蠟蚧輪枝菌的熒光定量pcr檢測技術(shù)及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種蠟蚧輪枝菌種水平熒光定量PCR檢測方法，其是針對蠟蚧輪枝菌的ITS片段中的種特異序列，設(shè)計出特異性引物和Taqman-TAMRA探針，建立了快速檢測蠟蚧輪枝菌的Real-timePCR檢測方法。該方法具有較高的靈敏性和良好的特異性，所檢測的含有蠟蚧輪枝菌的樣品均顯示為陽性結(jié)果，所檢測的近緣種及常見環(huán)境雜菌均為陰性結(jié)果。本方法可以檢測到100個拷貝/反應(yīng)體系的目的片段。同時進(jìn)行了昆蟲宿主或土壤模擬標(biāo)本的檢測，單頭蚜蟲接種培養(yǎng)3d時蟲體內(nèi)含有的蠟蚧輪枝菌的菌量即可被檢出，土壤模擬標(biāo)本中1.0父102個孢子/克土的蠟蚧輪枝菌的菌量可以被檢出。
【專利說明】蠟蚧輪枝菌的熒光定量PCR檢測技術(shù)及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蠟蚧菌輪枝菌的分子生物學(xué)檢測，具體地說，涉及一種蠟蚧輪枝菌種 水平熒光定量PCR檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 錯階輪枝菌（Lecanicillium Lecanii)是重要的蟲生真菌，對刺吸式害蟲具有很 好的防治效果，在西歐、蘇、美、中等許多國家和地區(qū)已有廣泛的應(yīng)用。蠟蚧輪枝菌對作物害 蟲的防治效果是由其對害蟲的毒力（內(nèi)在因素）和環(huán)境因子的影響（外在因素）綜合決定 的。在評價蠟蚧輪枝菌對害蟲的毒力中，傳統(tǒng)的生物測定方法僅可統(tǒng)計染病且死亡的害蟲， 而對染病但未死亡的害蟲無能為力；在研究蠟蚧輪枝菌生態(tài)適應(yīng)能力中，目前尚未發(fā)展出 有效定量檢測該菌的方法。實時熒光定量PCR依賴與特異性引物和探針，特異地檢測靶標(biāo) 菌的特定核酸序列，通過核酸數(shù)量來放映靶標(biāo)菌的數(shù)量，是當(dāng)前真菌定量檢測的最有效技 術(shù)手段，在白僵菌或綠僵菌的某些特定菌株的定量檢測應(yīng)用中已取得成功。蠟蚧輪枝菌的 定量檢測技術(shù)缺乏，制約了該菌眾多關(guān)鍵基礎(chǔ)研究的深入，嚴(yán)重限制了蠟蚧輪枝菌應(yīng)用研 究的進(jìn)一步發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蠟蚧輪枝菌種水平熒光定量PCR 檢測方法。
[0004] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供蠟蚧輪枝菌種水平熒光定量PCR檢測引物對和探 針。
[0005] 所述引物對包括：正向引物 LecF27 :5' -CTCCCAAACCCTTATGTGAACATAC-3'、反向引 物 LecR149 :5, -GCGGATTCAGAAAATGCTGATAA-3，。
[0006] 所述探針為 LecP28 :5' -FAM-TACTGTTGCTTCGGCGGACTCGCC-TAMRA-3'
[0007] 本發(fā)明還提供含有上述引物對和探針的用于種水平檢測蠟蚧輪枝菌的試劑盒。優(yōu) 選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種蠟蚧輪枝菌種水平熒光定量PCR檢測方法，包括以下步 驟：1)提取樣品中的DNA;2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用所述引物L(fēng)ecF27和 LecR149及探針LecP28進(jìn)行熒光定量PCR擴增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物。
[0009] 所述 PCR 反應(yīng)體系以 20 U 1 計為：I U LDNA 模板（約 IOng)、10 U I Perfectstart Taqman qPCR master mix(0mega 公司）、0.4lil 正向引物L(fēng)ecF27(10liM)、0.4LecR149 ul 反向引物（l〇yM)、0.2iil熒光探針LecP28(10pM)、滅菌雙蒸水8iiL。
[0010] PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 IOmin ;94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s， 共40個循環(huán)；在每個循環(huán)72°C延伸時讀取反應(yīng)熒光值。
[0011] 真菌核糖體rDNA的序列堿基存在高度保守但又不乏變異的特點，其中轉(zhuǎn)錄間隔 序列（ITS)已經(jīng)公認(rèn)為是真菌種類鑒定的最重要區(qū)域。本發(fā)明針對ITS片段設(shè)計了熒光定 量PCR檢測引物對和探針，并基于Taqman-TAMRA探針Real-time PCR技術(shù)，建立針對蠟蚧 輪枝菌種水平的快速檢測方法。具體地，針對蠟蚧輪枝菌的ITS片段中的種特異序列，應(yīng) 用 ABI Primer Express 3. O 軟件，設(shè)計出引物和 Taqman-TAMRA 探針，建立 Real-time PCR 檢測方法：把目的片段克隆到PEasy載體上，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以蠟蚧輪枝菌DNA梯度稀釋樣 品檢測引物探針的靈敏性，以近緣種及常見環(huán)境雜菌驗證引物探針的特異性；制備昆蟲宿 主或土壤模擬標(biāo)本評價本方法在實際樣品檢測中的應(yīng)用。結(jié)果表明，從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出， 該方法可以檢測到1〇〇個拷貝/反應(yīng)體系的目的片段，特異性檢測顯示僅含有蠟蚧輪枝菌 DNA的樣品有熒光信號，其他近緣種及常見環(huán)境雜菌均無熒光信號，單頭昆蟲宿主模擬標(biāo)本 中的蠟蚧輪枝菌可以被檢出，土壤模擬標(biāo)本中1. 〇 X IO2個孢子/克土的蠟蚧輪枝菌可以被 檢出。因此，本發(fā)明以ITS片段為靶基因建立的Real-time PCR檢測方法對蠟蚧輪枝菌種 水平的檢測特異性好、靈敏度高，可快速、準(zhǔn)確地用于樣品的定量檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明實施例2中靶標(biāo)菌和干擾菌的Real-time PCR檢測熒光信號圖。
[0013] 圖2為本發(fā)明實施例2中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Real-time PCR檢測熒光信號圖。
[0014] 圖3為本發(fā)明實施例2中根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品繪制的Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實施方式】
[0015] 下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施 例范圍之中。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手 段，所用原料均為市售商品。
[0016] 實施例1 :用于蠟蚧輪枝菌種水平熒光定量PCR檢測引物對和探針的合成
[0017] 針對錯階輪枝菌的ITS片段中的種特異序列，應(yīng)用ABI Primer Express 3. 0軟 件，設(shè)計出如表1所示的引物和Taqman-TAMRA探針，由上海生工生物公司合成。
[0018] 表1蠟蚧輪枝菌種水平熒光定量PCR檢測引物對和探針
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 蠟蚧輪枝菌種水平熒光定量PCR檢測引物對和探針，其特征在于，所述引物對包括： 正向引物 LecF27 :5' -CTCCCAAACCCTTATGTGAACATAC-3' 反向引物 LecR149 :5' -GCGGATTCAGAAAATGCTGATAA-3'， 所述探針為 LecP28 :5' -FAM-TACTGTTGCTTCGGCGGACTCGCC-TAMRA-3'。
2. 含有權(quán)利要求1所述的引物對和探針用于種水平檢測蠟蚧輪枝菌的試劑盒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模 板。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212893SQ201410419405
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】張艷軍, 謝明, 彭德良 申請人:張艷軍, 謝明