一種miRNA檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及miR-148、miR-22、miR-185和miR-221聯(lián)合使用在診斷食管癌中的應用；miR-148在預測食管癌腫瘤大小變化中的應用；miR-148、miR-185和miR-22聯(lián)合使用在預測食管癌腫瘤轉移中的應用；miR-221或miR-148中的一種或兩種在預測食管癌患者生存率中的應用；miR-148、miR-22、miR-185、miR-221和miR-39聯(lián)合使用在制備食道癌miRNA檢測試劑盒中的應用，其中miR-39作為內參；以及相應的檢測試劑盒。本發(fā)明的miRNA檢測試劑盒檢測快速方便、準確率高，可以實現(xiàn)食管癌早期診斷及療效預測。
【專利說明】—種m i RNA檢測試劑盒及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種miRNA的檢測產(chǎn)品以及miR-148、miR-22、miR-185或miR-221在食管癌早期診斷及療效預測中的應用，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，發(fā)病率甚至位居世界第一，每年平均病死約15萬人。一旦臨床診斷，往往已處于中晚期，5年生存率低于20% ;而早期食管癌手術后5年生存率可達70%~90%。因此，早期診斷和提前預防是食管癌的重點研究方向?，F(xiàn)今，臨床診斷已由傳統(tǒng)地依賴于病理診斷方式轉為更大程度上依據(jù)分子檢測結果，分子檢測更成為早期臨床診斷的必要檢測手段；從基因水平尋找特定的分子標記物，對標志物進行準確快速檢測已成為腫瘤早期防治的重要手段之一。越來越多的證據(jù)顯示，miCToRNA (miRNA)的表達異常參與了食管癌的發(fā)生和發(fā)展，可作為一種新型的分子標記物。
[0003]microRNA廣泛存在于動植物和病毒中，是一類長度約為20~24個核苷酸的非編碼的單鏈RNA分子，通過miRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式負調控靶基因，參與多種生物學信號通路的調節(jié)。研究表明，miRNA與腫瘤的診斷、分期、預后等密切相關。miRNA被發(fā)現(xiàn)可獨立存在于細胞之外，而不被血液中內源性的RNA降解酶(endogenous RNase)所破壞,故血中腫瘤特異性miRNA可作為疾病的診斷標志物。另外在腫瘤放射治療領域，在基礎和臨床研究中均顯示某些miRNA可反映腫瘤放射治療敏感性，并與腫瘤乏氧密切相關。分析血液中食管癌特異miRNA的表達，篩選出特異性強、靈敏度高、可作為特定腫瘤分子標志物的miRNA，這種利用miRNA分子標記進行疾病診斷、預測疾病發(fā)生及預后的非侵入式檢測方式為建立食管癌早期篩查及療效預測等體系及開發(fā)相關產(chǎn)品提供了契機。
[0004]鑒于miRNAs在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移的過程中的重要作用，在食管癌的診斷、治療和預后等研究領域miRNA也越來越引起重視。Guo Y等研究51例食管鱗癌組織miRNA 的表達發(fā)現(xiàn)，miR-25、miR-424 和 miR-151 表達上調，miR-100, miR-99a, miR-29c 及miR-140則表達下調，這些表達異常的miRNA能夠準確區(qū)分食管鱗癌和正常組織(參見外文文獻 Guo Y, Chen ZL, Zhang L et al.Distinctive microRNA profiles relating topatient survival in esophageal _3_ squamous cell carcinoma.Cancer Res, 2008，68(1): 26-33.)Akagi I等的研究表明miR-21和miR-205在食管鱗癌組織中高表達(參見外文文獻 Akagi I，Miyashita Mj Ishibashi O et al.Relat1nship between alteredexpress1n levels of MIR21，MIR143，MIR145，and MIR205 and cl inicopathologicfeatures of esophageal squamous cell carcinoma.2011，24(27)，523-30)。Kurashige等檢測了 71例食管鱗癌患者血清中miRNA變化，顯示miR-21在所有食管鱗癌樣本中高表達(參見外文文獻 Kurashige Jj Kamohara H，Watanabe Mj et al.Serum microRNA-21is a novel b1marker in patients with esophageal squamous cell carcinoma.J SurgOncol, 2012，106(2): 188-192)。
[0005]如何將上述這些食管癌基礎研究領域的成果迅速應用于臨床，需要精確核準檢測的最有效分子標記物，并建立快捷簡便的應用體系，引導相關產(chǎn)品開發(fā)。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種檢測快速方便、準確率高，可以實現(xiàn)食管癌早期診斷及療效預測的miRNA檢測試劑盒，以及提供miR-148、miR-22、miR-185或miR-221中的一種或多種在食管癌早期診斷及療效預測中的應用。
[0007]本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是:miR-148、miR_22、miR-185、miR-221和miR-39聯(lián)合使用在制備食道癌miRNA檢測試劑盒中的應用，其中miR-39作為內參。
[0008]基于上述應用本發(fā)明提出的具體技術方案是:一種miRNA檢測試劑盒，其檢測體系包括反轉錄反應體系、RCR反應體系和內參體系,所述RCR反應體系中包含分別針對miR-148、miR-22、miR-185、miR-221的正向引物和反向通用引物；所述內參體系包括內參miRNA-39和針對miR-39的正向引物；針對所述miR-148的正向引物的核苷酸序列如SEQID N0.1所示；針對所述miR-22的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；針對所述miR-185的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；針對所述miR-221的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；針對所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0009]用于配制所述RCR反應體系的試劑包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和純水；用于配制所述反轉錄反應體系的試劑包括多聚腺苷酸聚合酶、反轉錄酶混合液、反轉錄緩沖液和無核酸酶純水。
[0010]上述RCR反應體系的總體積為?ομL ;其中，所述SYBR Green混合液的體積是5μ1，所述正向引物液的體積是?μL，所述反向通用引物液的體積是?μL，所述DNA模板?μL，其余是純水；所述正向引物液的使用濃度為2μΜ，所述反向通用引物液的使用濃度為2μΜ ;所述DNA模板是所述反轉錄反應體系反應后的產(chǎn)物稀釋五倍獲得的。
[0011]上述反轉錄反應體系的總體積為12.5μ1 ;其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的體積是5μ1,所述反轉錄酶混合液的體積是5μ1,所述反轉錄緩沖液的體積是2.5μ1,所述miRNA樣品的加入量是20ng，其余是無核酸酶純水；所述多聚腺苷酸聚合酶的使用濃度為2.5υ/μ1 ；所述miRNA樣品中含有內參miRNA-39。
[0012]上述內參miRNA-39是在抽提miRNA樣品過程中加入的體積是2 μL的內參miRNA-39液，其使用濃度為0.2μΜ。
[0013]本發(fā)明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是:miR-148、miR-22、miR-185和miR-221聯(lián)合使用在診斷食管癌中的應用。
[0014]判斷公式為:Y1=9.270XAmiK_185-0.665XBmiK_221-1.078XCmiK_148-0.082XDmiK_22-29.771。
[0015]其中AmiK_185是放療前miR-185的表達量(2_ΛΛετ值)，BmiE_221是放療前miR-221的表達量(2_6^1值)，0^_148是放療前miR-148的表達量(2_ΛΛετ值)，DmiK_22是放療前miR-22的表達量(2^^值)。
[0016]當Y1值>0.5時，則判斷為食管癌患者。
[0017] 本發(fā)明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是:miR_148在預測食管癌腫瘤大小變化中的應用。
[0018]判斷公式為:Y2=放療后miR-148的表達量(2_^°7值)-放療前miR-148的表達量(2_δμτ 值)。
[0019]當Υ2>-4.4850時，判斷為療效較好；否則，判斷為療效不佳。
[0020]本發(fā)明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是:miR-148、miR-185和miR-22聯(lián)合使用在預測食管癌腫瘤轉移中的應用。
[0021]判斷公式(回歸方程)為:Y3=0.05AmiE_185+0.09CmiE_148+0.02DmiK_22_3.122。
[0022]其中AmiK_185是放療前miR-185的表達量(2_ΛΛσ值)，CmiK_148是放療前miR-148的表達量(2_ΔΔ CT值)，DmiE_22是放療前miR-22的表達量(2_ΔΔ CT值)。
[0023]當Y3X).4409時，判斷為腫瘤轉移發(fā)生率高；否則，判斷為腫瘤轉移發(fā)生率低。
[0024]本發(fā)明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是:miR_221或miR-148中的一種或兩種在預測食管癌患者生存率中的應用。
[0025]判斷公式為:
Y4=放療前miR-148的表達量(2_ΛΛετ值)-放療后miR-148的表達量(2_ΛΛετ值)。
[0026]Y5=放療前miR-221的表達量(2_6夂7值)-放療后miR-221的表達量(2_6夂7值)。
[0027]通過ROC曲線分析，當Y4〈4.25或Y5〈_2.37時，判斷為食管癌患者放療后生存率較高；否則，生存率較低。
[0028]本發(fā)明具有積極的效果:
(I) miR-148、miR-22、miR-185和miR-221作為獨立或組合分子標記物，經(jīng)過大數(shù)據(jù)臨床驗證實驗，首次應用于上述miRNA檢測試劑盒的開發(fā)，實現(xiàn)了 I) miR-148、miR-22、miR-185和miR-221作為組合分子標志物在早期診斷食管癌中的應用；2) miR-148作為獨立分子標記物在預測食管癌放療療效(腫瘤大小變化)中的應用；3) miR-148、miR-22和miR-185作為組合分子標志物在預測食管癌轉移發(fā)生率中的應用；4)miR-148或miR-221在預測食管癌患者生存率中的應用。
[0029](2)本發(fā)明的miRNA檢測試劑盒選擇了特異性強、靈敏度高的miR-148、miR-22、miR-185和miR-221這四個miRNA標記物進行組合，開發(fā)成檢測試劑盒，檢測快速方便、準確率高、一個試劑盒實現(xiàn)四方面的應用，滿足不同腫瘤病人的檢測需求，應用范圍極廣，經(jīng)臨床驗證預測準確率高。
[0030](3)本發(fā)明的miRNA檢測試劑盒針對血清中作為定量反應的內參,不同樣本中差異很大的因素，特別引入穩(wěn)定的外源RNA序列miR-39(來源于線蟲)作為內參對照RNA，并優(yōu)化設計了針對miR-39的內參正向引物，極大提高了進行miRNA檢測時相對定量的準確度。
[0031](4)本發(fā)明的試劑盒運用實時熒光定量PCR方法，研究血清中食管癌患者和正常對照組的miRNA表達水平的變化，miR-148、miR-22、miR-185和miR-221均高表達可以很好地預測食管癌的發(fā)生，進行輔助診斷；miR-148放療前后表達量的變化可預測腫瘤大小的變化，評估食管癌放療療效；miR-148、miR-185和miR-22放療前的表達量可以用于預測食管癌腫瘤轉移的發(fā)生率;miR-221或miR-148放療前的表達量可以預測食管癌患者的生存率。本發(fā)明的miRNA檢測試劑盒通過檢測miR-148、miR-22、miR-185和miR-221的表達量，使得食管癌的早期診斷及療效預測變得可行。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是采用本發(fā)明的試劑盒檢測出的放療前腫瘤病人四種miRNA的平均表達量圖表;
圖2是采用本發(fā)明的試劑盒檢測出的放療前后腫瘤病人miR-148的表達量與放療療效相關性的圖表；
圖3是采用本發(fā)明的試劑盒檢測出的放療前腫瘤病人四種miRNA的表達量與腫瘤轉移相關性的圖表；
圖4是采用本發(fā)明的試劑盒檢測出的放療前腫瘤病人miR-148的表達量與病人生存率相關性的圖表；
圖5是采用本發(fā)明的試劑盒檢測出的放療前腫瘤病人miR-221的表達量與病人生存率相關性的圖表； 圖6是采用本發(fā)明的試劑盒檢測出的放療前后腫瘤病人miR-148的表達量與病人生存率相關性的圖表；
圖7是采用本發(fā)明的試劑盒檢測出的放療前后腫瘤病人miR-221的表達量與病人生存率相關性的圖表。

【具體實施方式】
[0033]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術人員可以根據(jù)上述本
【發(fā)明內容】
對本發(fā)明作出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。
[0034]實施例1
一、試劑盒的組成。
[0035]本實施例的miRNA檢測試劑盒，包括用于配制反轉錄反應體系的試劑、用于配制PCR體系的試劑和內參體系。
[0036]1、內參體系:
內參體系的試劑包括內參miRNA-39液和針對miR-39的正向引物液。
[0037]內參miRNA-39 液為現(xiàn)蟲 cel-miR-39 (Access1n Number:AJ487564)溶液，為英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，封裝在一個小瓶中，配制的濃度為20μΜ，共10μ1，使用濃度為0.2μΜ。
[0038]針對miR-39的正向引物液封裝在一個小瓶中，體積是100μΙ，使用濃度為2μΜ。
[0039]2、反轉錄反應體系:
用于配制反轉錄反應體系的試劑包括多聚腺苷酸聚合酶(polyA polymerase,供應商:GeneCopoeia,商品號:Cat#A02030B)、反轉錄酶混合液(RTase Mix,供應商:GeneCopoeia,商品號:Cat#C02020B)、反轉錄緩沖液(5XPAP/RT buffer,供應商:GeneCopoeia,商品號:Cat#C02022B)和無核酸酶純水(RNase and DNase free H2O,供應商:GeneCopoeia,商品號:Cat#C10230A)。用于配制反轉錄反應體系的試劑逐瓶封裝，使用時按一定的比例配置成反轉錄反應體系，反轉錄反應體系為12.5μ1/次,封裝的體積是100次的用量,如表1所示。
[0040]表1反轉錄反應體系組分表

【權利要求】
1.miR-148、miR-22、miR-185和miR-221聯(lián)合使用在診斷食管癌中的應用。
2.miR-148在預測食管癌腫瘤大小變化中的應用。
3.miR-148、miR-185和miR-22聯(lián)合使用在預測食管癌腫瘤轉移中的應用。
4.miR-221或miR-148中的一種或兩種在預測食管癌患者生存率中的應用。
5.miR-148,miR-22,miR-185,miR-221 和 miR-39 聯(lián)合使用在制備食道癌 miRNA 檢測試劑盒中的應用，其中miR-39作為內參。
6.如權利要求5所述應用的miRNA檢測試劑盒，其檢測體系包括反轉錄反應體系、RCR反應體系和內參體系，其特征在于:所述RCR反應體系中包含分別針對miR-148、miR-22、miR-185、miR-221的正向引物和反向通用引物；所述內參體系包括內參miRNA_39和針對miR-39的正向引物；針對所述miR-148的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；針對所述miR-22的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；針對所述miR-185的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；針對所述miR-221的正向引物的核苷酸序列如SEQID N0.4所示；針對所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
7.根據(jù)權利要求6所述的miRNA檢測試劑盒，其特征在于:用于配制所述RCR反應體系的試劑包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和純水；用于配制所述反轉錄反應體系的試劑包括多聚腺苷酸聚合酶、反轉錄酶混合液、反轉錄緩沖液和無核酸酶純水。
8.根據(jù)權利要求7所述的miRNA檢測試劑盒，其特征在于:所述RCR反應體系的總體積為ΙΟμΙ ;其中，所述SYBR Green混合液的體積是5μ1，所述正向引物液的體積是?μL，所述反向通用引物液的體積是?μL，所述DNA模板?μL，其余是純水；所述正向引物液的使用濃度為2μΜ，所述反向通用引物液的使用濃度為2μΜ ;所述DNA模板是所述反轉錄反應體系反應后的產(chǎn)物稀釋五倍獲得的。
9.根據(jù)權利要求7所述的miRNA檢測試劑盒，其特征在于:所述反轉錄反應體系的總體積為12.5μ1 ;其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的體積是5μ1，所述反轉錄酶混合液的體積是5μ1,所述反轉錄緩沖液的體積是2.5μ1,所述miRNA樣品的加入量是20ng,其余是無核酸酶純水；所述多聚腺苷酸聚合酶的使用濃度為2.5υ/μ1 ;所述miRNA樣品中含有內參miRNA-39。
10.根據(jù)權利要求7所述的miRNA檢測試劑盒，其特征在于:所述內參miRNA-39是在抽提miRNA樣品過程中加入的體積是2 μL的內參miRNA-39液，其使用濃度為0.2μΜ。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131113SQ201410417907
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權日:2014年8月22日
【發(fā)明者】趙新泰, 王明, 呂慧鋒 申請人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司