一種解淀粉乳桿菌l5及其在發(fā)酵豆腐黃漿水中應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了解淀粉乳桿菌L5及其在發(fā)酵黃漿水中的應(yīng)用。該解淀粉乳桿菌(Lactobacillus?amylolyticus)L5的保藏號(hào)為CGMCC?NO.9371；其16S?rDNA序列如SEQ.ID.NO1。應(yīng)用時(shí)，先將黃漿水在115-121℃滅菌；按黃漿水體積計(jì)，接入3％-6％的解淀粉乳桿菌L5的種子液；在35-47℃保溫酸化24-48h，黃漿水的酸度值達(dá)60°T-90?°T，獲得了一種新型的豆腐點(diǎn)漿劑。本發(fā)明解決了自然發(fā)酵酸漿水中微生物生長(zhǎng)雜亂的問(wèn)題，提高了酸漿豆腐的質(zhì)量安全性。本發(fā)明直接利用黃漿水中的低聚糖和淀粉等生長(zhǎng)產(chǎn)酸，無(wú)需補(bǔ)充其它碳源和營(yíng)養(yǎng)素即可達(dá)到點(diǎn)漿劑所需酸度，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說(shuō)明】一種解淀粉乳桿菌L5及其在發(fā)酵豆腐黃漿水中應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及乳酸菌和豆制品加工領(lǐng)域，具體涉及一株解淀粉乳酸菌 (Lactobacillus amylolyticus)L5及其在制備豆腐凝固劑中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃漿水為豆腐制作過(guò)程中產(chǎn)生的黃色浙水，含有大量水溶性的糖類如水蘇糖、棉 籽糖等低聚糖，以及異黃酮、蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，非常適合微生物的生長(zhǎng)。直接排 放不僅會(huì)造成資源的浪費(fèi)，而且會(huì)嚴(yán)重污染環(huán)境與土壤，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)黃漿水的綜合利用引 起了國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者的關(guān)注。
[0003] 我國(guó)傳統(tǒng)豆腐生產(chǎn)過(guò)程中，石膏和鹽鹵作為凝固劑長(zhǎng)期使用。使用鹽鹵點(diǎn)漿的豆 腐風(fēng)味極佳，但持水性差，不易放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；使用石膏作為點(diǎn)漿劑的豆腐持水性好，但成 品略帶有苦澀味，缺乏大豆香氣。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，豆制品加工過(guò)程中產(chǎn)生的黃漿水，在存 貯的過(guò)程中經(jīng)自然發(fā)酵所生成的酸漿水，是一種良好的豆腐凝固劑，已在部分豆制品生產(chǎn) 廠家使用，以酸漿水制成的豆腐色澤微黃、口感鮮嫩，無(wú)化學(xué)點(diǎn)漿劑的苦澀味，屬純天然食 品。但目前使用的酸漿水均為自然發(fā)酵，所涉及到的微生物除產(chǎn)酸的乳酸菌外，還含有部分 其它的細(xì)菌和酵母等，其中也有可能污染蠟樣芽孢桿菌、葡萄球菌等雜菌，對(duì)豆腐及其制品 的食用安全性構(gòu)成危害。
[0004] 當(dāng)使用商用乳酸菌如嗜酸乳桿菌對(duì)黃漿水進(jìn)行純種發(fā)酵制備點(diǎn)漿劑時(shí)，雖然可以 獲得安全性高的酸漿水，但需要補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)素如蔗糖才能達(dá)到合適的酸度，增加了生產(chǎn)成本， 因此尋找適宜發(fā)酵黃漿水的乳酸菌具有重要實(shí)際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一株乳酸菌即解淀粉乳桿菌 (Lactobacillus amylolyticus)L5〇
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述乳酸菌Lactobacillus amylolyticus L5在發(fā)酵 豆腐黃漿水中的一種應(yīng)用，解決自然發(fā)酵酸漿水中微生物生長(zhǎng)雜亂的問(wèn)題，提高了酸漿豆 腐的質(zhì)量安全性，并降低成本。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一株解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus)L5,保藏于中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC N0. 9371，保藏日期為2014年6月23日。
[0009] 本發(fā)明中解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus)L5是通過(guò)稀釋平板法篩 選獲得。使用無(wú)菌采樣瓶現(xiàn)場(chǎng)采樣自然發(fā)酵而成的酸漿水，低溫帶回；立即使用無(wú)菌水分 別稀釋至10'10'ΚΓ 5倍，涂布于改良的MRS固體培養(yǎng)基上；然后放入37°C的恒溫培養(yǎng)箱 中，培養(yǎng)48h ;挑取疑似菌落，進(jìn)行平板劃線分離，如此重復(fù)4?5次，直至獲得純的單菌落。 將純化的單菌落穿刺接種到MRS固體培養(yǎng)基內(nèi)，于4°C冰箱保存。其中改良MRS液體培養(yǎng) 基（g/L)配方為：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL， Κ2ΗΡ04 · 3H202 g，NaAc · 3H20 5 g，檸檬酸三銨 2 g，MgS04 · 7H20 0· 58 g，MnS04 · H20 0· 25 g，加入蒸餾水到1 L，調(diào)pH到6. 4 ±0. 2 (MRS固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%或 0.7%的瓊脂），121°C滅菌 15 min。
[0010] 本發(fā)明中乳桿菌L5的生物活性特征如下：在MRS固體培養(yǎng)基平板上菌落突起，呈 圓形，直徑一般為1-3 mm，灰白色，不透明，濕潤(rùn)光滑（見(jiàn)圖la);菌體為革蘭氏染色陽(yáng)性無(wú) 芽孢桿菌，呈細(xì)短桿狀，成對(duì)或堆狀排列（見(jiàn)圖lb);葡萄糖同型發(fā)酵，生長(zhǎng)溫域?qū)挘?0-52°C 可正常生長(zhǎng)，見(jiàn)圖2)，生長(zhǎng)速度快；常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1)表明菌株L5為革蘭氏 陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、可利用淀粉、同型發(fā)酵的無(wú)芽孢桿菌（表1)。將所測(cè)16S rDNA序列 (如SEQ. ID. N01)通過(guò)BLAST比對(duì)，鑒定其為解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus) (見(jiàn)圖3)。
[0011] 本發(fā)明提供解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus)L5在發(fā)酵豆腐黃楽水 中的應(yīng)用。
[0012] 該應(yīng)用方法包括如下步驟：
[0013] (1)將黃漿水在115-121°C滅菌，滅菌的時(shí)間為15-30分鐘；
[0014] (2)按黃漿水體積計(jì)，接入3% -6%的解淀粉乳桿菌L6的種子液；
[0015] (3)在35-47°C保溫酸化24-48h，將黃漿水的酸度值達(dá)到60° T以上。
[0016] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0017] (1)將Lactobacillus amylolyticus L5種子液接入到滅菌的黃楽水中，進(jìn)行純種 發(fā)酵，獲得了一種新型的豆腐點(diǎn)漿劑，解決了自然發(fā)酵酸漿水中微生物生長(zhǎng)雜亂的問(wèn)題，提 高了酸漿豆腐的質(zhì)量安全性。
[0018] (2)該菌株可以直接利用黃漿水中的低聚糖和淀粉等生長(zhǎng)產(chǎn)酸，無(wú)需補(bǔ)充其它碳 源和營(yíng)養(yǎng)素即可達(dá)到點(diǎn)漿劑所需酸度，降低了生產(chǎn)成本。
[0019] (3)該菌株產(chǎn)酸速度快，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前 旦 -5^ 〇
[0020] 本發(fā)明提供解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus)L5在制備酸豆乳中的 應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖la為本發(fā)明Lactobacillus amylolyticus L5菌株的菌落形態(tài)圖；
[0022] 圖lb為本發(fā)明Lactobacillus amylolyticus L5菌株的菌體形態(tài)圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明Lactobacillus amylolyticus L5菌株對(duì)溫度的適應(yīng)性曲線示意 圖；
[0024] 圖3為本發(fā)明Lactobacillus amylolyticus L5菌株根據(jù)16S rDNA序列所做的 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但實(shí)施 例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限定。
[0026] 實(shí)施例中需要說(shuō)明的是：
[0027] (1)革蘭氏染色、形狀觀察及常用生理生化鑒定培養(yǎng)基參考凌代文主編的《乳酸細(xì) 菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》（1999年版）。
[0028] (2)對(duì)溫度的適應(yīng)性檢測(cè)按照以下方法：
[0029] 取100mL三角瓶，加入50 mL改良MRS液體培養(yǎng)基，121°C滅菌15min，冷卻后接 種Lactobacillus amylolyticus L5菌株，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子培養(yǎng)液備用。在滅菌 的改良MRS液體培養(yǎng)基三角瓶中加入lmL種子培養(yǎng)物（發(fā)酵接種量為2 % (V/V))，分別在 22°C，27°C，32°C，37°C，42°C，47°C，52°C等溫度下恒溫培養(yǎng)，設(shè)置3組平行發(fā)酵，18 h后，用 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)其0D值。
[0030] ⑶改良MRS液體培養(yǎng)基（用于乳酸菌的培養(yǎng)）：
[0031] 牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，K2HP04,3H20 2g，NaAc.3H 20 5 g，檸檬酸三銨 2 g，MgS04.7H20 0.58 g，MnS04.H20 0.25 g;蒸餾水 1 L， pH 6. 4±0. 2 (MRS固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0. 7-2%的瓊脂），121°C滅菌15 min〇
[0032] (4)酸度測(cè)定參照GB 541334-2010的方法進(jìn)行測(cè)定。具體操作為：將樣品攪拌均 勻，精確稱取l〇g樣品，加入20mL無(wú) C02的蒸餾水，混勻，加入0. 5mL酚酞指示劑，用0. 1N NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色，且在30s內(nèi)不變色為終點(diǎn)，酸度的計(jì)算按照下面的公 式：
[0033] X = (CXVX100)/(mX0. 1)
[0034] X--樣品的酸度，單位。T ;
[0035] C--氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，單位mol/L ;
[0036] V--消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位mL ;
[0037] m--樣品的質(zhì)量，單位g。
[0038] 實(shí)施例1菌株篩選
[0039] (1)使用無(wú)菌采樣瓶，現(xiàn)場(chǎng)采樣自然發(fā)酵而成的酸漿水，低溫帶回。立即使用無(wú)菌 水分別稀釋至10' 10' ΚΓ5倍，涂布于改良的MRS固體培養(yǎng)基上。然后放入37°C的恒溫培 養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h。挑取疑似菌落，進(jìn)行平板劃線分離，如此重復(fù)4?5次，直至獲得純的單 菌落。將純化的單菌落用接種針插入含有MRS固體培養(yǎng)基的試管中心，于4°C冰箱內(nèi)保存。
[0040] (2)從自然發(fā)酵的酸漿水中分離出菌株L5,其在MRS培養(yǎng)基上的菌落呈圓形、直徑 一般為1-2 mm，灰白色、不透明狀，濕潤(rùn)光滑（圖la);進(jìn)行革蘭氏染色和細(xì)胞形狀觀察，菌 株L5的菌體呈圓端長(zhǎng)桿狀，單生或鏈狀排列（圖lb)。常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1， Lactobacillus amylolyticus L5菌株的生理生化特性表）表明菌株L5為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò) 氧化氫酶陰性、同型發(fā)酵的無(wú)芽孢桿菌。葡萄糖同型發(fā)酵，生長(zhǎng)溫域?qū)挘?0_52°C可正常生 長(zhǎng)，見(jiàn)圖2)，生長(zhǎng)速度快；
[0041] 表 1
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種解淀粉乳桿菌L5，其特征在于，該解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus)的保藏號(hào)為 CGMCC N0.9371。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉乳桿菌L5,其特征在于，解淀粉乳桿菌 (Lactobacillus amylolyticus)L5 的 16S rDNA 序列為 SEQ. ID. N01。
3. 權(quán)利要求1所述解淀粉乳桿菌L5在發(fā)酵豆腐黃漿水中的一種應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的解淀粉乳桿菌L5在發(fā)酵豆腐黃漿水中的應(yīng)用，其特征在于包 括如下步驟： (1) 將黃漿水在115_121°C滅菌； (2) 按黃漿水體積計(jì)，接入3% -6%的解淀粉乳桿菌L5的種子液； (3) 在35-47°C保溫酸化24-48h，黃漿水的酸度值可達(dá)到60° T-90° T。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的解淀粉乳桿菌L5在發(fā)酵豆腐黃漿水中的應(yīng)用，其特征在于， 所述滅菌的時(shí)間為15-30分鐘。
【文檔編號(hào)】C12R1/225GK104195079SQ201410419335
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】李理, 劉力 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)