一種用于檢測(cè)耳聾基因突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)耳聾基因突變的試劑盒，該試劑盒中包括特異性引物、PCR混合液及酶切反應(yīng)混合液等，其中發(fā)明人針對(duì)耳聾基因?qū)ｉT(mén)設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的特異性引物，利用該試劑盒可以快速的檢測(cè)出患者體內(nèi)WFS1基因c.2389的G到A突變位點(diǎn)，從而更好的在全國(guó)范圍內(nèi)特別是欠發(fā)達(dá)地區(qū)進(jìn)行耳聾相關(guān)基因突變的大規(guī)模篩查和預(yù)防性檢查，且檢測(cè)成本低，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確率高。
【專利說(shuō)明】-種用于檢測(cè)耳聾基因突變的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)耳聾基因突變的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 聽(tīng)覺(jué)障礙是指聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中的傳音、感音以及對(duì)聲音的綜合分析的各級(jí)神經(jīng)中樞發(fā) 生器質(zhì)性或功能性異常，而導(dǎo)致聽(tīng)力出現(xiàn)不同程度的減退，習(xí)慣稱為耳聾。耳聾不僅影響個(gè) 人的生活質(zhì)量，而且給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)估計(jì)全球高達(dá)2. 78億人有聽(tīng)力障 礙，中國(guó)約有2780萬(wàn)患者，占全球患者的10%左右。導(dǎo)致聽(tīng)力損失的病因很多，如年齡增 長(zhǎng)，噪聲暴露，使用耳毒性藥物及基因改變等。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳學(xué)作用在聽(tīng)力障礙形成的機(jī) 制中發(fā)揮著重要作用。在過(guò)去的20年里，遺傳性耳聾基因的定位和識(shí)別方面取得了巨大的 進(jìn)步。到目前為止，針對(duì)非綜合征型耳聾共有133個(gè)基因座（55顯性和78隱性）和77個(gè) 基因（30個(gè)顯性和47個(gè)隱性）已被確定，但其致病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，同時(shí)，還有大量與 遺傳性耳聾相關(guān)的基因未被發(fā)現(xiàn)。
[0003] WFSl基因最早是由Stroml等人在1998年發(fā)現(xiàn)的，由于它是Wolfram綜合征的致 病基因，故被命名為wolframin基因（WFSl)。WFSl基因的純合或復(fù)合雜合突變均可導(dǎo)致常 隱遺傳的Wolfram綜合征，Wolfram綜合征又稱為糖尿病一視神經(jīng)萎縮一聽(tīng)力減退一尿崩 癥綜合征，其主要癥狀為糖尿病、視神經(jīng)萎縮、耳聾及尿崩癥，主要累及中高頻率聽(tīng)力受損。 它病變的特點(diǎn)是神經(jīng)進(jìn)行性退變，以軸突膨脹為特征的軸突營(yíng)養(yǎng)不良。研究發(fā)現(xiàn)，WFSl基 因的雜合突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳非綜合征性低頻耳聾，目前已確定28個(gè)與之相關(guān) 的突變位點(diǎn)。
[0004] WFSl基因定位于人的染色體4pl6上，含33. 4kb個(gè)堿基，包括8個(gè)外顯子，其編碼 的蛋白是Wolframin蛋白，含有890個(gè)氨基酸，分子量約為lOOKDa，包含10個(gè)跨膜區(qū)域，中 間為疏水區(qū)域（氨基酸330?650)，N端有一個(gè)親水的部分位于細(xì)胞質(zhì)外，C端部分位于細(xì) 胞質(zhì)內(nèi)。該蛋白是完整的內(nèi)糖苷酶H敏感的膜糖蛋白，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，可以誘發(fā)位于 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的離子通道活動(dòng)，引起細(xì)胞內(nèi)Ca 2+濃度增加，Wolframin蛋白功能失?？梢砸鸺?xì) 胞功能狀態(tài)異常，甚至死亡。
[0005] 到目前為止，針對(duì)現(xiàn)有已知位點(diǎn)，檢測(cè)突變位點(diǎn)的方法有直接測(cè)序法，熒光定量 PCR法，基因芯片法等，其中直接測(cè)序法是鑒定突變的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但該操作繁瑣，費(fèi)用昂貴限 制了它的廣泛應(yīng)用。因此急需一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的基因突變檢測(cè)方法，來(lái)滿足臨床 上對(duì)聾病患者WFSl基因突變篩查工作的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人正是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的研究情況，首先從WFSl基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè) 新突變位點(diǎn)c. 2389的G到A的突變，并確定其為WFSl基因新突變位點(diǎn)，一般帶有該突變的 患者均患有重度到極重度非綜合征性全頻聾，基于這一發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人進(jìn)一步設(shè)計(jì)了特異性 引物及應(yīng)用該引物的試劑盒，利用該試劑盒可以快速的檢測(cè)出患者體內(nèi)WFSl基因c. 2389 的G到A突變位點(diǎn)，從而更好的在全國(guó)范圍內(nèi)特別是欠發(fā)達(dá)地區(qū)進(jìn)行耳聾相關(guān)基因突變的 大規(guī)模篩查和預(yù)防性檢查，且檢測(cè)成本低，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確率高。
[0007] 發(fā)明人首先對(duì)我國(guó)一個(gè)患有耳聾的中國(guó)家系進(jìn)行了研究，這個(gè)家系有六代共117 位成員，其中患病的有26位，他們患有重度到極重度非綜合征性全頻聾，發(fā)明人對(duì)耳聾患 者進(jìn)行了外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了 WFSl基因上的一個(gè)新突變位點(diǎn)c. 2389的G到A的突變位點(diǎn)， 并且通過(guò)酶切技術(shù)對(duì)20名家系成員及200例正常對(duì)照進(jìn)行此突變點(diǎn)的排查，發(fā)現(xiàn)被采集的 13位患者均有WFSl基因c. 2389G到A的雜合突變，家系中7位正常者及200例正常對(duì)照均 不攜帶此突變，同時(shí)我們對(duì)含有WFSl基因c. 2389位點(diǎn)的片段進(jìn)行了桑格測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 酶切結(jié)果完全吻合；進(jìn)一步驗(yàn)證了該突變位點(diǎn)的存在以及其致病性。
[0008] 在確定了上述突變位點(diǎn)之后，發(fā)明人進(jìn)一步的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了檢測(cè)耳聾相關(guān)基因 WFSlc. 2389的G到A的位點(diǎn)突變的試劑盒，本試劑盒主要包括以下幾部分：特異性引物， PCR混合液，酶切混合液，限制性內(nèi)切酶，陽(yáng)性對(duì)照樣本及陰性對(duì)照樣本；
[0009] 其中特異性引物包括正向引物F: 5' -AAGTTTGAGATTACCGTGGGC-3'，其核苷酸序列 如 SEQID NO. 1 所示；反向引物 R:5' -CGACAGGAATGGGAAGAAAA-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2所示；
[0010] PCR 混合液包括 10XPCR buffer、2. 5mM dNTP、Taq 酶；
[0011] 酶切混合液為 10XNEB Buffer ;
[0012] 限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶Aatll，此限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別5' GACGT/C3' 序列；
[0013] 陽(yáng)性對(duì)照樣本是含有WFSl基因c. 2389的G到A的雜合突變不能發(fā)生酶切的DNA 片段；
[0014] 陰性對(duì)照樣本是不含此突變位點(diǎn)能發(fā)生酶切的DNA片段；
[0015] 發(fā)明人同時(shí)提供了利用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的具體步驟如下：
[0016] 1.基因組DNA的提?。豪矛F(xiàn)有技術(shù)從血液、毛發(fā)等樣本中提取的基因組DNA，均 可用此試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)WFSl基因c. 2389的G到A的突變位點(diǎn)的檢測(cè)；
[0017] 2.目的片段的擴(kuò)增：利用試劑盒中特異性引物擴(kuò)增含有WFSl基因c. 2389位點(diǎn)的 DNA片段，這段PCR產(chǎn)物長(zhǎng)345bp，其中未突變的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示， 突變后的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0018] 3.將上述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶AatII進(jìn)行酶切；
[0019] 4.酶切產(chǎn)物的鑒定：利用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過(guò)酶切產(chǎn)物的大小判斷突 變位點(diǎn)的有無(wú)。
[0020] 采用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)耳聾相關(guān)基因WFSlc. 2389的G到A的突變時(shí)，結(jié) 合特異性PCR技術(shù)和酶切技術(shù)，每份DNA樣本分別用特異性引物于PCR反應(yīng)管中進(jìn)行普通 PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行突變位點(diǎn)處的酶切，通過(guò)一次PCR便可在幾小時(shí)內(nèi)檢出耳聾相關(guān)基因 WFSlc. 2389的G到A的突變，而且雜合突變或者純合突變也可一目了然，其主要判定標(biāo)準(zhǔn) 為，對(duì)于雜合突變中只有一條發(fā)生突變的基因，故此在利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行酶切時(shí)會(huì) 產(chǎn)生345bp、74bp和271bp的三條帶；而對(duì)于純合突變而言，由于兩條基因均發(fā)生了突變，故 此在利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行酶切時(shí)會(huì)產(chǎn)生345bp這一條條帶；而對(duì)于沒(méi)有發(fā)生突變的情 況，則在利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行酶切時(shí)會(huì)產(chǎn)生74bp和271bp兩條條帶；這樣就可以進(jìn)行 清楚的判定了；同時(shí)，陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照使檢測(cè)加過(guò)更加準(zhǔn)確、可信。
[0021] 用本發(fā)明所開(kāi)發(fā)試劑盒具有以下的優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 1.對(duì)待檢樣本沒(méi)有苛刻要求：患者的血液、組織、毛發(fā)等用自制試劑或者試劑盒 提取的基因組DNA均可用此試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，使檢測(cè)更易進(jìn)行；
[0023] 2.目前檢測(cè)突變位點(diǎn)的方法有熒光定量PCR法，基因芯片檢測(cè)法，直接測(cè)序法等， 這些檢測(cè)方法操作繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用偏高不易在臨床進(jìn)行推廣。與這些方法相比較，本發(fā)明試 劑盒中PCR-酶切技術(shù)則結(jié)合了特異性PCR技術(shù)及酶切技術(shù)兩者的優(yōu)點(diǎn)，每份DNA樣本用特 異性引物即引物F/R于PCR反應(yīng)管中進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，通過(guò)一次PCR-酶切便可在幾小 時(shí)內(nèi)同時(shí)檢出基因WFSlc. 2389的G到A的突變情況；另外值得一提的是，本方法所用的引 物均經(jīng)過(guò)仔細(xì)設(shè)計(jì)，首先，正常和突變等位基因間不同的堿基在酶切過(guò)程中對(duì)特異性限制 性內(nèi)切酶形成的位點(diǎn)不同，因而大大提高了酶切的特異性；另外由正常對(duì)照和空白對(duì)照的 產(chǎn)物可作為整個(gè)PCR反應(yīng)的分子內(nèi)控指標(biāo)，從而避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提高檢測(cè)結(jié)果的 穩(wěn)定性。通過(guò)調(diào)整不同引物的濃度和比例以及對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確保結(jié)果的特 異性和穩(wěn)定性。
[0024] 3.應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行耳聾相關(guān)基因WFSlc. 2389的G到A突變檢測(cè)，與 其他檢測(cè)方法相比，成本低，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果判讀直觀，準(zhǔn)確率高，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及操作人員無(wú) 特殊要求，適合在一般醫(yī)院、分子生物實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，有臨床應(yīng)用價(jià)值，便于在全國(guó)范圍內(nèi)特 別是欠發(fā)達(dá)地區(qū)進(jìn)行耳聾相關(guān)基因WFSlc. 2389的G到A的突變大規(guī)模篩查和預(yù)防性檢查。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為酶切鑒定WFSl基因c. 2389位點(diǎn)突變情況的凝膠電泳圖；
[0026] 圖中ni-9、III-15、in-20、IV-21、IV-43、V -4、v -7、v -10、v -12 是患者 PCR 產(chǎn)物經(jīng)酶切后的條帶，有345bp、74bp和271bp的三條帶，說(shuō)明WFSl基因c. 2389處發(fā)生了 雜合突變；
[0027] III-16、III-18、IV _7是家系中未患病的成員PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后的條帶，有74bp和 271bp的兩條帶，說(shuō)明WFSl基因c. 2389處沒(méi)有發(fā)生突變；
[0028] control樣本PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后有74bp和27Ibp的兩條帶；
[0029] 未加酶進(jìn)行酶切的樣品（undigested)只有一條345bp的條帶；
[0030] 圖2WFS1基因c. 2389測(cè)序峰部分截圖；
[0031] 圖中IV _8在WFSl基因c. 2389處出現(xiàn)了雜峰，說(shuō)明WFSl基因c. 2389發(fā)生了雜合 突變，
[0032] IV _7及control峰圖顯示W(wǎng)FSl基因c. 2389處未發(fā)生突變。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明 作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0034] 實(shí)施例1基因組DNA的提取
[0035] 1)將2ml血樣加入5ml Buffer API,劇烈混勻；
[0036] 2)加入 Iml Buffer AP2,立即混勻，4630g 離心 15min ;
[0037] 3)上清轉(zhuǎn)移至中量制備管中，開(kāi)啟負(fù)壓，保持負(fù)壓，加入7ml Buffer Wl，8ml Buffer
[0038] W2, 4ml Buffer W2 ；
[0039] 4)卸下中量管管頭12000g離心2min ;
[0040] 5)加入 0? 4ml Elution buffer，室溫靜置 5min，12000g 離心 2min，_20°C保存?zhèn)?用。
[0041] 實(shí)施例2 PCR擴(kuò)增目的片段
[0042] 利用試劑盒內(nèi)的特異性引物
[0043] 上游引物：5' -AAGITTGAGATTACCGTGGGC-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示；
[0044] 下游引物：5' -CGACAGGAATGGGAAGAAAA-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示；
[0045] 目的產(chǎn)物長(zhǎng)345bp ;
[0046] 按照如下體系及程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)耳聾基因突變的試劑盒，主要包括：特異性引物，PCR混合液，酶切混 合液，限制性內(nèi)切酶，陽(yáng)性對(duì)照樣本及陰性對(duì)照樣本；其特征在于： 其中特異性引物包括正向引物F: 5' -AAGTTTGAGATTACCGTGGGC-3'，其核苷酸序列如SEQ 10勵(lì).1所示；反向引物1?:5'-〇64046644了6664464444-3'，其核苷酸序列如5￡〇10勵(lì).2所 示； 限制性內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶Aatll，此限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別5' GACGT/C3'序列； 陽(yáng)性對(duì)照樣本是含有WFSl基因c. 2389的G到A的雜合突變不能發(fā)生酶切的DNA片 段； 陰性對(duì)照樣本是不含此突變位點(diǎn)能發(fā)生酶切的DNA片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的PCR混合液包括IOXPCR buffer、2. 5mM dNTP、Taq 酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的酶切混合液為10XNEB Buffer。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104212892SQ201410419224
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】王海波, 白曉卉, 李建峰, 樊兆民, 呂懷慶, 張鳳國(guó), 徐磊 申請(qǐng)人:山東省立醫(yī)院集團(tuán)眼耳鼻喉醫(yī)院