同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的三重實(shí)時(shí)熒光pcr方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法及試劑盒，試劑盒包括：無(wú)乳鏈球菌的檢測(cè)引物對(duì)如序列表SeqIDNo.1和2所示及探針如序列表SeqIDNo.3所示，停乳鏈球菌的檢測(cè)引物對(duì)如序列表SeqIDNo.4和5所示及探針SeqIDNo.6所示，海豚鏈球菌的檢測(cè)引物對(duì)如序列表SeqIDNo.7和8及探針SeqIDNo.9所示、三種陽(yáng)性對(duì)照品如序列表SeqIDNo.16、17和18所示，陰性對(duì)照品(ddH2O)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增所需的PCR緩沖液，dNTP，TaqDNAPolymerase。該方法簡(jiǎn)單快速、特異性好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的三重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 鏈球菌屬（Streptococcus )是一個(gè)具有龐大種群的屬，該屬已發(fā)現(xiàn)至少有60 多個(gè)菌種和亞種，在水生動(dòng)物中致病性鏈球菌屬病原菌種群種類(lèi)并不多，從養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)上已 經(jīng)分離到的鏈球菌有海豚鏈球菌（S. iniae)、難辨鏈球菌（S. diffucilis )、無(wú)乳鏈球菌（ S. agalactiae )、米氏鏈球菌（S. milleri )、副乳房鏈球菌（S.parauberis )、停乳鏈 球菌（S. dysgalactiae )，但已報(bào)道的致病性鏈球菌主要是無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海 豚鏈球菌，可引起多種海、淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)病，在世界各主要魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖國(guó)家均有發(fā)生，對(duì)溫帶和 熱帶、亞熱帶地區(qū)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)危害尤為嚴(yán)重，已有6大洲的23個(gè)國(guó)家報(bào)道了魚(yú)類(lèi)鏈球菌病。 目前，魚(yú)類(lèi)鏈球菌病已經(jīng)成為一種呈世界性分布的疾病，每年給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大 的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前，針對(duì)無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海豚鏈球菌的檢測(cè)通常采用常規(guī)增菌培養(yǎng)、 生化鑒定及自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)方法相結(jié)合，存在工序繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度不 高、檢出效率低、假陰性普遍等缺點(diǎn)。因此，發(fā)展操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、靈敏度高且易推廣的 檢測(cè)方法，對(duì)魚(yú)類(lèi)鏈球菌病進(jìn)行早診斷和早預(yù)防，提高水產(chǎn)品質(zhì)量和保障人類(lèi)健康均具有 重要意義。
[0004] 實(shí)時(shí)突光定量 PCR 技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, Real Time PCR)從眾多檢測(cè)技術(shù)中脫穎而出，它不僅具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu) 點(diǎn)，而且與常規(guī)PCR方法相比，由于引物和探針的"雙保險(xiǎn)"，因此特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度 更高，并實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，PCR擴(kuò)增過(guò)程無(wú)需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，有效地解決 了 PCR產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性及不能準(zhǔn)確定量的問(wèn)題，因而成為檢測(cè)領(lǐng)域越來(lái)越重要的一 種檢測(cè)手段。但是，熒光定量PCR技術(shù)只能檢測(cè)一個(gè)靶標(biāo)。
[0005] 多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)是在熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新技術(shù)，它強(qiáng)調(diào) 在同一個(gè)反應(yīng)體系里同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)。最近已有多項(xiàng)研究將多重定量PCR技術(shù)應(yīng)用于細(xì) 菌檢測(cè)領(lǐng)域。Andrea G.等建立了大腸桿菌0157:H7、沙門(mén)氏菌和單細(xì)胞增生李斯特氏菌多 重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，Moniserrat E.等建立了魚(yú)類(lèi)和水產(chǎn)品中副溶血弧菌、霍亂弧菌等5 種弧菌的多重PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示多重PCR體系與單一擴(kuò)增結(jié)果在靈敏度和特異性方 面基本相同。但是到目前為止，尚無(wú)報(bào)道有同時(shí)檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海豚鏈球菌 的試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于以上不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種能同時(shí)檢測(cè)水生動(dòng)物主要三種致 病性鏈球菌無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和海豚鏈球菌的多重定量Taqman PCR方法，同時(shí)基于 該方法提供相應(yīng)的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)的： 1、一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的引物對(duì)及探針， 無(wú)乳鏈球菌： 上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No. 1所示， 下引物〇口8?-1^，如序列表569 10 1^〇.2所示， 探針cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No. 3所示； 停乳鏈球菌： 上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No. 4所示， 下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No. 5所示， 探針MIG-PROBE，如序列表Seq ID No. 6所示； 海豚鏈球菌： 上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No. 7所示， 下引物16SrRNA_RP，如序列表Seq ID No. 8所示， 探針16SrRNA-PR0BE，如序列表Seq ID No. 9所示； cpsF-PROBE探針，MIG-PR0BE探針和16SrRNA-PR0BE探針的5'端標(biāo)記的熒光素不同， 分別為FAM、HEX和R0X。
[0008] 2、一種含有如上所述的一種利用實(shí)時(shí)突光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的引物 對(duì)及探針的試劑盒。
[0009] 3、一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的陽(yáng)性對(duì)照品PCR擴(kuò)增引物 對(duì)， 無(wú)乳鏈球菌： 上引物SA-F，如序列表Seq ID No. 10所示， 下引物SA-R，如序列表Seq ID No. 11所示； 停乳鏈球菌： 上引物SD-F，如序列表Seq ID No. 12所示， 下引物SD-R，如序列表Seq ID No. 13所示； 海豚鏈球菌： 上引物SI-F，如序列表Seq ID No. 14所示， 下引物SI-R，如序列表Seq ID No. 15所示。
[0010] 4、一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的陽(yáng)性對(duì)照品， pMD-T-cpsF，如序列表 Seq ID No. 16 所不； pMD-T-MIG，如序列表 Seq ID No. 17 所示； pMD-T_16SrRNA，如序列表 Seq ID No. 18 所示。
[0011] 5、如上所述的一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的引物對(duì)及探針， 檢測(cè)鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系如下 ：

【權(quán)利要求】
1. 一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的引物對(duì)及探針，其特征在于， 無(wú)乳鏈球菌： 上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No. 1所示， 下引物〇口8?-1^，如序列表569 10 1^〇.2所示， 探針cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No. 3所示； 停乳鏈球菌： 上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No. 4所示， 下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No. 5所示， 探針MIG-PROBE，如序列表Seq ID No. 6所示； 海豚鏈球菌： 上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No. 7所示， 下引物16SrRNA_RP，如序列表Seq ID No. 8所示， 探針16SrRNA-PR0BE，如序列表Seq ID No. 9所示； cpsF-PROBE探針，MIG-PR0BE探針和16SrRNA-PR0BE探針的5'端標(biāo)記的熒光素不同， 分別為FAM、HEX和R0X。
2. -種含有如權(quán)利要求1所述的一種利用實(shí)時(shí)突光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的引 物對(duì)及探針的試劑盒。
3. -種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的陽(yáng)性對(duì)照品PCR擴(kuò)增引物對(duì)，其 特征在于， 無(wú)乳鏈球菌： 上引物SA-F，如序列表Seq ID No. 10所示， 下引物SA-R，如序列表Seq ID No. 11所示； 停乳鏈球菌： 上引物SD-F，如序列表Seq ID No. 12所示， 下引物SD-R，如序列表Seq ID No. 13所示； 海豚鏈球菌： 上引物SI-F，如序列表Seq ID No. 14所示， 下引物SI-R，如序列表Seq ID No. 15所示。
4. 一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的陽(yáng)性對(duì)照品，其特征在于， pMD-T-cpsF，如序列表 Seq ID No. 16 所不； pMD-T-MIG，如序列表 Seq ID No. 17 所示； pMD-T_16SrRNA，如序列表 Seq ID No. 18 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的引物對(duì)及 探針，其特征在于，檢測(cè)鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系如下 ：

擴(kuò)增反應(yīng)條件均為: Step 1 95 °C 15min ； Step 2 94°C 60s Step 3 60°C 60s Step 4 讀數(shù)，Go to Step 2 for 40 個(gè)循環(huán)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的陽(yáng)性對(duì)照 品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) PCR模板的制備：三種鏈球菌基因組DNA的提取和純化， (2) 選擇無(wú)乳鏈球菌cpsF基因作為靶基因，步驟（2)中，三種靶基因的PCR反應(yīng)體系 均如下：
，？〇?的反應(yīng)條件均為：預(yù)變性951：51^11;941：158、57.61：2〇8、721：3〇8,35個(gè)循 環(huán)；終延伸72°C lOmin ; 設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增引物： 上引物SA-F，如序列表Seq ID No. 10所示， 下引物SA-R，如序列表Seq ID No. 11所示，并進(jìn)行靶基因的PCR擴(kuò)增； 選擇停乳鏈球菌MIG基因作為靶基因，設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增引物：上引物SD-F， 如序列表Seq ID No. 12所示， 下引物SD-R，如序列表Seq ID No. 13所示，并進(jìn)行靶基因的PCR擴(kuò)增； 選擇海豚鏈球菌16SrRNA基因作為靶基因，設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照品的PCR擴(kuò)增引物： 上引物SI-F，如序列表Seq ID No. 14所示， 下引物SI-R，如序列表Seq ID No. 15所示，并進(jìn)行靶基因的PCR擴(kuò)增； (3) 陽(yáng)性對(duì)照品 pMD-T-cpsF，pMD-T-MIG，pMD-T-16SrRNA 的制備； 步驟（3)中，陽(yáng)性對(duì)照品的制備過(guò)程，包括如下步驟：將步驟（2)中所得PCR產(chǎn)物與克 隆載體pMD-19-T vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)JM109,獲得陽(yáng)性克隆菌株，并制備質(zhì) 粒 pMD-T-cpsF、pMD-T-MIG 和 pMD-T-16SrRNA 作為陽(yáng)性對(duì)照品。
7. -種同時(shí)檢測(cè)三種鏈球菌的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的試劑盒，其特征在于，包括： 無(wú)乳鏈球菌： 上引物cpsF- FP，如序列表Seq ID No.l所示， 下引物〇口8?-1^，如序列表569 10 1^〇.2所示， 探針cpsF-PROBE，如序列表Seq ID No. 3所示； 停乳鏈球菌： 上引物MIG- FP，如序列表Seq ID No. 4所示， 下引物MIG- RP，如序列表Seq ID No. 5所示， 探針MIG-PROBE，如序列表Seq ID No. 6所示； 海豚鏈球菌： 上引物16SrRNA- FP，如序列表Seq ID No. 7所示， 下引物16SrRNA_RP，如序列表Seq ID No. 8所示， 探針16SrRNA-PR0BE，如序列表Seq ID No. 9所示； 三種陽(yáng)性對(duì)照品： 口]\?-1'-〇口8?，如序列表369 10 1')〇.16所不， pMD-T-MIG，如序列表 Seq ID No. 17 所示， pMD-T_16SrRNA，如序列表 Seq ID No. 18 所示， 陰性對(duì)照品（ddH20)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增所需的PCR緩沖液，dNTP，Taq DNA Polymerase。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104152572SQ201410425186
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】李丹丹, 徐義剛, 高慎陽(yáng), 蔡波 申請(qǐng)人:海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心