x106接種入DMEM完全培養(yǎng)液的1cm培養(yǎng)皿20塊，待其生長密度為70%_80%，包裝前12h換新鮮培養(yǎng)液。
[0033](2)采用磷酸鈣共沉淀的方法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝病毒，其中，pZAC2.1-RORa和pAd-deltaF6、p5E18 3質(zhì)粒按照12.5:25:12.5 ( μ g)的含量及比例轉(zhuǎn)染每皿細(xì)胞，其中對照以帶有EGFP熒光基團的PZAC2.1-EGFP ((盤尼西亞大學(xué)贈送，本實驗室保存)代替PZAC2.1-RORa，同樣的條件包裝對照病毒。
[0034](3)配置轉(zhuǎn)染混合物:
A 液:59mL 滅菌純水,6.5 mL 2.5mol/L CaCL2, 1300 μ g pAd_deltaF6 質(zhì)粒，650 μ gpZAC2.1-RORa 和 650 μ g p5E18 質(zhì)粒。
[0035]B 液:2xHBS
將A液逐滴加入B液中，并迅速吹打，室溫放置20-30min。
[0036](4)于每只培養(yǎng)皿加入2.5ML轉(zhuǎn)染混合物，第二天更換新鮮DMEN完全培養(yǎng)液，第四天收獲細(xì)胞。
[0037](5)收獲的細(xì)胞置于_80°C和37°C反復(fù)凍融三次，加入40 μ L Benzonase (250U/μ L),混勻，37°C孵育30min,去除非病毒核酸,3000g常溫1min離心,收集上清,此為病毒粗制液，即可用于體外實驗。
[0038](6)加入10%的脫氧膽酸1.5mL，孵育，先后經(jīng)過5 μ m和0.8 μ m的濾膜濾去細(xì)胞碎片,收集過濾液。
[0039]三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞包裝rAAV2，病毒包裝過程中eGFP熒光結(jié)果見圖4。
[0040]實施例3:rAAV2_R0Ra的的純化 (I)于用于純化的分離柱內(nèi)加入肝素瓊脂糖4mL，用PBS分2次進(jìn)行平衡。而后加入包裝后的濾液，調(diào)整流速為I滴/秒，直至濾液全部慮過瓊脂糖柱子。
[0041](2)用洗脫液(0.1M NACL PBS)洗滌柱子，流速控制為I滴/秒，等洗脫液全部流過柱子，最后加入洗脫緩沖液(0.4M MACL PBS),收集洗脫液，留作濃縮。
[0042](3)將Milipore Amicon Utra-15 10k離心過濾裝置放入離心管中，以滅菌的PBS漂洗濾器。將收集的純化后的洗脫液加入濾器，離心5分鐘，根據(jù)流率在再離心五分鐘，濃縮樣本。加入PBS進(jìn)行洗滌，按上訴步驟離心，混勻后收集于Eppendorf管中4°C保存。
[0043]實施例4:rAAV2_R0Ra的滴度的測定
(I)在Eppendorf管中依次加入病毒液10 μ L，10 X DNaseI緩沖液10 μ L，無RNA酶的DNase I 4 μ L，無核酸酶的純水76 μ L，37°C孵育lh，以去除未包裝成病毒而轉(zhuǎn)入細(xì)胞的質(zhì)粒的干擾。
[0044](2)立即煮沸五分鐘，使病毒衣殼裂解，立即冰浴備用。
[0045]以純化的重組質(zhì)粒pZAC2.1-R0R α為標(biāo)準(zhǔn)品DNA的模板，用純水10倍連續(xù)稀釋成101° --1O4水平，和純化前后的rAAV2-R0Ra —起用熒光定量PCR檢測病毒的滴度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其滴度。
[0046]實施例5:rAAV2-R0R α轉(zhuǎn)染小鼠肺癌細(xì)胞系(購自ATCC)
(O應(yīng)用轉(zhuǎn)染的濃度應(yīng)該為104_5 V.g/細(xì)胞，而我們的純化前的rAAV2-R0Ra，滴度為19 V.g/mL,故于培養(yǎng)的小鼠肺癌細(xì)胞加入200 μ L的未純化的rAAV2_R0R a，對照加入rAAV2-EGFP0
[0047](2)轉(zhuǎn)染后48h看到熒光的表達(dá)，而第3天熒光較強，結(jié)果見圖5。
[0048](3)收獲轉(zhuǎn)染了 rAAV2_R0Ra的細(xì)胞，提取RNA，RT-QPCR檢測其ROR a mRNA的表達(dá)，含量明顯高于對照，約10倍。
【權(quán)利要求】
1.一種小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，所述載體為pZAC2.1-ROR α，該載體含有小鼠基因ROR a mRNA的CDS區(qū)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，所述載體基因組小，能感染分裂期及靜止期細(xì)胞，整合到宿主細(xì)胞基因組的特定區(qū)域，無致病性且免疫原性弱。
3.一種小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行: Cl)克隆小鼠RORa基因，應(yīng)用PCR技術(shù)于小鼠的腦組織擴增出RORa mRNA的⑶S區(qū)，于CDS區(qū)的上下游分別引入EcorI和XbaI酶切位點，將瓊脂糖凝膠電泳并膠回收后的RORa片段和PMD18T克隆載體進(jìn)行T-A克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3并涂布于含有AMP的肉湯培養(yǎng)板進(jìn)行AMP抗性篩選,挑取陽性菌于液體培養(yǎng)菌增菌培養(yǎng),提取菌液中的質(zhì)粒，PCR鑒定及測序正確后，該載體記為pMD18-T_R0Ra克隆載體； (2)將pMD18-T-R0R α以及PZAC2.1核心質(zhì)粒進(jìn)行EcorI和XbalI雙酶切，再分別膠回收瓊脂糖凝膠后的PZAC2.1的載體片段和ROR α片段，在T4DNA連接酶的作用下連接過夜，同樣轉(zhuǎn)化stbl3并涂布于含有AMP的肉湯培養(yǎng)板進(jìn)行篩選,挑選陽性菌落,次日取菌液按照菌液與培養(yǎng)基比例為1:100接種于的肉湯增菌培養(yǎng)，提取菌液中的質(zhì)粒，PCR鑒定及測序正確后，該載體命名為PZAC2.1-RORa。
4.一種小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒的包裝方法，其特征在于，采用三質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，其中所述的三質(zhì)粒分別為pZAC2.1-RORa、pAd_detaF6、p5E18。
5.一種小鼠維甲酸相關(guān)的孤核受體α腺相關(guān)病毒的純化方法，其特征在于，采用肝素瓊脂糖親和層析法分離純化rAAV。
【文檔編號】C12N15/66GK104232686SQ201410411105
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】吳玉敏, 許化溪, 蘇兆亮, 王勝軍, 應(yīng)欣宇, 楊慧建, 別慶麗 申請人:江蘇大學(xué)