單端孢霉烯族毒素生物降解劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種飼料單端孢霉烯族毒素生物降解劑,所述單端孢霉烯族毒素包括但不限于雪腐鐮孢菌烯醇、疣孢菌素、脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇。本發(fā)明首次從自然資源中分離篩選到一株安全、高效的降解飼料單端孢霉烯族毒素的德沃斯氏菌(Devosia sp.)ANSB714，并研究了該菌的生物學(xué)特性和降解毒素的特性。本發(fā)明還提供了該菌的培養(yǎng)方法，利用該菌制備生物降解劑的方法，以及生物降解劑用于降解飼料中單端孢霉烯族毒素的方法。ANSB714與霉變飼料反應(yīng)24小時后，對飼料中單端孢霉烯族毒素的降解率可達98％。本發(fā)明的德沃斯氏菌ANSB714降解單端孢霉烯族毒素的活性高、特異性強、作用效果溫和，不會破壞飼料中的營養(yǎng)成分，同時提高飼料利用率，確保了畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)并提高了經(jīng)濟效益。
CGMCC No. 9428
2014.07.08
【專利說明】單端孢霉烯族毒素生物降解劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物學(xué)領(lǐng)域和飼料添加劑領(lǐng)域，具體地說，涉及單端孢霉烯族毒素 生物降解劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 單端孢霉烯族毒素對谷物的污染給人和家畜的健康造成巨大威脅。此類毒素主要 由鐮孢菌、頭孢霉、漆斑菌、葡萄穗霉、木霉及其它霉菌產(chǎn)生，包括近150種化合物，可分成 四個亞類，其中A類和B類最為重要。A類單端孢霉烯包括：T-2毒素、HT-2毒素、撫孢菌素 〇61'；101031'；[11，\^1?)、鐮孢菌酸（1160801311；[01，呢0)和雙乙酸基薦草烯醇（043) ;13類單端孢 霉烯包括：脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇（DON)及其3-乙?；?5-乙酰基衍生物、雪腐鐮孢菌烯 醇（NIV)和鐮孢菌烯酮-X(Fusarenon-X，F(xiàn)X)。不同的鐮孢霉所產(chǎn)生的單端孢霉烯類霉菌 毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，因此可以根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同將其進行區(qū)分。A類單端孢霉烯主要由 擬枝鐮孢菌（F. sporotrichioides)和梨孢鐮孢菌（F. poae)產(chǎn)生，而B類單端孢霉烯則主 要由黃色鐮孢菌（F. culmorum)和禾谷鐮孢菌（F. graminearum)產(chǎn)生。單端孢霉烯的基本 化學(xué)結(jié)構(gòu)是倍半萜烯，因其在C-12、C-13位上形成環(huán)氧基，故又稱12、13-環(huán)氧單端孢霉烯 族化合物。
[0003] 單端孢霉毒素族的靶器官是肝臟和腎臟，且大都屬于組織刺激因子和致炎物質(zhì)， 因而可直接損傷消化道黏膜。畜禽中毒后的臨床癥狀一般表現(xiàn)為食欲減退或廢絕，胃腸炎 癥和出血，嘔吐，腹瀉，壞死性皮炎，運動失調(diào)，血凝不良，貧血和白細胞數(shù)量減少，免疫機能 降低，降低生產(chǎn)性能，流產(chǎn)等。百奧明2012年全球霉菌毒素調(diào)查報告顯示，在全部樣品中， 黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、煙曲霉毒素和赭曲霉毒素 A的陽性率分別為25%、 46%、64%、56%和31%。與2011年的數(shù)據(jù)相比，鐮刀霉菌毒素（玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、 煙曲霉毒素）的發(fā)生率增高。調(diào)查顯示，嘔吐毒素是小麥中最為常見的霉菌毒素，在被測樣 品中陽性檢出率為70%。
[0004] 單端孢霉烯族毒素對畜牧業(yè)及人類產(chǎn)生如此嚴(yán)重的危害，因此自上個世紀(jì)單端孢 霉烯族毒素被發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)工作者便不斷地研究該類毒素的預(yù)防和解毒、去毒方法。迄今 為止已知的去除飼料中單端孢霉烯族毒素的方法有物理、化學(xué)和生物學(xué)法。物理、化學(xué)脫毒 方法，在實際應(yīng)用中對于目前飼料業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)而言均不適用。因其操作困難，且大批量的 飼料及原料用此類方法無法進行，而且經(jīng)化學(xué)脫毒處理后往往會降低飼料的營養(yǎng)品質(zhì)和適 口性，目前還沒有切實有效的防止飼料霉菌毒素污染的方法。微生物或生物酶因其反應(yīng)的 準(zhǔn)確性、有效性和環(huán)保性成為人們關(guān)注的熱點。目前，能有效轉(zhuǎn)化單端孢霉烯族毒素的微生 物不多，它們主要來源于動物胃腸道、土壤、植物等自然環(huán)境中。
[0005] King等（1984)首次報道了牛瘤胃液可降解嘔吐毒素，相同的代謝物被發(fā)現(xiàn)在鼠 (Yoshizawa等，1983)和奶牛（Co te等，1986)的尿液和糞便中。V0丨k丨等在1285份來自 農(nóng)場土壤、糧谷、昆蟲和其它來源的微生物培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)一種混合微生物能將DON轉(zhuǎn)化成 3-酮-DON。Shima等在含有礦物鹽類的培養(yǎng)基中，以DON作為唯一的富集方法，從土壤樣品 中分離得到土壤桿菌屬一根瘤菌屬菌株E3-39,在有氧條件下，該菌株將可降解DON。He等 用以DON作為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基，從土壤中分離得到一株塔賓曲霉NJA-1，經(jīng)過兩周 的孵化，該菌株能轉(zhuǎn)化94. 4%的DON。
[0006] 盡管一些實驗證實了動物腸道微生物能夠降解單端孢霉烯族毒素，但目前為止， 能夠利用這些微生物生產(chǎn)制備能夠切實有效地去除飼料中單端孢霉烯族毒素的生物降解 劑幾乎沒有，因此，尋找新的高效降解飼料中單端孢霉烯族毒素的菌株，優(yōu)化并生產(chǎn)出高效 降解單端孢霉烯族毒素的生物降解劑對于提高飼料利用率，確保畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)和經(jīng)濟 效益的提高具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種單端孢霉烯族毒素生物降解劑及其制備方法。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明一株能夠高效降解單端孢霉烯族毒素的德沃斯氏菌 (Devosia sp. )ANSB714,該菌從土壤中篩選出，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵 編100101，保藏日期2014年7月8日，保藏號CGMCC No. 9428。所述單端孢霉烯族毒素包 括但不限于雪腐鐮孢菌烯醇、疣孢菌素、脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇。
[0009] 所述德沃斯氏菌ANSB714的培養(yǎng)方法為：取活菌濃度為4. 5 X 109CFU/mL的 ANSB714種子液0. 5-5. OmL (優(yōu)選lmL)，接種于50-100mL (優(yōu)選50mL)的培養(yǎng)基中進行搖瓶 發(fā)酵培養(yǎng)。
[0010] 其中，所述培養(yǎng)基包括如下組分：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏2-5g、氯化鈉8-12g和 水800-1200mL，pH值6. 0-9. 0。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包括如下組分：胰蛋白胨10g、酵母浸膏 5g、氯化鈉10g和蒸餾水1000mL，pH值7. 0。
[0011] 搖瓶發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度16-37°c，發(fā)酵時間20-26h，轉(zhuǎn)速100-200r/min。優(yōu)選 地，搖瓶發(fā)酵條件為：26. 5°C，轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵24h，發(fā)酵過程中控制pH值7. 0。
[0012] 然后，進行發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：將上述經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的種子液按0.5-5%接種量 接種于玉米漿培養(yǎng)基中，于16-37°C，轉(zhuǎn)速100_200r/min，發(fā)酵20-26h，發(fā)酵過程中控制pH 值6. 0-9.0。其中，所述玉米漿培養(yǎng)基為30-50g/L玉米漿。優(yōu)選地，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件 為：按2%接種量，于26-27°C，轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵24h，發(fā)酵過程中控制pH值6. 0-7. 0。
[0013] 本發(fā)明的德沃斯氏菌ANSB714能高效降解單端孢霉烯族毒素（NIV、VER和DON)， 降解效率高。20min內(nèi)降解率可達98%以上。
[0014] 本發(fā)明還提供單端孢霉烯族毒素生物降解劑，將按照上述所述方法制備的德沃斯 氏菌ANSB714發(fā)酵液與吸附劑按1 :2-10的重量比混合，30°C干燥，任選添加適量免疫調(diào)節(jié) 齊U，即得單端孢霉烯族毒素生物降解劑。所述生物降解劑對飼料中單端孢霉烯族毒素（NIV、 VER和DON)等毒素的降解活性大于90%以上。
[0015] 其中，所述吸附劑為玉米芯粉、大豆?jié)饪s蛋白粉、麩皮、淀粉、硅藻土、活性炭等中 的一種或幾種。所述免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于甘露聚糖、β葡聚糖、黃芪多糖、維生素 E、維 生素 C等。
[0016] 本發(fā)明還提供上述生物降解劑的制備方法，將按照上述方法制備的德沃斯氏菌 ANSB714發(fā)酵液與吸附劑按1 :2-10的重量比混合，30°C干燥，任選與適量免疫調(diào)節(jié)劑混合。
[0017] 本發(fā)明還提供能夠高效降解單端孢霉烯族毒素的德沃斯氏菌ANSB714生物活性 物質(zhì)，將按照上述方法制備的德沃斯氏菌ANSB714發(fā)酵液進行離心，收集上清液，向菌體 沉淀中加入緩沖液制備菌懸液，制備菌體破碎物并分離出胞內(nèi)物質(zhì)，所得上清液、菌懸液、 菌體破碎物和胞內(nèi)物質(zhì)中含有降解單端孢霉烯族毒素的生物活性物質(zhì)。所得德沃斯氏菌 ANSB714活性物質(zhì)菌體懸浮液和菌體破碎物對單端孢霉烯族毒素的降解活性大于90%。
[0018] 本發(fā)明還提供德沃斯氏菌ANSB714或由其制備的復(fù)合微生物菌劑，或上述生物降 解劑，或上述生物活性物質(zhì)在降解飼料中單端孢霉烯族毒素中的應(yīng)用。其中，所述單端孢霉 烯族毒素包括但不限于雪腐鐮孢菌烯醇、疣孢菌素、脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇等。
[0019] 本發(fā)明進一步提供德沃斯氏菌ANSB714在抗模擬胃液和/或模擬膽鹽環(huán)境中的應(yīng) 用，將按照上述方法制備的德沃斯氏菌ANSB714發(fā)酵液加入到模擬胃液和/或模擬膽鹽的 環(huán)境中，26. 5-37 °C，培養(yǎng)24h，活菌純活率可達78% -79%。
[0020] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0021] (一）本發(fā)明提供的德沃斯氏菌ANSB714,降解單端孢霉烯族毒素（所述單端孢霉 烯族毒素包括但不限于雪腐鐮孢菌烯醇、疣孢菌素、脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇）效率高、特異性 強，降解率可達到98%以上，且本解毒反應(yīng)為不可逆的生物降解。
[0022] (二）德沃斯氏菌ANSB714對單端孢霉烯族毒素的解毒活性高，作用專一，作用效 果溫和，不會破壞飼料中的營養(yǎng)成分，對飼料的感官品質(zhì)沒有影響。
[0023] (三）本發(fā)明提供的利用德沃斯氏菌ANSB714降解單端孢霉烯族毒素的方法操作 簡單，對飼料和環(huán)境無污染，有效地解決了傳統(tǒng)去毒方法存在的問題。
[0024] (四）德沃斯氏菌ANSB714具有抵抗胃酸和膽鹽的能力，有利于在動物腸道中發(fā)揮 降解功能。
[0025] (五）利用德沃斯氏菌ANSB714制成的生物降解劑具有同時降解單端孢霉烯族毒 素和飼料原料中單端孢霉烯族毒素的功能，解毒效率高，對動物具有抗逆性能，無毒無害， 在動物飼料制備領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明s實施例3中ANSB714發(fā)酵液不同0D_值對應(yīng)的活菌數(shù)。
[0027] 圖2為本發(fā)明s實施例3中ANSB714不同接種量發(fā)酵液與NIV、VER和DON反應(yīng) 20min和24h的降解率。
[0028] 圖3為本發(fā)明s實施例3中ANSB714不同接種量反應(yīng)20min對NIV、VER和DON的 降解率。
[0029] 圖4為本發(fā)明s實施例5中ANSB714活性物質(zhì)與NIV、VER和DON反應(yīng)不同時間的 降解率。

【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0031] 實施例1德沃斯氏菌ANSB714菌株的篩選
[0032] 菌株篩選：從動物腸道內(nèi)容物、霉變飼料、霉變食品和自然環(huán)境（例如土壤）中進 行菌種的篩選。
[0033] 種子液制備：分別將動物腸道內(nèi)容物、霉變飼料、霉變食品和自然環(huán)境中獲得的樣 品與兩倍體積的無菌水混合，置于滅菌18mmX 180mm試管中，振蕩過夜；吸取上清液0. lmL， 分別與〇. 8mL的篩選培養(yǎng)基混合，于30°C恒溫箱震蕩培養(yǎng)12h，得種子液。
[0034] 其中，篩選培養(yǎng)基的配方為：NaH2P040. 25g、ΝΗ4Ν031· 0g、MgS04. · 7H20 0· 25g、 FeS040 . 001g、瓊脂 17g、葡萄糖 2. 0g，加蒸饋水至 lOOOmL，pH 7. 0,121°C蒸汽滅菌 20min。
[0035] 樣品初篩：分別將100 μ 1嘔吐毒素（100 μ g/mL)加入各種子液中，以不接菌的含 嘔吐毒素的篩選培養(yǎng)基作為空白對照，漩渦震蕩混勻，置于30°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72h，使用 酶聯(lián)免疫試劑盒對其進行毒素降解率的分析。
[0036] 菌株分離：選擇毒素降解效率最高的種子液，吸取種子液0. lmL，用發(fā)酵培養(yǎng)基梯 度稀釋10' 10' 10' 10' 10' 10' ΚΓ7,分別取0. 2mL各稀釋樣品溶液，涂布于種子培養(yǎng) 基的平板，30°C恒溫箱培養(yǎng)3天，觀察結(jié)果，根據(jù)不同菌落的形態(tài)和特征，將有代表性的菌 落逐一挑出，在新鮮的種子培養(yǎng)基平板上劃線純化，分別編號并轉(zhuǎn)接至保存培養(yǎng)基斜面保 存。
[0037] 其中，種子培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g、胰蛋白胨5g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、NaCl l〇g，加蒸饋水至l〇〇〇mL，121°C蒸汽滅菌20min。
[0038] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化鈉4g、 磷酸氫二鈉3g、七水硫酸鎂1. 0g，加蒸饋水至lOOOmL，pH值7. 2,121°C蒸汽滅菌20min。
[0039] 菌種保存培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化鈉 4g、磷酸氫二鈉3g、七水硫酸鎂1. 0g、瓊脂18g，pH值7. 2,121°C蒸汽滅菌20min。
[0040] 菌株復(fù)篩：將上述分離純化的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后濃度為2%，30°C 發(fā)酵24h，分別取900 μ 1發(fā)酵液，與100 μ 1嘔吐毒素（100 μ g/mL)置于18謹X 180謹試管 中，以不接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基加毒素作為空白對照，置于30°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72h，測定嘔吐 毒素的剩余量，計算嘔吐毒素降解率。
[0041] 嘔吐毒素的提取及代謝產(chǎn)物測定參照Young等（Young, J. C.，Zhu, H. Η. , Zhou, Τ. , et al. Degradation of trichothecene mycotoxins by aqueous ozone. Food Chem. Toxicol，2006, 44, 417-424.)的方法。取500 μ 1反應(yīng)混合液，與等體積甲醇混合，靜 置2h后,6000 X g離心10min,上清液用0. 2 μ m濾膜過濾,用于液質(zhì)聯(lián)用分析。
[0042] 將上述分離純化的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后濃度為2%，30°C發(fā)酵24h， 分別取900 μ 1發(fā)酵液，分別與100 μ L NIV和DAS毒素（500 μ g/mL)混合置于18謹X 180謹 試管中，以不接菌的含毒素的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照，置于30°C在培養(yǎng)箱中靜置72h，測 定毒素的剩余量，計算毒素降解率。
[0043] 德沃斯氏菌ANSB714的微生物學(xué)特性見表1。
[0044] 表1德沃斯氏菌ANSB714的形態(tài)和理化特征
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 降解單端孢霉烯族毒素的德沃斯氏菌（Devosia sp. )ANSB714,其保藏號為CGMCC No. 9428,所述單端孢霉烯族毒素包括但不限于雪腐鐮孢菌烯醇、疣孢菌素、脫氧瓜萎鐮孢 菌烯醇。
2. 權(quán)利要求1所述德沃斯氏菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：取德沃斯氏菌ANSB714的種子液0. 5-5ml，接種于50-100ml培養(yǎng)基 中進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)； 其中，所述培養(yǎng)基包括如下組分：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏2-5g、氯化鈉8-12g和水 800-1200mL，pH 值6. 0-9. 0 ; 搖瓶發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度16_37°C，發(fā)酵時間20-26h，轉(zhuǎn)速100-200r/min ; 2) 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：將上述經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的種子液按0. 5-5%接種量接種于玉米漿 培養(yǎng)基中，于16_37°C，轉(zhuǎn)速100_200r/min，發(fā)酵20-26h，發(fā)酵過程中控制pH值6. 0-9. 0 ; 其中，所述玉米漿培養(yǎng)基為30-50g/L玉米漿。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)中搖瓶發(fā)酵條件為：于26.5°C， 轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵24h，發(fā)酵過程中控制pH值7. 0 ;步驟2)中發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為：按 2%接種量，于26-27°C，轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵24h，發(fā)酵過程中控制pH值6. 0-7. 0。
4. 單端孢霉烯族毒素生物降解劑，其特征在于，將按照權(quán)利要求2或3所述方法制備的 德沃斯氏菌ANSB714發(fā)酵液與吸附劑按1 :2-10的重量比混合，30°C干燥，任選添加適量免 疫調(diào)節(jié)劑，即得單端孢霉烯族毒素生物降解劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物降解劑，其特征在于，所述吸附劑為玉米芯粉、大豆?jié)饪s 蛋白粉、麩皮、淀粉、硅藻土、活性炭中的一種或幾種；所述免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于甘露聚 糖、β -葡聚糖、黃芪多糖、維生素 E、維生素 C。
6. 權(quán)利要求4或5所述生物降解劑的制備方法，其特征在于，將按照權(quán)利要求2或3所 述方法制備的德沃斯氏菌ANSB714發(fā)酵液與吸附劑按1 :2-10的重量比混合，30°C干燥，任 選與適量免疫調(diào)節(jié)劑混合。
7. 降解單端孢霉烯族毒素的德沃斯氏菌ANSB714生物活性物質(zhì)，其特征在于，將按照 權(quán)利要求2或3所述方法制備的德沃斯氏菌ANSB714發(fā)酵液進行離心，收集上清液，向菌體 沉淀中加入緩沖液制備菌懸液，制備菌體破碎物并分離出胞內(nèi)物質(zhì)，所得上清液、菌懸液、 菌體破碎物和胞內(nèi)物質(zhì)中含有降解單端孢霉烯族毒素的生物活性物質(zhì)。
8. 權(quán)利要求1所述德沃斯氏菌或由其制備的復(fù)合微生物菌劑，或權(quán)利要求4或5所述 生物降解劑，或權(quán)利要求7所述生物活性物質(zhì)在降解飼料中單端孢霉烯族毒素中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單端孢霉烯族毒素包括但不限于雪 腐鐮孢菌烯醇、疣孢菌素、脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇。
10. 德沃斯氏菌ANSB714在抗模擬胃液和/或模擬膽鹽環(huán)境中的應(yīng)用，其特征在于，將 按照權(quán)利要求2或3所述方法制備的德沃斯氏菌ANSB714發(fā)酵液加入到模擬胃液和/或模 擬膽鹽的環(huán)境中，26. 5-37°C，培養(yǎng)24h。
【文檔編號】C12N1/20GK104232517SQ201410419237
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】趙麗紅, 計成, 馬秋剛, 李笑櫻 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)