兩個增加豬肋骨數(shù)的主效標(biāo)記及其在豬育種中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個位于豬7號染色體上的增加豬肋骨數(shù)的主效標(biāo)記及其在種豬遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用實時定量TaqMan PCR技術(shù)和PCR擴增后直接電泳的技術(shù)分別對g.103458678_103458679ins291主效突變位點進行基因型判定，利用標(biāo)記輔助選擇(MAS)選擇有利基因型對個體留種，可以提高商業(yè)豬種和中國地方豬種每個個體平均約1根的肋骨數(shù)量，從而增加豬的體長暨產(chǎn)肉量。
【專利說明】兩個增加豬肋骨數(shù)的主效標(biāo)記及其在豬育種中的應(yīng)用
[0001] 本申請為2012年12月04日提交的申請?zhí)枮?01210509536. 7的同名中國發(fā)明專 利申請的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及動物遺傳育種領(lǐng)域，尤其是涉及兩個增加豬肋骨數(shù)的主效標(biāo)記及其在 種豬遺傳改良中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 豬屬于脊椎動物，豬的脊椎分為頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎，豬的頸椎、薦椎和 尾椎數(shù)相對固定，而胸椎和腰椎數(shù)存在差異，胸椎又俗稱肋骨。豬肋骨數(shù)是重要的經(jīng)濟性 狀，且其遺傳力高達0.6以上。肋骨數(shù)與豬的胴體長顯著相關(guān)，隨著肋骨數(shù)的增加，豬的胴 體長也在相應(yīng)的增長，每增加一根肋骨數(shù)可使體長增加80_左右，豬的產(chǎn)肉量也因此得到 了相應(yīng)的增加。
[0004] 申請人:前期利用構(gòu)建的大規(guī)模白色杜洛克豬X二花臉豬&資源群體，測定了 1029頭F 2屠宰個體的脊椎數(shù)表型，通過全基因組掃描檢測到了 7號染色體上影響豬肋骨數(shù) 的主效基因位點（QTL)，初步定位的區(qū)間大小為900kb。
[0005] 鑒于以上背景情況， 申請人:通過白色杜洛克豬X二花臉豬匕資源群體、二花臉 豬X通城豬F 2資源群體和蘇太豬群體的全基因組關(guān)聯(lián)（GWAS)分析和后裔同源相同（IBD) 分析，將QTL區(qū)間縮小到100kb。對該區(qū)域開展重測序、多態(tài)位點的搜尋、鑒別及其與豬肋骨 數(shù)相關(guān)性的研究，以期建立高效準(zhǔn)確的基因育種技術(shù)開展豬肋骨數(shù)的選育工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供兩個增加豬肋骨數(shù)的主效標(biāo)記，S卩：序列表SEQ ID NO: 1所示的位于豬7號染色體上的基因變異序列，序列標(biāo)注位置為2401的A2401-C2401的 核苷酸突變；序列表SEQ ID NO: 1中序列標(biāo)注位置為3678和3679之間的一個291個核苷 酸的插入突變。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)檢測這兩個主效標(biāo)記，判定攜帶增加肋骨數(shù)有利 等位基因的個體。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是增加豬肋骨數(shù)的主效標(biāo)記在種豬遺傳改良中的應(yīng)用，即利 用所鑒別的主效標(biāo)記信息開展種豬選育，選擇導(dǎo)致豬肋骨數(shù)更多的基因型個體留種，以提 高種豬的肋骨數(shù)、胴體長和產(chǎn)肉量。
[0008] 為此，本發(fā)明第一個方面提供了一種主效標(biāo)記，該主效標(biāo)記的序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，其中在該序列第3678和3679之間的位置為一個291個核苷酸的插入突變。
[0009] 本發(fā)明第二個方面提供了本發(fā)明第一個方面所述的主效標(biāo)記在蘇太豬，由杜洛克 豬、長白豬和大白豬雜交獲得的西方三元雜交商品豬，杜洛克豬和二花臉豬的雜交豬以及 二花臉豬和通城豬的雜交豬的豬肋骨數(shù)鑒定中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第一個目的是這樣實現(xiàn)的： toon] 1、實驗動物和表型測定
[0012] 本發(fā)明所使用的豬群體共有4個：白色杜洛克豬X二花臉豬&資源群體、二花臉 豬X通城豬F 2資源群體、蘇太豬（50%杜洛克豬和50%太湖豬血緣）群體和三元雜（杜 洛克豬X長白豬X大白豬）群體。
[0013] 白色杜洛克豬X二花臉豬F2資源群體以2頭白色杜洛克公豬和17頭二花臉母 豬為祖代繁殖Fi代，選9頭Fi公豬與59頭Fi母豬分6批次互交產(chǎn)生1912頭F 2個體，其中 918頭匕個體在240±3日齡屠宰以記錄肋骨數(shù)表型數(shù)據(jù)。
[0014] 二花臉豬X通城豬F2資源群體以1頭二花臉公豬和1頭通城母豬交配得到2頭 匕公豬和7頭匕母豬，匕后代互交后產(chǎn)生61頭F 2個體，所有F2個體在60日齡屠宰以記錄 肋骨數(shù)表型數(shù)據(jù)。
[0015] 蘇太豬是一個中國培育品種，它是由中國太湖豬和西方杜洛克豬種通過超過18 個世代的培育而獲得的豬種（各含50%太湖豬和50%杜洛克豬的血緣）；本發(fā)明中，4頭蘇 太公豬與55頭蘇太母豬交配獲得461頭后代，其中的435頭在240±3日齡屠宰以記錄肋 骨數(shù)表型數(shù)據(jù)。此外，1403頭195±3日齡的三元雜商品豬的樣本和肋骨數(shù)表型數(shù)據(jù)分9個 批次從位于南昌蔣巷的江西國鴻有限公司屠宰場獲得。
[0016] 2、豬全基因組60K SNP判型
[0017] 從上述4個實驗群體中的每個個體采集一小塊耳樣、用標(biāo)準(zhǔn)苯酚-氯仿法提取全 基因組DNA，經(jīng)Nanodrop-100分光光度計檢測質(zhì)量后統(tǒng)一將濃度稀釋至50ng/μ 1，送北京 怡美通德有限公司在Illumina Beadstration平臺上根據(jù)公司標(biāo)準(zhǔn)流程進行豬全基因組 60K SNP芯片（Illumina,美國）基因型判定。利用R語言GenABEL包中checkmarker對所 有樣本60K芯片掃描分型數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，對于SNP檢出率低于95 %、家系孟德爾錯誤率 高于0. 1、最小等位基因頻率小于0. 1和哈代-溫伯格平衡顯著性水平高于ΚΓ6的個體信 息將被剔除。
[0018] 3、全基因組關(guān)聯(lián)（GWAS)分析
[0019]為了消除群體層化效應(yīng)，本發(fā)明采用線性混合模型單點回歸分析并結(jié)合R程序中 的GenABEL軟件包進行GWAS分析。對于meta-analysis (整合分析），每個位點在3個群體 中的X2值整合在一起計算新的X2值?；蚪M水平的顯著區(qū)域采用保守的Bonferrini校 正方法確定，即基因組顯著水平閾值為0.05。GWAS分析結(jié)果如圖1所示，從圖1中可知，3 個不同群體GWAS及meta-analysis的分析結(jié)果均將影響豬肋骨數(shù)的位點定位在7號染色 體上。通過L0D (似然函數(shù)比值的對數(shù)）值下降2的方法，根據(jù)3個實驗群體共享的置信區(qū) 間，將GWAS定位的影響肋骨數(shù)的主效位點確定在7號染色體上一個947kb的范圍內(nèi)，該區(qū) 域?qū)?yīng)于國際豬基因組參考序列（10. 2版本）7號染色體的103. 37Mb至104. 31Mb的區(qū)間。
[0020] 4、后裔同源（IBD)定位分析
[0021] 采用標(biāo)記輔助分離分析方法判定白色杜洛克豬X二花臉豬F2資源群體、二花臉 豬X通城豬F 2資源群體、蘇太豬的匕和Fi公豬QTL基因型。每頭具有后裔表型測定豬只 的QTL基因型由Z值決定，Z值為似然率比值L H1/LHQ的Log值，H。假定雙等位基因QTL基 因型為純合子QQ或qq，氏為雜合子Qq。當(dāng)Z〈-2時，QTL基因型為QQ或qq ;當(dāng)Z>2時，QTL 基因型為Qq ;當(dāng)-2〈Z〈2時，QTL基因型不能確定。通過simwalk2程序構(gòu)建成功推導(dǎo)出QTL 基因型個體的單倍型，并通過搜尋Q染色體共享的單倍型以縮小QTL區(qū)域。為將IBD區(qū)域 縮小到盡可能小的區(qū)間內(nèi)，本發(fā)明中首先使用60K高密度SNP芯片掃描數(shù)據(jù)進行IBD分析， 具體結(jié)果見圖2A。從該圖可知，IBD區(qū)間被確定在SNP INRA0027623和ASGA0035500之 間。為了將IBD區(qū)間進一步縮小，在SNP INRA0027623和ASGA0035500之間的豬基因組序 列通過 Ensembl 網(wǎng)站（ http://asia.ensembl.org/index.html)下載后，每隔約 20000bp 用 公用的Primer3. 0或Primer5. 0軟件設(shè)計一對引物（共12對引物，見表1)對35個已知 QTL基因型的個體進行PCR擴增。25 μ L的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)體系中，包括40ng 豬基因組DNA，1.0mM MgCl2,0.2mM dNTP，正反向引物各10pmol，2.5單位DNA聚合酶（Taq 酶）及1XPCR buffer (緩沖液）（上海博采公司）。PCR采用Touchdown程序，擴增條件 為：％°C 5min ;94°C 3〇s，68°C (每個循環(huán)降 0· 5°C )3〇s，72°C 45s，26 個循環(huán)；94°C 3〇s， 55°C 30s，72°C 45s，14 個循環(huán)；最后在 72°C延伸 lOmin。PCR 擴增產(chǎn)物采用 QIAquick DNA 純化試劑盒（QIAGEN，Hilden，德國）純化后委托上海生工生物工程有限公司直接測序，測 序結(jié)果利用公用的DNAStar的SeqMan軟件進行分析。對新獲得的SNP信息再次進行IBD分 析，Q染色體共享的區(qū)域如圖2B所示，從圖2B中可知，QTL區(qū)間被準(zhǔn)確定位于一個lOOkb (位 于 SNP103451019T>G 和 SNP103552163G>A 之間）的區(qū)間內(nèi)。
[0022] 表1豬7號染色體主效位點IBD區(qū)間內(nèi)SNP掃描引物
[0023]

【權(quán)利要求】
1. 一種主效標(biāo)記，其特征在于：該主效標(biāo)記的序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，其中在 該序列第3678和3679之間的位置為一個291個核苷酸的插入突變。
2. 權(quán)利要求1所述的主效標(biāo)記在蘇太豬，由杜洛克豬、長白豬和大白豬雜交獲得的西 方三元雜交商品豬，杜洛克豬和二花臉豬的雜交豬以及二花臉豬和通城豬的雜交豬的豬肋 骨數(shù)鑒定中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104232630SQ201410419679
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月4日
【發(fā)明者】任軍, 黃路生, 幸宇云, 張志燕, 艾華水 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)