一種定量檢測蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基及其應(yīng)用。本發(fā)明的蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基是由下列組分制成的：燕麥片10-20g，瓊脂粉15-20g、細(xì)菌抑菌劑0.1-l.Og、真菌抑菌劑0.1-1.0g和蒸餾水1000ml。本發(fā)明的蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)：利用抗生素對細(xì)菌的抑殺作用，完全排除了細(xì)菌對靶標(biāo)真菌檢測的干擾；利用不同真菌對真菌抑菌劑的敏感性存在差異的特性，以及不同真菌對碳源利用能力的差異，消除待測樣品中其他真菌的影響，從而達(dá)到有效定量檢測蠟蚧輪枝菌的目的；該培養(yǎng)基的組分易得、價(jià)格低廉、制備簡單、使用方便。
【專利說明】一種定量檢測蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 錯(cuò)階輪枝菌（Lecanicillium Lecanii)是重要的蟲生真菌，對刺吸式害蟲具有很 好的防治效果，該菌在西歐、蘇、美、中等許多國家和地區(qū)已有廣泛應(yīng)用。眾所周知，生防菌 對作物害蟲的防治效果與生防菌的施用時(shí)間、單次施用劑量、施用次數(shù)密切相關(guān)，因此，針 對不同作物或生境制定適宜的生防菌施用方法顯得尤為重要。生防菌在自然界中天然存 在，研究其田間種群自然波動(dòng)規(guī)律，以及人工投放施用后生防菌的延續(xù)或存活狀況，對指導(dǎo) 生防菌使用具有重要指導(dǎo)意義。土壤是生防菌的最主要宿存場所，同時(shí)也是所有微生物的 主要活動(dòng)場所，因此，生防菌土壤宿存的研究首先要排除土壤其它微生物的干擾。針對土壤 中蟲生真菌的研究方法有限，主要有選擇性培養(yǎng)基、蟲餌誘菌法和PCR檢測法。具體到蠟 蚧輪枝菌來說，蟲餌誘菌中的誘蟲對蠟蚧輪枝菌不敏感，無法對蠟蚧輪枝菌有效誘集。理論 上，PCR法可通過設(shè)計(jì)引物或探針特異性地檢測靶標(biāo)菌的核酸，然而土壤腐殖酸、微生物及 其代謝物往往嚴(yán)重干擾PCR的檢測靈敏度，此外，PCR法也無法僅可以反映靶標(biāo)菌的核酸狀 況，無法反應(yīng)靶標(biāo)菌活菌的狀況。選擇性培養(yǎng)基可有效反應(yīng)靶標(biāo)菌活菌的狀況，已成功應(yīng)用 于白僵菌、綠僵菌等，而蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基依然缺乏。目前，蠟蚧輪枝菌在田間延 續(xù)與存活的基礎(chǔ)研究相當(dāng)缺乏，不利于指定適宜于的蠟蚧輪枝菌使用方法，嚴(yán)重制約了該 菌的應(yīng)用與推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種定量檢測蠟蚧輪枝菌的選擇性培 養(yǎng)基及其應(yīng)用方法，能有效排除土壤雜菌干擾，從而快速準(zhǔn)確的對蠟蚧輪枝菌的活菌量進(jìn) 行檢測，該培養(yǎng)基具備價(jià)格低廉、制備方便的優(yōu)點(diǎn)
[0004] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種蠟蚧輪枝菌選擇性培養(yǎng)基，每 升該選擇性培養(yǎng)基由如下組分組成：燕麥片10_20g，瓊脂粉15-20g、細(xì)菌抑菌劑0. 1-1. 0g、 真菌抑菌劑〇. 1-1. Og和蒸餾水1000ml。
[0006] 作為一種優(yōu)選方案，每升上述選擇性培養(yǎng)基由如下組分組成：燕麥片15g，瓊脂粉 17g、細(xì)菌抑菌劑0. 5g和真菌抑菌劑0. 5g。
[0007] 本發(fā)明所述的細(xì)菌抑菌劑為硫酸鏈霉素、氯霉素、青霉素中的一種或它們的混合 物。
[0008] 本發(fā)明所述的真菌抑菌劑為十二烷基胍醋酸鹽、十六烷基三甲基溴化銨、多菌靈 中的一種或它們的混合物。
[0009] 上述蠟蚧輪枝菌選擇性培養(yǎng)基的制作方法：稱取燕麥15_20g，倒入鍋中，加蒸餾 水煮30分鐘，用4層紗布過濾去殘?jiān)?，濾液加入瓊脂粉15-20g和真菌抑菌劑0. 1-1. Og，再 次煮沸，蒸餾水定容到1000ml，121°C高壓濕熱滅菌25min，待培養(yǎng)基冷卻至不燙手時(shí)，加入 細(xì)菌抑菌劑〇. 1-1. 〇g，充分混勻后，倒入滅過菌的直徑約9cm的培養(yǎng)皿中，每皿約20mL，冷 凝后低溫保存?zhèn)溆?，保存時(shí)間不超過2周。
[0010] 本發(fā)明選擇性培養(yǎng)基可以用于定量檢測蠟蚧輪枝菌。檢測方法是：以選擇性培養(yǎng) 基制備平板，將待測樣品稀釋后取50-100 μ 1涂布于平板上，25°C黑暗培養(yǎng)2-5天，培養(yǎng)完 畢后進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明具有如下有益效果：利用抗生素對細(xì)菌的抑殺作用，排除 細(xì)菌對靶標(biāo)真菌檢測的干擾；利用不同真菌對真菌抑菌劑的敏感性存在差異的特性，以及 不同真菌對碳源利用能力的差異，消除待測樣品中其他真菌的影響；該培養(yǎng)基具有制備簡 單、組分易得，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施 例范圍之中。
[0013] 實(shí)施例1 :一種定量檢測錯(cuò)階輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基，其特征在于：燕麥15g，倒入 鍋中，加蒸餾水煮30分鐘，用4層紗布過濾去殘?jiān)?，濾液加入瓊脂粉17g和十六烷基三甲 基溴化銨〇. 5g，再次煮沸，蒸餾水定容到1000ml，121°C高壓濕熱滅菌25min，待培養(yǎng)基冷卻 至不燙手時(shí)，加入氯霉素〇. 5g，充分混勻后，倒入滅過菌的直徑約9cm的培養(yǎng)皿中，每皿約 20mL，冷凝后低溫保存?zhèn)溆?，保存時(shí)間不超過2周。
[0014] 實(shí)施例2 :-種定量檢測錯(cuò)階輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基，其特征在于：燕麥15g，倒入 鍋中，加蒸餾水煮30分鐘，用4層紗布過濾去殘?jiān)?，濾液加入瓊脂粉17g和多菌靈0. 5g，再 次煮沸，蒸餾水定容到1000ml，121°C高壓濕熱滅菌25min，待培養(yǎng)基冷卻至不燙手時(shí)，加入 硫酸鏈霉素〇. 5g，充分混勻后，倒入滅過菌的直徑約9cm的培養(yǎng)皿中，每皿約20mL，冷凝后 低溫保存?zhèn)溆?，保存時(shí)間不超過2周。
[0015] 實(shí)施例3 :-種定量檢測錯(cuò)階輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基，其特征在于：燕麥15g，倒入 鍋中，加蒸餾水煮30分鐘，用4層紗布過濾去殘?jiān)?，濾液加入瓊脂粉17g、十六烷基三甲基溴 化銨〇. 3g和多菌靈0. 3g，再次煮沸，蒸餾水定容到1000ml，121°C高壓濕熱滅菌25min，待 培養(yǎng)基冷卻至不燙手時(shí)，加入氯霉素〇. 5g，充分混勻后，倒入滅過菌的直徑約9cm的培養(yǎng)皿 中，每皿約20mL，冷凝后低溫保存?zhèn)溆?，保存時(shí)間不超過2周。
[0016] 實(shí)施例4 :一種定量檢測錯(cuò)階輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基，其特征在于：燕麥15g，倒入 鍋中，加蒸餾水煮30分鐘，用4層紗布過濾去殘?jiān)瑸V液加入瓊脂粉17g、十六烷基三甲基溴 化銨〇. 3g和十二烷基胍醋酸鹽0. 3g，再次煮沸，蒸餾水定容到1000ml，121°C高壓濕熱滅菌 25min，待培養(yǎng)基冷卻至不燙手時(shí)，加入硫酸鏈霉素0. 5g，充分混勻后，倒入滅過菌的直徑約 9cm的培養(yǎng)皿中，每皿約20mL，冷凝后低溫保存?zhèn)溆茫４鏁r(shí)間不超過2周。
[0017] 實(shí)施例5 :蠟蚧輪枝菌和選定雜菌在選擇性培養(yǎng)基上的生長狀況
[0018] 培養(yǎng)待測真菌的斜面中加入5ml 0. 05%吐溫80滅菌水，充分渦旋即得孢子懸浮 液，用血球計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)孢子濃度到IO5個(gè)孢子/ml，采用點(diǎn)孢法，接種菌株到選擇性培養(yǎng)基上， 25°C黑暗培養(yǎng)。蠟蚧輪枝菌在選擇性培養(yǎng)基上生長迅速，生長3天時(shí)，菌落直徑4-6mm，菌 落整體蓬松、絨毛狀，白色；球孢白僵菌在選擇性培養(yǎng)基上生長相對緩慢，生長3天時(shí)，菌落 直徑3-4mm，菌落密實(shí)，乳白色；金龜子綠僵菌在選擇性培養(yǎng)基上生長相對緩慢，菌落直徑 2-3mm，菌落中央稀疏向上生長，邊緣生長差，白色；曲霉菌、鐮刀菌和青霉菌在選擇性培養(yǎng) 基不生長，生長3天時(shí)未見菌落。
[0019] 實(shí)施例6 :選擇性培養(yǎng)基對蠟蚧輪枝菌的回收效率
[0020] 配制十六烷基三甲基溴化銨不同濃度的選擇性培養(yǎng)基，包括0g/L、0. Ig/L、0. 2g/ 1^、0.38/1、0.48/1、0.58/1和0.68/1。培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌的斜面中加入511110.05%吐溫80滅 菌水，充分渦旋即得孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)孢子濃度到IO 3個(gè)孢子/ml，取IOOy 1涂 布于不同處理的選擇性培養(yǎng)平板上，25°C黑暗培養(yǎng)3天，培養(yǎng)完畢后統(tǒng)計(jì)成菌落數(shù)，計(jì)算回 收效率。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。從表1看出，不同十六烷基三甲基溴化銨的選擇性培養(yǎng) 基對蠟蚧輪枝菌的回收效率存在差異，隨著十六烷基三甲基溴化銨濃度的增加，蠟蚧輪枝 菌孢子懸浮液在選擇性培養(yǎng)基上的回收效率降低；當(dāng)十六烷基三甲基溴化銨濃度為0. 5g/ L時(shí)，蠟蚧輪枝菌的回收效率為95. 7%，而當(dāng)十六烷基三甲基溴化銨濃度為0. 6g/L時(shí)，蠟蚧 輪枝菌的回收效率顯著降低至85. 8%。
[0021] 表1蠟蚧輪枝菌在不同濃度十六烷基三甲基溴化銨下的回收率

【權(quán)利要求】
1. 一種定量檢測蠟蚧輪枝菌的選擇性培養(yǎng)基，其特征在于：該選擇性培養(yǎng)基由如下組 分組成：燕麥片10-20g，瓊脂粉15-20g、細(xì)菌抑菌劑0. 1-1. Og、真菌抑菌劑0. 1-1. Og和蒸 餾水 1000ml。
2. 權(quán)利要求1所述的選擇性培養(yǎng)基，其特征在于：所述的細(xì)菌抑菌劑為硫酸鏈霉素、氯 霉素、青霉素中的一種或它們的混合物；所述的真菌抑菌劑為十二烷基胍醋酸鹽、十六烷基 三甲基溴化銨、多菌靈中的一種或它們的混合物。
3. 權(quán)利要求1所述的選擇性培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于：稱取燕麥15-20g，倒入 鍋中，加蒸餾水煮30分鐘，用4層紗布過濾去殘?jiān)?，濾液加入瓊脂粉15-20g和真菌抑菌劑 0. 1-1. 0g，再次煮沸，蒸餾水定容到1000ml，121°C高壓濕熱滅菌25min，待培養(yǎng)基冷卻至不 燙手時(shí)，加入細(xì)菌抑菌劑〇. 1-1. 〇g，充分混勻后，倒入滅過菌的直徑約9cm的培養(yǎng)皿中，每 皿約20mL，冷凝后低溫保存?zhèn)溆?，保存時(shí)間不超過2周。
4. 權(quán)利要求1所述的選擇性培養(yǎng)基的使用方法，其特征在于：以所述選擇性培養(yǎng)基制 備平板，將待測樣品稀釋后取50-100 μ 1涂布于平板上，25°C黑暗培養(yǎng)2-5天，培養(yǎng)完畢后 進(jìn)行計(jì)數(shù)。
5. 權(quán)利要求1所述的選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于：所述的選擇性培養(yǎng)基中十六 烷基三甲基溴化銨的濃度對蠟蚧輪枝菌的回收效率影響差異，最適宜的十六烷基三甲基溴 化銨濃度為〇. 5g/L，此時(shí)蠟蚧輪枝菌的回收效率為95. 7% ;土壤懸浮液稀釋倍數(shù)對選擇 性平板上蠟蚧輪枝菌和雜菌的數(shù)量有顯著影響，當(dāng)以IO5個(gè)孢子/g 土劑量投放時(shí)，最適宜 的稀釋倍數(shù)為100倍，此時(shí)選擇性平板上蠟蚧輪枝菌菌落數(shù)適中，雜菌數(shù)量也很少，近乎沒 有。
【文檔編號】C12Q1/06GK104212874SQ201410419374
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】張艷軍, 謝明, 彭德良 申請人:張艷軍, 謝明