可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)裝置及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的方法和反應(yīng)裝置，包括：在特定的密閉反應(yīng)裝置中事先將能夠?qū)⒔沽姿岱纸鉃榱姿岬脑噭┨砑釉诤怂釘U(kuò)增反應(yīng)液當(dāng)中。待反應(yīng)結(jié)束后。在不開蓋的情況下。通過將核酸擴(kuò)增反應(yīng)液與已預(yù)先另存于裝置其他選定顯色試劑混合反應(yīng)。觀測混合物進(jìn)一步反應(yīng)后的顏色。實(shí)現(xiàn)對樣品是否發(fā)生核酸擴(kuò)增反應(yīng)作出判斷。其中選定顯色試劑為能與磷酸(根)發(fā)生顏色反應(yīng)的試劑組合。本發(fā)明方法操作簡單，快速靈敏，測試結(jié)果通過肉眼即可檢測，成本低廉，彌補(bǔ)了現(xiàn)有檢測核酸擴(kuò)增技術(shù)的不足。
【專利說明】可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)裝置及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬化學(xué)分析、核酸分析領(lǐng)域，尤其涉及一種可視化檢測核酸等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物 的反應(yīng)裝置和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)被廣泛應(yīng)用在 農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及食品工業(yè)領(lǐng)域。目前常用的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（CPA)、環(huán) 介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)、鏈置換擴(kuò)增（SDA)、依賴解旋酶的擴(kuò)增（HDA)。由于該類新型擴(kuò) 增技術(shù)能夠在較低的恒定溫度條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增(大部分恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)所需反應(yīng)溫度在 60°C或者37°C左右)，因此擺脫了傳統(tǒng)PCR所需要的精密的溫控設(shè)備，大大縮小成本，受到 廣泛關(guān)注。
[0003] 用于核酸恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測的方法，目前主要有電泳、熒光染料、濁度、免疫試紙 條等。其中，凝膠電泳法需要有開蓋的操作，因此容易造成氣溶膠污染，并且需要用到高致 癌性的熒光染料危害人體健康；熒光法檢測需要特殊、龐大、昂貴的光學(xué)儀器；而濁度法雖 然能能夠使用肉眼觀測，但是對核酸擴(kuò)增效率要求較高，要求核酸擴(kuò)增產(chǎn)量達(dá)到最低肉眼 可見濁度并且容易受到主觀因素的影響，并不適用于所有的恒溫?cái)U(kuò)增檢測。因此，該領(lǐng)域需 要開發(fā)新的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法。可視化檢測具有簡單、直接、便于大通量篩查的特點(diǎn)， 可以擺脫復(fù)雜的儀器設(shè)施，對檢測結(jié)果做出判斷。目前有鈣黃綠素?zé)晒饽恳暦?，HNB法。這 兩種方法是利用金屬指示劑間接或是直接地檢測反應(yīng)體系中的金屬離子濃度，從而發(fā)生顏 色變化，具體來講，分別是從橘色變?yōu)榫G色或是從紫色變?yōu)樘焖{(lán)色。因此，目前可視化檢測 核酸擴(kuò)增的方法具有不可避免的缺點(diǎn)：1.金屬指示劑容易受到樣品中其他金屬離子的影 響，造成誤差；2.陽性反應(yīng)結(jié)果是從一種顏色到另外一種顏色，不利于肉眼觀察；3.檢測對 象是反應(yīng)液中初始濃度較高的金屬離子，因此會(huì)具有較高的背景信號(hào)降低檢測靈敏度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)裝置，可實(shí)現(xiàn)在不 打開蓋的情況下，使得核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)能夠不受干擾地進(jìn)行，之后進(jìn)行的檢測反應(yīng)能夠 按序正常進(jìn)行。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置，包括反應(yīng)容器，其特征在于所述反應(yīng) 容器具備多個(gè)相互獨(dú)立但是連通的儲(chǔ)液區(qū)域，其中一個(gè)區(qū)域用于進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)， 盛放核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，其它區(qū)域的全部或部分用于盛放用于核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物 可視化檢測的試劑（以下簡稱為產(chǎn)物檢測試劑)，所述反應(yīng)裝置具有所述反應(yīng)容器的蓋，以 保持密封性。本發(fā)明反應(yīng)裝置的獨(dú)立、分隔但連通的儲(chǔ)液區(qū)域保證核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液和 產(chǎn)物檢測試劑在反應(yīng)前相互獨(dú)立、互不干擾地盛放在裝置的不同區(qū)域；在不開蓋的情況下， 通過劇烈搖晃或是震動(dòng)、顛倒等操作下，不同區(qū)域預(yù)存儲(chǔ)的液體才混合均勻用于可視化檢 測。
[0005] 進(jìn)一步地，所述反應(yīng)容器為多個(gè)試管并列連為一體的試管組，試管組中試管的上 部連通；試管在連通部位以下的區(qū)域?yàn)樗鰞?chǔ)液區(qū)域。
[0006] 所述用于進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的儲(chǔ)液區(qū)域的容積小于等于80ul大于等于 10ul。
[0007] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑中的不同試劑在檢測反應(yīng)前放在不同 的儲(chǔ)液區(qū)域中，所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑總體積優(yōu)選地在9(T450ul之間， 更優(yōu)選地在，9(T270ul之間。
[0008] 所述多個(gè)能區(qū)分但是連通的儲(chǔ)液區(qū)域的數(shù)量，優(yōu)選為2-5個(gè)，更優(yōu)選地為2-4個(gè)。
[0009] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的方法。為此，本發(fā)明采 用以下技術(shù)方案： 其采用上述的反應(yīng)裝置作為核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及用于可視化檢測恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果的反 應(yīng)的反應(yīng)器； 所述方法利用所述反應(yīng)裝置提供的封閉的反應(yīng)器中用于核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的儲(chǔ)液空 間進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，并將進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物可視化檢測的試劑一一預(yù)先儲(chǔ) 放在所述反應(yīng)器中的其它儲(chǔ)液區(qū)域中，進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液中含有將焦磷酸根 分解為磷酸根的試劑，所述進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物可視化檢測的試劑是指能與磷酸根 進(jìn)行反應(yīng)的顯色試劑； 在核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程中，核酸擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸根被分解為磷酸根，核酸恒溫?cái)U(kuò) 增反應(yīng)結(jié)束后，在依舊封閉反應(yīng)器的情況下，將反應(yīng)器內(nèi)的所有液體混勻，觀察反應(yīng)器內(nèi)是 否發(fā)生顏色變化，根據(jù)反應(yīng)器內(nèi)的液體顏色是否符合顯色試劑與磷酸根發(fā)生反應(yīng)后應(yīng)當(dāng)體 現(xiàn)的顏色來對核酸恒溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行可視化檢測。
[0010] 所述核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑包含核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)混合液和無機(jī)焦磷酸酶；其 中核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)混合液可以來自于商業(yè)化核酸恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，例如廣州迪澳PA101 Nos基因核酸檢測試劑盒；無機(jī)焦磷酸酶是可以將焦磷酸水解生成磷酸根的酶，優(yōu)選為耐 熱型的無機(jī)焦磷酸酶。
[0011] 所述核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可以為擴(kuò)增溫度低于90° C的擴(kuò)增反應(yīng)，可以為交叉引物 恒溫?cái)U(kuò)增（CPA)，也可以是環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)。所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可以在水浴、金屬浴 或其他加熱條件下進(jìn)行。
[0012] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑中的不同試劑在反應(yīng)前放在不同的儲(chǔ) 液區(qū)域中，總體積優(yōu)選地在9(T450ul之間，更優(yōu)選地在，9(T270ul之間。所述用于可視化核 酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑可以是還原劑溶液和鑰酸鹽-酒石酸銻鉀酸性溶液組合(組合一)， 或者鑰酸鹽酸性溶液和孔雀石綠溶液組合(組合二)，總的體積在上述體積范圍之內(nèi)，有需 要可以用水或是Tris-HCl緩沖液補(bǔ)充。
[0013] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，鑰酸鹽溶液的配置可使用鑰酸 銨或鑰酸鈉，優(yōu)選鑰酸銨。
[0014] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，酸為純硫酸、硝酸，優(yōu)選地為濃 硫fe。
[0015] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，還原劑溶液是由抗壞血酸或氯 化亞錫配置，優(yōu)選為抗壞血酸。
[0016] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，抗壞血酸溶液中抗壞血酸的含 量為(λ 2?lmg，優(yōu)選地(λ 2?(λ 8mg，更優(yōu)地(λ 2?(λ 6mg。
[0017] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，鑰酸鹽-酒石酸銻鉀溶液中 鑰酸銨的含量為0. 1?0. 5mg,優(yōu)選地0. 1?0. 4mg,更優(yōu)地0. 1?0. 3mg ;酒石酸鉀鋪的含量為 2. 67?13. 35ng，優(yōu)選地2. 67?10. 68ng、更優(yōu)地2. 67?8. Olng ;硫酸的含量為1. 96g?9. 8g，優(yōu) 選地1. 96g?7. 84g、更優(yōu)地L 96g?5. 88g。
[0018] 所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，鑰酸鹽酸溶液中鑰酸銨的 含量為0· 58mg?2. 9mg，優(yōu)選地0· 58mg?2. 32mg，更優(yōu)地0· 58mg?1. 74mg ;硫酸的含量為 8. 82mg?44. lmg，優(yōu)選地8. 82mg?35. 28mg，更優(yōu)地8. 82mg?26. 46mg。所述用于可視化核酸恒 溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，孔雀石綠溶液中孔雀石綠的含量為4. 635ng~23. 175ng，優(yōu)選地 4. 635ng?18. 54ng，更優(yōu)地4. 635ng?13. 905ng。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明還可形成一種 專用于可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的試劑裝置，其包括上述反應(yīng)裝置，反應(yīng)裝置中的用于可 視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑的總體積在9(T450ul之間，用于進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的 儲(chǔ)液區(qū)域的容積小于等于80ul大于等于10ul，其各項(xiàng)試劑的組合及含量如前所述。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種既能符合核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件又能 符合生產(chǎn)磷酸根反應(yīng)和磷酸根檢測反應(yīng)條件的反應(yīng)裝置可以實(shí)現(xiàn)在不打開反應(yīng)容器的條 件下，通過對不同溶液混合，檢測核酸擴(kuò)增反應(yīng)過程中磷酸根的產(chǎn)生，間接可視化檢測核酸 恒溫?cái)U(kuò)增：對于陰性樣本，整個(gè)檢測過程中不產(chǎn)生磷酸根，因此反應(yīng)液呈無色，而對于陽性 樣本，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，焦磷酸根作為副產(chǎn)物不斷產(chǎn)生，并在無機(jī)焦磷酸酶的作用下被 分解為磷酸根，從而與顯色試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，反應(yīng)液呈藍(lán)色。因此該發(fā)明具有以下特 點(diǎn)，首先，核酸擴(kuò)增的檢測不存在開蓋操作，不會(huì)造成交叉污染；其次，核酸擴(kuò)增檢測的可視 化使得該方法不需要特殊的儀器，并且該發(fā)明的顏色是由無色變化為藍(lán)色，因此很容易用 肉眼分辨；再次，該發(fā)明是通過檢測核酸擴(kuò)增過程中磷酸根的生成判斷核酸擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn) 行，具有較低的背景干擾，有利于對結(jié)果的準(zhǔn)確判定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖la為用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置實(shí)施例1的示意圖 圖lb為用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置實(shí)施例1的立體圖。
[0021] 圖2a為用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置實(shí)施例2的示意圖。
[0022] 圖2b為用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置實(shí)施例2的立體圖。
[0023] 圖3a為用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置實(shí)施例3的示意圖。
[0024] 圖3b為用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置實(shí)施例3的立體圖。
[0025] 圖4a為實(shí)例1的CPA恒溫?cái)U(kuò)增體系陽性樣品和陰性樣品可視化檢測結(jié)果對照圖。
[0026] 圖4b為實(shí)例5的LAMP恒溫?cái)U(kuò)增體系陽性樣品和陰性樣品可視化檢測結(jié)果對照 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 如圖la、lb、2a、2b、3a和3b所示，本發(fā)明所提供的用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測 的反應(yīng)裝置包括反應(yīng)容器1，所述反應(yīng)容器1具備多個(gè)相互獨(dú)立但是連通的儲(chǔ)液區(qū)域，圖la 和lb所顯示的實(shí)施例1中具有三個(gè)儲(chǔ)液區(qū)域分別為a、b、c，圖2a和2b所顯示的實(shí)施例2 中具有四個(gè)儲(chǔ)液區(qū)域分別為a、b、c、d，圖3a和3b所顯示的實(shí)施例3中具有五個(gè)儲(chǔ)液區(qū)域 分別為a、b、c、d、e，其中一個(gè)區(qū)域（比如區(qū)域a)用于進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，盛放核酸恒溫 擴(kuò)增反應(yīng)試劑，其它區(qū)域的全部或部分用于盛放用于核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物可視化檢測的 試劑，所述反應(yīng)裝置具有所述反應(yīng)容器的蓋10,以保持密封性。
[0028] 在實(shí)施中，所述反應(yīng)容器1為多個(gè)試管并列連為一體的試管組，試管組中試管的 上部連通；試管在連通部位20以下的區(qū)域?yàn)樗鰞?chǔ)液區(qū)域。
[0029] 下面將結(jié)合上述反應(yīng)裝置實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的介紹，但并不局限于此。
[0030] 實(shí)例1 :本發(fā)明用于可視化交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增（CPA)檢測轉(zhuǎn)基因終止子T-Nos基 因。
[0031] 反應(yīng)前試劑準(zhǔn)備：在實(shí)施例1反應(yīng)器的a區(qū)域，添加9ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引 物、dNTP、Tris-HCl緩沖液、Mg 2+、NH4+、模板，來自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公司轉(zhuǎn)基因 N0S序列 恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，貨號(hào)1016-01)，和lul 0. lU/ul的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自New England Biolabs，貨號(hào)M0296s) ;b區(qū)域添加2ul 10%的抗壞血酸溶液和8ul水；c區(qū)域添加4ul鑰 酸銨-酒石酸鉀銻溶液(包含21mM鑰酸銨，2mM酒石酸鉀銻，5M硫酸）和76ul水。
[0032] 核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行：將上述裝置置于63° C水浴加熱lh。
[0033] 可視化檢測恒溫?cái)U(kuò)增：反應(yīng)完成后，顛倒裝置一，使得3個(gè)區(qū)域的液體充分混合， 1〇!1^11后判斷結(jié)果 ：陽性為藍(lán)色（圖4&，4)，陰性為無色（圖4&，3)。
[0034] 實(shí)例2 :本發(fā)明用于可視化交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增（CPA)檢測轉(zhuǎn)基因終止子T-Nos基 因。
[0035] 核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行：將上述裝置置于63° C金屬浴加熱lh。其他同實(shí)施例1。
[0036] 實(shí)例3 :本發(fā)明用于可視化交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增（CPA)檢測金黃色葡萄球菌。
[0037] 反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl緩沖液、Mg2+、NH 4+、模板，來自杭州優(yōu)思 達(dá)生物技術(shù)有限公司金黃色葡萄球菌恒溫?cái)U(kuò)增核酸試劑盒，貨號(hào)1011-01)。其他同實(shí)施例 1〇
[0038] 實(shí)例4 :本發(fā)明用于可視化交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增（CPA)檢測沙門氏菌。
[0039] 反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl緩沖液、Mg2+、Ml/、模板，來自杭州優(yōu)思 達(dá)生物技術(shù)有限公司沙門氏菌恒溫?cái)U(kuò)增核酸試劑盒，貨號(hào)1047-01)。其他同實(shí)施例1。
[0040] 實(shí)例5 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測轉(zhuǎn)基因終止子T-Nos基因。
[0041] 在實(shí)施例1反應(yīng)器的a區(qū)域，添加9ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl緩 沖液、Mg 2+、Ml/、模板，來自廣州迪澳N0S基因核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào)PA 101S )， 和lul 0. lU/ul的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自New England Biolabs，貨號(hào)M0296s);b區(qū)域添 加2ul 10%的抗壞血酸溶液和8ul水；c區(qū)域添加4ul鑰酸銨-酒石酸鉀銻溶液(包含21mM 鑰酸銨，2mM酒石酸鉀銻，5M硫酸）和76ul水。其他同實(shí)施例1。
[0042] 可視化檢測恒溫?cái)U(kuò)增：反應(yīng)完成后，顛倒實(shí)施例1反應(yīng)器，使得3個(gè)區(qū)域的液體充 分混合，1〇11^11后判斷結(jié)果 ：陽性為藍(lán)色（圖你，4)，陰性為無色（圖你，3)。
[0043] 實(shí)例6 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測沙門氏菌。
[0044] 在實(shí)施例1反應(yīng)器的a區(qū)域，添加19ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl 緩沖液、Mg2+、NH4+、模板，來自廣州迪澳沙門氏菌核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào) FA105S)，和 lul 0· lU/ul 的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自 New England Biolabs，貨號(hào) M0296s); b區(qū)域添加 4ul 10%的抗壞血酸溶液和16ul水；c區(qū)域添加 8ul鑰酸銨-酒石酸鉀銻溶液 (包含21mM鑰酸銨，2mM酒石酸鉀鋪，5M硫酸）和152ul水。其他同實(shí)施例1。
[0045] 實(shí)例7 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測金黃色葡萄球菌。
[0046] 在實(shí)施例2反應(yīng)器的a區(qū)域，添加 29ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl 緩沖液、Mg2+、NH4+、模板，來自廣州迪澳金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào) FA109S)，和 lul 0· lU/ul 的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自 New England Biolabs，貨號(hào) M0296s); b區(qū)域添加 6ul 10%的抗壞血酸溶液和24ul水；c區(qū)域添加 12ul鑰酸銨-酒石酸鉀銻溶 液(包含21mM鑰酸銨，2mM酒石酸鉀銻，5M硫酸)和108ul水；d區(qū)域添加 120ul水。其他同 實(shí)施例1。
[0047] 實(shí)例8 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測銅綠假單胞菌。
[0048] 在實(shí)施例2反應(yīng)器的a區(qū)域，添加 39ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl 緩沖液、Mg2+、NH4+、模板，來自廣州迪澳銅綠假單細(xì)胞菌核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào) FA112S)，和 lul 0· lU/ul 的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自 New England Biolabs，貨號(hào) M0296s); b區(qū)域添加 8ul 10%的抗壞血酸溶液和32ul水；c區(qū)域添加 16ul鑰酸銨-酒石酸鉀銻溶 液(包含21mM鑰酸銨，2mM酒石酸鉀銻，5M硫酸)和144ul水；d區(qū)域添加 160ul水。其他同 實(shí)施例1。
[0049] 實(shí)例9 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測銅綠假單胞菌。
[0050] 在實(shí)施例3反應(yīng)器的a區(qū)域，添加 49ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl 緩沖液、Mg2+、NH4+、模板，來自廣州迪澳銅綠假單細(xì)胞菌核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào) FA112S)，和 lul 0· lU/ul 的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自 New England Biolabs，貨號(hào) M0296s); b區(qū)域添加 10ul 10%的抗壞血酸溶液和40ul水；c區(qū)域添加 16ul鑰酸銨-酒石酸鉀銻溶 液(包含21mM鑰酸銨，2mM酒石酸鉀銻，5M硫酸）和144ul水；d區(qū)域添加 120ul水；e區(qū)域 添加 120ul水。其他同實(shí)施例1。
[0051] 實(shí)例10 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測轉(zhuǎn)基因終止子T-Nos基 因。
[0052] 在實(shí)施例1反應(yīng)器的a區(qū)域，添加9ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris_HCl緩 沖液、Mg 2+、Ml/、模板，來自廣州迪澳N0S基因核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào)PA 101S )， 和lul 0. lU/ul的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自New England Biolabs，貨號(hào)M0296s);b區(qū)域添 加5. 875ul 80mM鑰酸銨水溶液、2. 5ul濃硫酸、2ul 5mM孔雀石綠溶液以及29. 625ul水；c 區(qū)域添加50ul水。其他同實(shí)施例1。
[0053] 實(shí)例11 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測轉(zhuǎn)基因終止子T-Nos基 因。
[0054] 在實(shí)施例1反應(yīng)器的a區(qū)域，添加 19ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl 緩沖液、Mg2+、NH4+、模板，來自廣州迪澳N0S基因核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào) PA101S)，和 lul 0· lU/ul 的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自 New England Biolabs，貨號(hào) M0296s); b區(qū)域添加 11. 75ul 80mM鑰酸銨水溶液、5ul濃硫酸、4ul 5mM孔雀石綠溶液以及19. 25ul 水；c區(qū)域添加 140ul水。其他同實(shí)施例1。
[0055] 實(shí)例12 :本發(fā)明用于可視化環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)檢測轉(zhuǎn)基因終止子T-Nos基 因。
[0056] 在實(shí)施例2反應(yīng)器的a區(qū)域，添加29ul反應(yīng)擴(kuò)增液(包含有引物、dNTP、Tris-HCl 緩沖液、Mg2+、NH4+、模板，來自廣州迪澳NOS基因核酸檢測試劑盒(恒溫?zé)晒夥?，貨號(hào) PA101S)，和 lul 0· lU/ul 的耐熱無機(jī)焦磷酸酶(來自 New England Biolabs，貨號(hào) M0296s); b區(qū)域添加35. 25ul 80mM鑰酸銨水溶液、7. 5ul濃硫酸、6ul 5mM孔雀石綠溶液以及1. 25ul 水；c區(qū)域添加 llOul水；d區(qū)域添加 llOul水。其他同實(shí)施例1。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的反應(yīng)裝置，包括反應(yīng)容器，其特征在于所述反 應(yīng)容器具備多個(gè)相互獨(dú)立但是連通的儲(chǔ)液區(qū)域，其中一個(gè)區(qū)域用于進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反 應(yīng)，盛放核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，其它區(qū)域的全部或部分用于盛放用于核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) 產(chǎn)物可視化檢測的試劑，所述反應(yīng)裝置具有所述反應(yīng)容器的蓋，以保持密封性。
2. 如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)裝置，其特征在于所述反應(yīng)容器為多個(gè)試管并列連為一體 的試管組，試管組中試管的上部連通；試管在連通部位以下的區(qū)域?yàn)樗鰞?chǔ)液區(qū)域。
3. 如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)裝置，其特征在于所述用于進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的儲(chǔ)液 區(qū)域的容積小于等于80ul大于等于10ul。
4. 如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)裝置，其特征在于所述用于可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試 劑的儲(chǔ)液區(qū)域的總體適配9(T450ul的儲(chǔ)液量。
5. -種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的方法。其特征在于： 其采用權(quán)利要求1所述的反應(yīng)裝置作為核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及用于可視化檢測恒溫?cái)U(kuò) 增結(jié)果的反應(yīng)的反應(yīng)器； 所述方法利用所述反應(yīng)裝置提供的封閉的反應(yīng)器中用于核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的儲(chǔ)液空 間進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，并將進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物可視化檢測的試劑一一預(yù)先儲(chǔ) 放在所述反應(yīng)器中的其它儲(chǔ)液區(qū)域中，進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液中含有將焦磷酸根 分解為磷酸根的試劑，所述進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物可視化檢測的試劑是指能與磷酸根 進(jìn)行反應(yīng)的顯色試劑； 在核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程中，核酸擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸根被分解為磷酸根，核酸恒溫?cái)U(kuò) 增反應(yīng)結(jié)束后，在依舊封閉反應(yīng)器的情況下，將反應(yīng)器內(nèi)的所有液體混勻，觀察反應(yīng)器內(nèi)是 否發(fā)生顏色變化，根據(jù)反應(yīng)器內(nèi)的液體顏色是否符合顯色試劑與磷酸根發(fā)生反應(yīng)后應(yīng)當(dāng)體 現(xiàn)的顏色來對核酸恒溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行可視化檢測。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的方法。其特征在于：所述核酸 恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑包含核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)混合液和耐熱無機(jī)焦磷酸酶。
7. 如權(quán)利要求5所述的一種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的方法。其特征在于：所述核酸 恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)為擴(kuò)增溫度低于90° C的擴(kuò)增反應(yīng)，包括交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增（CPA)，包括環(huán)介 導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP)。
8. 如權(quán)利要求5所述的一種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的方法。其特征在于：所述用于 可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑中的不同試劑在反應(yīng)前放在不同的儲(chǔ)液區(qū)域中，所述用于 可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑是還原劑溶液和鑰酸鹽-酒石酸銻鉀酸性溶液組合，或者 鑰酸鹽酸性溶液和孔雀石綠溶液組合。
9. 如權(quán)利要求8所述的一種可視化檢測核酸恒溫?cái)U(kuò)增的方法。其特征在于：所述用于 可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的試劑組合中，還原劑溶液是由抗壞血酸或氯化亞錫配置，優(yōu)選 為抗壞血酸。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104195040SQ201410431991
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】吳堅(jiān), 張芳 申請人:浙江大學(xué)