一種枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?ZK1-18，保藏編號CGMCC?No.9402。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌ZK1-18菌株源于土壤，該菌株生態(tài)安全，無腐蝕，對人畜動(dòng)植物無害，該菌株是以有機(jī)磷源篩選出來的優(yōu)勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變有機(jī)磷的性質(zhì)，使有機(jī)磷的組分發(fā)生變化，起到解磷作用。本發(fā)明的菌株為后續(xù)研制具有降解土壤有機(jī)磷功效的生物有機(jī)肥提供高效、穩(wěn)定的菌種及基礎(chǔ)資料。
【專利說明】一種枯草芽孢桿菌

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種枯草芽孢桿菌。

【背景技術(shù)】
[0002] 磷元素是植物生長的一種主要營養(yǎng)元素，在土壤中主要以難溶的礦物形態(tài)存在， 導(dǎo)致植物對土壤中的磷元素利用率很低，影響植物的生長。我國對解磷菌的研究起步于20 世紀(jì)50年代，解磷菌能將植物難以吸收利用的難溶性或不溶性磷轉(zhuǎn)化為可利用的形態(tài)，提 高土壤中磷素的利用效率，減少化學(xué)肥料的施用，降低農(nóng)業(yè)投入成本，因此對土壤環(huán)境進(jìn)行 微生物修復(fù)，是提高作物產(chǎn)量，解決土壤速效磷缺乏的重要途徑之一。然而，現(xiàn)在我國對解 磷菌的研究主要集中于溶解無機(jī)磷菌株的篩選，對于土壤難溶性有機(jī)磷解磷菌的研究卻鮮 有報(bào)道。有機(jī)磷是土壤磷的重要組成部分，一般占土壤全磷的20%?50%。土壤的微生物 修復(fù)技術(shù)，近十幾年來在國外得到了較大發(fā)展，但是土壤有機(jī)磷降解速度緩慢，致使治理過 程延續(xù)時(shí)間較長，一直是這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)突出難點(diǎn)，因此尋找高效有機(jī)磷降解菌，將土壤中 植物難以吸收利用的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，是當(dāng)前磷污染土壤微生物修復(fù)技術(shù) 的研究熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種枯草芽孢桿 菌。該菌株源于土壤，生態(tài)安全，無腐蝕，對人畜動(dòng)植物無害，該菌株是以有機(jī)磷源篩選出來 的優(yōu)勢菌株，菌株在生長繁殖過程中可改變有機(jī)磷的性質(zhì)，使有機(jī)磷的組分發(fā)生變化，起到 解磷作用。該菌株為后續(xù)研制具有降解土壤有機(jī)磷功效的生物有機(jī)肥提供高效、穩(wěn)定的菌 種及基礎(chǔ)資料。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種枯草芽孢桿菌，其特征在 于，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis ZK1-18,保藏編號CGMCC No. 9402,保藏日為 2014年6月30日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0005] 1、該菌株具有如下的性質(zhì)：
[0006] 形態(tài)特征：桿狀，大?。?. 5?0. 8) μ mX (1. 8?2. 2) μ m，芽孢中生或近中生。菌 落圓形，白色、表面干燥有褶皺、無光澤、不透明，邊緣不光滑。
[0007] 生理生化特征：革蘭氏陽性細(xì)菌。
[0008] 2、該菌株的篩選方法為：
[0009] 步驟一、富集：從西安市雁塔區(qū)西安文理學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院無花果園土壤表層以 下5cm?10cm采集土樣100g左右，將采得的土樣放入紙袋中帶回實(shí)驗(yàn)室分離。以無菌方 式稱取土樣10. 〇g放入含有100. OmL富集培養(yǎng)基（已滅菌）的250mL的三角瓶中，于30°C， 140r/min恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)5d ;然后吸取5mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新鮮的富集培養(yǎng)基中，再 進(jìn)行3次富集培養(yǎng)，每次5d ;所述富集培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖3. 506g，蛋白胨0. 83g，酵母 膏0. 5g，磷酸二氫鉀0. 35g，碳酸鈣0. 25g，卵磷脂0. 02g，蒸餾水lOOOmL，培養(yǎng)基pH值6. 8? 7. 1，105KPa 滅菌 20min ?25min ;
[0010] 步驟二、篩選和純化：將步驟一中3次富集培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)液按十倍稀釋法稀 釋，取10_ 3、10_4、10_5、10_6、10_7 5個(gè)稀釋度的培養(yǎng)液各0. lmL涂布于有機(jī)磷固體平板培養(yǎng)基 中，每個(gè)稀釋度涂布3塊平板，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d，能產(chǎn)生溶磷圈（透明圈）的 菌株即為解磷細(xì)菌，將溶磷圈較大的菌株在有機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行多次劃線純化， 以純化得到形態(tài)一致的純化菌株，然后將純化菌株轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)培養(yǎng)基斜面上，于28°C培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)2d，置于4°C冰箱中保存待用；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖3. 506g，蛋白 胨0. 83g，酵母膏0. 5g，磷酸二氫鉀0. 35g，碳酸|丐0. 25g，瓊脂16g?20g，蒸饋水1000mL ;所 述有機(jī)磷固體平板培養(yǎng)基的組成為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，卵黃液60mL，培養(yǎng)基pH值自然；有機(jī)磷固 體平板培養(yǎng)基的制法：將l〇〇〇mL滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻到50°C以下，立即加入60mL新 鮮配制的卵黃液后移入平板；卵黃液制備：以酒精擦凈雞蛋外殼，用解剖刀切破雞蛋兩端， 流去卵清后將卵黃流入已滅菌的錐形瓶中，約加等量無菌生理鹽水搖勻；
[0011] 步驟三、復(fù)篩：將步驟二中保存的菌株活化后得到菌懸液，將菌懸液滴加到有機(jī)磷 固體平板培養(yǎng)基中，以1 μ L無菌水為對照，重復(fù)3次，28°C條件下培養(yǎng)5d，用直尺測量溶磷 圈直徑（D)和菌落直徑（d)，并根據(jù)是否產(chǎn)生溶磷圈以及D/d值的大小來初步確定菌株的 解磷能力（D/d值越大解磷能力越好）；然后將解磷能力好的菌株接種于50mL蒙金娜有機(jī) 磷液體培養(yǎng)基中，以等體積的無菌水為對照，重復(fù)3次，搖床培養(yǎng)（28°C、120r/min)7d后， 8000r/min離心15min，取上清液5mL，進(jìn)行超聲波破碎細(xì)菌細(xì)胞（200W，20min)，使之釋放出 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的有效磷，用鑰銻抗比色法測定PCV 4含量，保存PCV4含量最高的菌株，命名為 ZK1-18 ;所述的蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基的制備方法為：向1000mL滅菌后的蒙金娜培養(yǎng)基 中加入0. 2g用無水乙醇溶解的經(jīng)過濾和滅菌的卵磷脂，其中蒙金娜培養(yǎng)基的組成為：葡萄 糖 10g，（NH4)2S04 0· 5g，MgS04 · 7H20 0· 3g，NaClO. 3g，KC1 0· 3g，F(xiàn)eS04 0· 03g，MnS04 · H20 〇· 〇3g，蒸饋水 1000mL，105KPa 滅菌 20min ?25min。
[0012] 3、該菌株的鑒定方法為：
[0013] (1)形態(tài)學(xué)鑒定：將篩選出來的菌株ZK1-18在瓊脂平板上培養(yǎng)，觀察細(xì)菌菌落生 長特征，注意其形狀、大小、顏色、透明度、邊緣特征等，并作記錄；同時(shí)用接種環(huán)挑取單菌落 進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，記錄結(jié)果。
[0014] 結(jié)果：ZK1-18菌株呈桿狀，大?。?. 5?0. 8) μ mX (1. 8?2. 2) μ m，芽孢中生或近 中生。菌落圓形，白色、表面干燥有褶皺、無光澤、不透明，邊緣不光滑，革蘭氏染色呈陽性。
[0015] (2)生理生化鑒定：生理生化實(shí)驗(yàn)按照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（第九版）方法進(jìn)行， 結(jié)果見下表。
[0016] 表1 ZK1-18菌株的生理生化特征
[0017]

【權(quán)利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis ZK1-18， 保藏編號 CGMCC No. 9402。
【文檔編號】C12R1/125GK104195078SQ201410417922
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】趙詠梅 申請人:西安文理學(xué)院