編碼pcv2檢測用的orf2抗原功能區(qū)的基因片段及其表達方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了編碼PCV2檢測用的ORF2抗原功能區(qū)的基因片段，具有序列表SEQ?ID?NO：1所示的DNA序列。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還公開了上述基因片段的表達方法?；诒景l(fā)明公開的基因片段所表達的蛋白序列可有效用于PCV2的檢測，具有快速、敏感的且能將PCV1和PCV2兩種血清型病毒感染有效區(qū)分。
【專利說明】編碼PCV2檢測用的0RF2抗原功能區(qū)的基因片段及其表達方法
[0001]本申請是申請日為2010年7月24日，申請?zhí)枮?01010241352.8，名稱為一種基于0RF2抗原功能區(qū)的檢測豬圓環(huán)病的方法的發(fā)明專利申請的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及畜牧獸醫(yī)科學(xué)技術(shù)，特別是一種可用于PCV2檢測的能夠編碼相關(guān)蛋白的基因片段及其表達方法。

【背景技術(shù)】
[0003]豬斷奶后衰竭綜合癥(PMWS)主要病原體，已被世界各國學(xué)者確認為圓環(huán)病毒(PCV-2、PCV2)，另外PCV2與許多豬相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)。除PMWS之外，PDNS (豬皮炎與腎炎綜合癥)、PNP(增生性壞死性肺炎)、PRDC(豬呼吸道綜合癥)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV-2感染有重要關(guān)聯(lián)。豬感染PCV-2后，于5~12周齡時發(fā)生PMWS，發(fā)病率為5%~30%，死亡率可達10%~30%。該病已經(jīng)被世界公認為是豬的重要傳染病且會對全球的豬肉制品進出口業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。
[0004]迄今還沒有控制和消滅PMWS的有效措施，也缺乏有效的疫苗來預(yù)防PMWS，因此在加緊開展基礎(chǔ)研究工作的同時，盡快建立快速有效的診斷檢測方法是防控該病流行最必須的措施。目前實驗室檢測豬圓環(huán)病毒最常用的方法是免疫過氧化物酶單層實驗(IPMA)和間接免疫熒光實驗(IFA)。但這些方法的實驗操作費時費力，而且在準備感染細胞過程中有散毒的危險，特別是這些診斷方法為保證做出正確判斷需要有經(jīng)驗的研究人員。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開了編碼PCV2檢測用的0RF2抗原功能區(qū)的基因片段及其表達方法，由該基因片段編碼表達的蛋白可作為抗原能夠快速、敏感地檢測PCV2感染抗體，且能將PCVl和PCV2兩種血清型病毒感染區(qū)分開。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]編碼PCV2檢測用的0RF2抗原功能區(qū)的基因片段，具有序列表SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
[0008]上述基因片段可編碼產(chǎn)生0RF2上的氨基酸區(qū)段113_147aa，具體的說，是通過如下表達方法實現(xiàn)的:1)利用引物擴增基因片段，并將克隆得到的目的基因片段用BamH I和Xho I雙酶切；2)將雙酶切后的基因片段用T4DNA連接酶連接到pGEX_4T_l載體，獲得重組質(zhì)粒；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株中誘導(dǎo)表達。
[0009]其中，所用引物具有序列表SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的DNA序列(0RF2-EF、0RF2-ER)。
[0010]為了便于雙酶切，在引物中特異設(shè)計了對應(yīng)的酶切位點(在0RF2-EF中酶切位點為GGATTC，在0RF2-ER中酶切位點為CTCGAG)。
[0011]進一步的，本發(fā)明還公開了上述表達產(chǎn)物的純化方法，采用谷胱甘肽親和層析柱層析法，具體步驟為:用IXPBS懸浮細菌沉淀并超聲處理1min(power3, on30sec ；off30sec),離心取上清，與經(jīng)IXPBS平衡的Glutath1ne Sepharosw4B在室溫振蕩混合30min，將混合物轉(zhuǎn)移至層析柱中，用IXPBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫融合蛋白。

【具體實施方式】
[0012]實施例1.引物的設(shè)計和目的基因的PCR擴增
[0013]本發(fā)明中選擇0RF2上的該氨基酸區(qū)段(113-147)作為目的抗原進行克隆表達，其基因片段全長102bp。以PCV20RF2全基因為模板，設(shè)計兩條特異引物，通過PCR擴增技術(shù)獲得位于0RF2蛋白序列上113-147aa特異抗原區(qū)段的基因片段。
[0014]PCR 反應(yīng)體系為:10 X PCR buffer5 μ 1，pfu DNA Pol ymerase0.25 μ I (5U/ μ 1)，dNTPly l(10mmol/L)，模板 0.5μ 1，上下游引物個 0.5μ l(10ymol/L)，雙蒸水補足 50μ I。
[0015]擴增條件為:94°C預(yù)變性2min，然后94°C 20s，60°C 20s, 72°C 30s，30個循環(huán)，最后72°C 延伸 8min。
[0016]引物序列如下 ，如下劃線所示在引物中分別引入BamH I和Xho I酶切位點:
[0017]0RF2-EF:5，-GC GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3，；
[0018]0RF2-ER:5’ -GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3’。
[0019]目的基因序列:CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC TCC AGT GCT GTT ATT CTAGAT GATAAC TTT GTA ACA MG GCC ACA GCC CTC ACC TAT GAC CCC TAT GTA AAC TAC TCC TCC CGCTAA。
[0020]實施例2.重組載體的構(gòu)建和目的基因的誘導(dǎo)表達及純化
[0021]凝膠回收純化所擴增的基因片段，用BamH I和Xho I雙酶切所純化的基因片段和pGEX-4T-l載體，再次凝膠純化經(jīng)雙酶切的基因片段和載體，然后用T4DNA快速連接酶連接，連接體系為:10Xli gase bufferl μ 1，酶切純化的目的基因片段5 μ 1，載體pGEX-4T-lly 1，T4DNA快速連接酶1μ 1，雙蒸水補足10 μ 1，室溫連接15min。
[0022]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，鋪LB平板于37°C培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落PCR鑒定，并測序確證，陽性重組質(zhì)粒命名為PGEX/0RF2-E。將重組質(zhì)粒pGEX/0RF2-E轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中誘導(dǎo)表達。
[0023]誘導(dǎo)表達的條件為:在含100μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒PGEX/0RF2-E的大腸桿菌BL21 (DE3)，直至菌液的0D600值介于0.6-0.8，加入IPTG至終濃度0.1mM,繼續(xù)培養(yǎng)3小時，離心收集細菌沉淀。
[0024]GST-0RF2-E融合蛋白應(yīng)用谷胱甘肽親和層析柱進行純化，具體步驟為:
[0025]用I XPBS懸浮細菌沉淀并超聲處理1min (超聲10s，間歇10s)，離心取上清，與經(jīng)IXPBS平衡的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutath1ne Sepharosw4B)在室溫振蕩混合30min，將混合物轉(zhuǎn)移至層析柱中，用IXPBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫融合蛋白。SDS-PAGE和Western-blotting結(jié)果顯示,融合蛋白的大小約29KDa。在超聲并離心之后的菌液上清和沉淀中都有融合蛋白存在，在上清液中融合蛋白GST-0RF2-E的量要比在沉淀中的多，這說明表達的融合蛋白GST-0RF2-E大部分是可溶的，這有利于蛋白純化并最大可能的保證了蛋白的自然活性。用GST單抗做的Western-blotting也進一步證實融合蛋白GST-0RF2-E在細菌中正確表達。
[0026]實施例3:融合蛋白GST-0RF2-E的抗原性檢測
[0027]用抗PCV2豬血清作為一抗進行western-blotting,結(jié)果顯示陽性血清有顯著的特異條帶而陰性血清無條帶出現(xiàn)。同樣，純化后的蛋白在western-blotting中，可以用抗GST的單抗和豬血清檢測到。
[0028]本發(fā)明得到的表達產(chǎn)物可用于通過任何已知的方法進行PCV2抗體的檢測，包括但不限于:
[0029]3.1、ELISA 操作步驟
[0030](I)包被:用包被液(0.05M碳酸鈉緩沖液，ρΗ9.6)稀釋GST-0RF2-E融合蛋白至工作濃度，加入96孔酶標板(Nunc Maxisorp),每孔100 μ 1,4°C包被過夜。PBST清洗兩遍,拍干。
[0031](2)封閉:每孔加入100 U I封閉液(含0.1 % Tween20和5 % (w/v)脫脂奶粉的PBS)，37°C封閉l h。PBST洗兩遍，拍干。
[0032](3)與一抗(待檢血清)結(jié)合:將待檢血清、陽性血清和陰性豬血清分別用稀釋液(含0.1% Tween20和1% (w/v)脫脂奶粉的PBS)稀釋后加于已封閉的孔板中，每孔加入100μ 1，于37°C孵育lh，PBST清洗三遍，拍干。
[0033](4)與二抗(HRP-1gG)結(jié)合:用I %脫脂牛奶的PBST將HRP標記的二抗(Dako)稀釋至工作濃度，每孔100 μ I加于96孔酶標板中，37°C孵育lh。PBST洗三遍，拍干。
[0034](5)顯色:每孔加入50 μ I鹽酸鄰苯二胺快速顯色液(FASTo-phenylenediaminedihydrochloride, OPD, Sigma)，于 37°C孵育 15min。
[0035](6)終止:每孔加入50 μ I終止液(2Μ H2S04)，檢測490nm光密度(0D490)。
[0036]抗原的工作濃度用棋盤滴定法進行確定。具體方法為:取96孔酶標板2塊，將純化的重組抗原用0.05M碳酸鈉緩沖液(pH9.6)做1: 10、I: 20、I: 140至1: 1280的稀釋，從左向右依次加入第1-8列，每個稀釋度8個重復(fù)，每孔100 μ 1，4°C包被過夜。PBST洗兩遍，拍干。
[0037]每孔加入100μ I含5%脫脂奶奶的PBST，37°C封閉lh。PBST洗兩遍，拍干。將標準陽性血清、標準陰性血清用含1% (w/v)脫脂奶粉的PBS做1: 10、1: 20,1: 140至I: 1280的稀釋，從上至下分別加入到A-H的微孔中，每個稀釋度8個重復(fù)，每孔100μ1，于37°C孵育lh，PBST清洗三遍，拍干。
[0038]每孔加50 μ I鹽酸鄰苯二胺快速顯色液(FAST 0-phenyIenediaminedihydrochloride, OPD, Sigma)，于 37 °C 孵育 15min,最后每孔加入 50 μ I 終止液(2ΜH2S04)，檢測490nm光密度(0D490)。最終確定的抗原最佳濃度為0.5 μ g/ml，實驗血清的稀釋度確定為1: 100。
[0039]以這一抗原濃度用同樣的棋盤滴定法確定HRP標記抗豬IgG的稀釋度為I: 3000。為了確定GST標簽是否影響GST-0RF2-E ELISA的結(jié)果，本發(fā)明分別用純化的GST和GST-0RF2-E包被96孔板，并對已知的10份陽性和10份陰性血清檢測其0D490。統(tǒng)計學(xué)分析(兩樣品配對T檢驗)顯示以GST-0RF2-E為抗原檢測的陽性血清的平均0D490值顯著大于用GST作為抗原的檢測結(jié)果(P < 0.01)，而以GST-0RF2-E為抗原檢測的陽性血清和陰性血清的平均0D490值之間也有顯著差異(0.01 < P < 0.05)。同時，用GST作為抗原檢測的陽性血清和陰性血清的平均0D490沒有顯著差異(P > 0.05).
[0040]3.2、間接免疫熒光(IFA)
[0041]在感染前一天，將10(^1濃度為5父10知6118/1111的PK-15細胞以加入96孔板，24小時后，將MOI為0.1的PCV2接種于96孔板的第1、3、5和第7排，第2、4、6和8排分別設(shè)為陰性對照。細胞在感染后4-6小時期間用溶于Hank’ s液的300mM D-glucosamine37°C處理20-30min，隨后繼續(xù)于37°C 5% C02培養(yǎng)箱中孵育72h.細胞用4% PFA(多聚甲醛)室溫固定30min并用PBST (PBS pH7.4containing0.1 % Tween-20)清洗兩遍.細胞隨后用0.1% Triton X-100于室溫處理lOmin。PBST清洗后加入1: 50倍稀釋(包含5% FBS的PBST)的豬血清37°C孵育lh.PBST清洗三次后.加入用包含5% FBS的PBST倍稀釋的FITC標記的兔抗豬免疫球蛋白(I: 100，Dako)，37°C孵育lh，PBST清洗兩遍后直接于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。
[0042]3.3、陰陽性臨界值的確定
[0043]陰陽性臨界值由GST-0RF2-E ELISA的25個陰性血清的OD值平均值和25個陽性血清的OD值平均值決定。每一次實驗的陰陽性極限用Microsoft Excel軟件計算得到。確定實驗的臨界值是為了實驗的敏感性(DSn)和實驗的特異性(DSp)最大化，假陰性和假陽性的總數(shù)最小化。陰性血清的0D490值從0.068到0.209，其平均OD值為0.12466。以此獲得了合適的臨界OD值為0.224313 (mean±3SD)并說明99%的陰性血清的OD值低于
0.22，以此設(shè)定陽性的最低限為0.22.
[0044]3.4、實驗重復(fù)性的確定
[0045]選擇10份陽性血清和10份陰性血清用于重復(fù)性實驗的確定。對于批內(nèi)重復(fù)性(板內(nèi)重復(fù))每一血清樣品的三次重復(fù)加于同一多孔板中。對于批間重復(fù)性(不同實驗板)，每一血清樣品的三次重復(fù)在不同次加于不同板。計算出每次實驗中三次重復(fù)的平均OD值、標準差(SD)和變異系數(shù)(CV)。試驗結(jié)果顯示實驗是可重復(fù)的。10份陽性血清樣品的批內(nèi)CV范圍為0.12-14.87 %，中間值為2.34 %，陰性血清樣品的批內(nèi)CV范圍為0.46-6.45 %，其中間值為2.17 %.陽性血清的批間CV從11.26-37.04 %，中間值為19.03%，而陰性血清的CV從10.16到38.26%，中間值為31.74%。
[0046]3.5、實驗特異性和敏感性的確定
[0047]實驗敏感性(DSn)特異性(DSp)用以下公式計算:DSn = TP/ (TP+FN) X 100 (TP是真陽性、FN是假陰性)；DSp = TN/ (TP+TN) X 100 (TN是真陰性、FP假陽性)。精確性是(TP+TN)/被檢血清總數(shù)X100。PCV2GST-0RF2-E ELISA的結(jié)果由288份血清樣品獲得。通過比較ELISA與IFA的結(jié)果，說明ELISA的準確性和敏感性比IFA的高。在IFA的結(jié)果中陰性血清和陽性血清分別為8和280 ;而ELISA的結(jié)果中陰性血清和陽性血清分別為25和263。
[0048]特異性=100X(ELISA 陰性數(shù))/(IFA 總陰性數(shù))=100X7/8 = 87.7%
[0049]敏感性=100X(ELISA 陽性數(shù))/(IFA 總陽性數(shù))=100X262/280 = 93.57%。
[0050]符合率為2.43%+90.97%= 93.4%。
[0051]結(jié)論:ELISA和IFA的相關(guān)性
[0052]16份PCV2感染豬血清的ELISA結(jié)果(0D值)與用PCV2感染細胞檢測的IFA結(jié)果進行比較。相應(yīng)的血清在IFA中從1: 50到1: 51，200進行系列稀釋。IFA中的血清滴度和ELISA OD值之間的相關(guān)性由Spearman’s相關(guān)系數(shù)表示。結(jié)果顯示，IFA滴度的對數(shù)值與GST-0RF2-E ELISA 的 OD 值之間存在線性關(guān)系 spearman，s rank correlat1n = 0.9665 ；P < 0.0001，IFA 滴度的回歸方程式=1.21339*Α490+3.41189 (r2 = 0.7897，P < 0.001。這說明GST-0RF2-E ELISA的OD值可用于估計IFA滴度。
[0053] 在上述基礎(chǔ)上，用所建立的ELISA方法鑒別PCVl和PCV2感染的動物，用該方法檢測46份血清，包括實驗感染PCVl和PCV2的動物血清和健康動物血清。結(jié)果99%的的PCV2感染動物血清為陽性，97%的PCVl感染動物血清為陰性，100%的健康動物血清為陰性。說明本發(fā)明可以鑒別PCVl和PCV2感染的動物。
【權(quán)利要求】
1.編碼PCV2檢測用的0RF2抗原功能區(qū)的基因片段，具有序列表SEQID N0:1所示的DNA序列。
2.權(quán)利要求1的基因片段的表達方法，包括如下步驟:1)利用引物擴增基因片段，并將克隆得到的目的基因片段BamH I和Xho I雙酶切；2)將雙酶切后的基因片段用T4DNA連接酶連接到PGEX-4T-1載體，獲得重組質(zhì)粒；3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中誘導(dǎo)表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的表達方法，其特征在于所用引物具有序列表SEQID N0:2、SEQ IDNO:3所不的DNA序列。
【文檔編號】C12N15/34GK104178499SQ201410413777
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2010年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2010年7月24日
【發(fā)明者】郭慧琛, 孫世琪, 劉湘濤, 尹雙輝, 尚佑軍, 殷宏, 才學(xué)鵬 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所