一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的pcr-hrm引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的PCR-HRM引物和方法。該方法為先從樣品中提取病毒DNA作為模板，利用所設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物和熒光飽和染料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分別以野毒株和疫苗株標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照對(duì)檢測樣品進(jìn)行HRM分析，確定犬細(xì)小病毒的類型。本發(fā)明操作簡單，只需PCR反應(yīng)前加熒光飽和染料即可；檢測速度快且高通量，全部操作過程只需3小時(shí)，不需要病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，極大縮短了區(qū)分檢測所需時(shí)間；費(fèi)用低，不需要特異性探針，熒光飽和染料廉價(jià)易得；準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地進(jìn)行分析，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
【專利說明】-種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的PCR-HRM引物 和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒疫苗毒與野毒株的鑒別方法，具體涉及一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒 野毒株與疫苗株的PCR-HRM引物和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus, CPV)為單鏈小DNA病毒，是引起犬急性出血 性胃腸炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。1977年，Eugster和Nairn首次從患出血性腸 炎的病犬糞便中分離到犬細(xì)小病毒，并命名為CPV-2。自Eugster等人首次分離獲得CPV-2 以來，CPV抗原性隨時(shí)間的推移而不斷發(fā)生改變，不斷有新的CPV基因型和抗原型出現(xiàn)，并 在世界范圍內(nèi)廣泛傳播流行。目前已知的CPV基因型包括CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，原始 型CPV-2基因型已被新出現(xiàn)的抗原變異株取代，并且原始型CPV-2毒株只有以弱毒活疫苗 的形式用于犬細(xì)小病毒的預(yù)防當(dāng)中。目前，國內(nèi)用于預(yù)防犬細(xì)小病的疫苗株主要有：美國輝 瑞動(dòng)保公司的CPVpf弱毒活疫苗株和荷蘭英特維公司的CPVint弱毒活疫苗株，以上兩個(gè) 疫苗株均是原始CPV-2株的弱毒株。
[0003] 隨著國內(nèi)寵物行業(yè)的不斷發(fā)展，目前臨床中大量使用弱毒活疫苗來預(yù)防犬細(xì)小 病，雖然接種疫苗可預(yù)防犬細(xì)小病的流行，但有報(bào)道稱接種犬細(xì)小病弱毒活疫苗株的犬只 發(fā)病率增加的現(xiàn)象。此外，接種疫苗也對(duì)疾病的及時(shí)準(zhǔn)確診斷帶來了一定的難度。例如，患 有犬瘟熱的犬只接種弱毒活疫苗后由于糞便當(dāng)中檢測到犬細(xì)小病毒疫苗株而誤診為犬細(xì) 小病引起的腸道疾病，從而影響其疾病治療效果。因此，快速區(qū)分犬細(xì)小病毒的疫苗株和野 毒株對(duì)疫苗株的安全評(píng)價(jià)及疾病的快速準(zhǔn)確診斷具有一定的臨床意義。而目前區(qū)分犬細(xì)小 病毒疫苗株與野毒的主要方法為熒光定量PCR法(MGB探針)，此方法雖然能準(zhǔn)確區(qū)分犬細(xì) 小病毒疫苗株與野毒株，但同時(shí)需要三對(duì)或更多的探針價(jià)格昂貴，限制其在生產(chǎn)中的實(shí)際 應(yīng)用。因此，目前急需一種操作相對(duì)簡易、檢測結(jié)果可靠且檢測成本低廉的區(qū)分犬細(xì)小病毒 疫苗株與野毒株的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明建立了一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒 株的PCR-HRM引物和方法，該方法操作簡易、快速、檢測結(jié)果可靠且檢測成本低廉，有利于 在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的PCR-HRM引 物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的PCR-HRM 方法。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示： 引物P1:TGGAAATCACAGCAAACTC(SEQIDN0:1)或其核苷酸互補(bǔ)序列， 引物P2:AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC(SEQIDN0:2)或其核苷酸互補(bǔ)， 引物P3:TGAAAATTATAGAAGAGTGGT(SEQIDN0:3)或其核苷酸互補(bǔ)序列， 引物 P4 :CGTTAACTGCAGTTTTATCCA (SEQ ID NO :4)或其核苷酸互補(bǔ)序列。
[0008] -種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的PCR-HRM方法，包括以下步驟： 1) 從樣品中提取病毒DNA ; 2) 以DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)P1和P2進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn) 物； 3) 以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為DNA模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)P3、P4和熒光飽和染料進(jìn) 行PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 4) 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒類型。
[0009] 進(jìn)一步的，上述步驟2)中的PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 PI 0. 5μ 1 引物 Ρ2 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ ddH20 3· 0 μ 1。
[0010] 進(jìn)一步的，上述步驟2)中的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s， 55°C退火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)35次；72°C終延伸8min。
[0011] 進(jìn)一步的，上述步驟3)中的PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)體系為： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 Ρ3 0. 5μ 1 引物 Ρ4 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ 熒光飽和染料 1 μ 1 ddH20 2· 0 μ 1。
[0012] 進(jìn)一步的，上述所述的突光飽和染料為Eva green染料。
[0013] 進(jìn)一步的，上述步驟3)中的PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min ;95°C變 性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)35次；68°C到80°C以0. 3°C /步的速率進(jìn)行熔解 曲線分析。
[0014] 進(jìn)一步的，上述步驟4)中所述HRM分析的具體分析過程為：1)以疫苗株CPVpf標(biāo) 準(zhǔn)樣品為對(duì)照時(shí)，若其基因分型置信值（GCP)大于95%則判定為疫苗株CPVpf ; 2) 以疫苗株CPVint標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照時(shí)，若其基因分型置信值（GCP)大于95%則判定為 疫苗株CPVint ; 3) 以CPV野毒株標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照時(shí)，若其基因分型置信值（GCP)大于95%則判定為CPV 野毒株。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明首次建立了一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的PCR-HRM引物和方 法，操作簡單：只需PCR反應(yīng)之前加熒光飽和染料即可；檢測速度快且高通量：全部操作 過程只需3小時(shí)，不需要病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，極大縮短了分型所需時(shí)間；費(fèi)用低，不需要特異 性探針，熒光飽和染料廉價(jià)易得；準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地 進(jìn)行分析，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0016] 2)本發(fā)明的PCR-HRM引物，對(duì)犬細(xì)小病毒疫苗株(包括CPVpf和CPVint疫苗株） 與野毒株均有很好地的擴(kuò)增性，有助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別分型的時(shí)間。
[0017] 3)本發(fā)明的PCR-HRM引物特異性好，除可以與犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株結(jié)合 夕卜，不與其他常見犬類病毒DNA結(jié)合，特異性擴(kuò)增犬細(xì)小病毒DNA，有利于提高本發(fā)明對(duì)基 因型分析的正確性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線； 圖2為犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM峰型化熔解曲線； 圖3為犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株臨床樣品HRM標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線； 圖4為犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株臨床樣品HRM峰型化熔解曲線； 圖5為犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株P(guān)CR-HRM引物特異性凝膠電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 實(shí)施例1 (1)引物 1)PCR預(yù)擴(kuò)增引物 根據(jù)犬細(xì)小病毒VP2基因序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增犬細(xì)小病毒VP2部分基因的引物對(duì)P1和P2， 其堿基序列如下所示。
[0021] P1 :5,-TGGAAATCACAGCAAACTC -3，(SEQ ID NO ：1), P2:5'-AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC-3' （SEQ ID N0:2)。
[0022] 其中，引物PI在犬細(xì)小病毒VP2基因第2962?2980位點(diǎn)上，引物P2在犬細(xì)小病 毒VP2基因第4209?4231位點(diǎn)上（該基因在Genbank中的登錄號(hào)為M38245 )。
[0023] 2) PCR-HRM 引物： 本發(fā)明經(jīng)過對(duì)所設(shè)計(jì)的大量引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)P3、P4和引物對(duì)PI、P2的聯(lián) 合使用對(duì)PCR-HRM方法區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的效果最好，引物對(duì)P3、P4的堿基 序列如下所示。
[0024] P3 :5'-TGAAAATTATAGAAGAGTGGT-3'（SEQ ID N0 :3)， P4:5'-CGTTAACTGCAGTTTTATCCA-3'（SEQ ID N0:4)。
[0025] 其中，引物P3在犬細(xì)小病毒VP2基因第3014?3034位點(diǎn)上，引物P4在犬細(xì)小病 毒VP2基因第3045?3066位點(diǎn)上（該基因在Genbank中的登錄號(hào)為M38245 )。
[0026] (2)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及其PCR-HRM分析 1)犬細(xì)小病毒DNA的提?。?用試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4.0提取病料樣品中的犬細(xì) 小病毒DNA。病料樣品可以是全血、糞便、直腸面拭子等易于獲得且對(duì)動(dòng)物體無嚴(yán)重傷害的 樣品。
[0027] 2)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備： 為了驗(yàn)證本發(fā)明方法可行性與可靠性，同時(shí)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品，為之后的臨床樣品檢 測提供HRM陽性對(duì)照，本發(fā)明需優(yōu)先制備犬細(xì)小病毒疫苗株和野毒株陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品。標(biāo)準(zhǔn) 樣品的制備步驟如下： 分別取經(jīng)過測序確定為CPVpf疫苗株、CPVint疫苗株和犬細(xì)小病毒野毒株的DNA作為 模板，分別以P1和P2為引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，其預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 PI 0. 5μ 1 引物 Ρ2 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ ddH20 3· 0 μ 1。
[0028] 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?51：預(yù)變性51^11;951：變性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸 30s ;循環(huán)35次；72°C終延伸8min。
[0029] 通過上述方法，分別獲得犬細(xì)小病毒疫苗株CPVpf、疫苗株CPVint和野毒株的 PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，分別將PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍，即可分別獲得疫苗株CPVpf、疫苗株 CPVint和野毒株的標(biāo)準(zhǔn)樣品，作為后續(xù)研究的陽性對(duì)照樣品。
[0030] 3 )陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品的PCR-HRM操作步驟 分別以上述獲得的三種陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品為DNA模板，分別進(jìn)行PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)和分 析； PCR-HRM反應(yīng)體系：10 μ 1

【權(quán)利要求】
1. 一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所 示： 引物P1:TGGAAATCACAGCAAACTC(SEQIDN0:1)或其核苷酸互補(bǔ)序列， 引物P2:AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC(SEQIDN0:2)或其核苷酸互補(bǔ)， 引物P3:TGAAAATTATAGAAGAGTGGT(SEQIDN0:3)或其核苷酸互補(bǔ)序列， 引物 P4 :CGTTAACTGCAGTTTTATCCA (SEQ ID NO :4)或其核苷酸互補(bǔ)序列。
2. -種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的PCR-HRM方法，其特征在于：包括以下 步驟： 1) 從樣品中提取病毒DNA ; 2) 以DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)P1和P2進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)獲得預(yù)擴(kuò)增產(chǎn) 物； 3) 以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為DNA模板，用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)P3、P4和熒光飽和染料進(jìn) 行PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 4) 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定病毒類型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟2)中的PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為： Premix Ex-Taq 5. 0 μ 1 引物 PI 0. 5μ 1 引物 Ρ2 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ ddH20 3· 0 μ 1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟2)中的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù) 變性5min ;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s ;循環(huán)35次；72°C終延伸8min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟3)中的PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)體系為： Premix Εχ-Taq 5. 0 μ 1 引物 Ρ3 0. 5μ 1 引物 Ρ4 0. 5μ 1 模板 Ι.ΟμΙ 熒光飽和染料 1 μ 1 ddH20 2· 0 μ 1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的方法，其特征在于：所述的突光飽和染料為Eva green染 料。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟3)中的PCR-HRM擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?95°〇預(yù)變性511^11;951：變性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8 ;循環(huán)35次；681：到8〇1：以 0. 3°C /步的速率進(jìn)行熔解曲線分析。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟4)中所述HRM分析的具體分析過程 為：1)以疫苗株CPVpf?標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照時(shí)，若其基因分型置信值（GCP)大于95%則判定為疫 苗株CPVpf ; 2)以疫苗株CPVint標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照時(shí)，若其基因分型置信值（GCP)大于95%則判定為 疫苗株CPVint ; 3 )以CPV野毒株標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照時(shí)，若其基因分型置信值（GCP)大于95%則判定為CPV 野毒株。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195265SQ201410419410
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】張建峰, 嘎利兵嘎, 張春紅, 劉志成, 郭鵬舉, 沈海燕, 朱余軍 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所