以羊糞浸出液培養(yǎng)蛋白核小球藻的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種以羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻方法，屬水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。蛋白核小球藻營(yíng)養(yǎng)豐富，廣泛用于制造保健品、化妝品、醫(yī)藥、海產(chǎn)魚(yú)、蝦飼料，傳統(tǒng)上采用f/2培養(yǎng)液且采用敞口水泥池培養(yǎng)，生長(zhǎng)慢，易污染，成本高，效益低，現(xiàn)在我采用臥式白塑料貯水罐充氣培養(yǎng)，以羊糞浸出液為主要氮源并添加了適量硝酸銨，磷酸二氫鈉，土壤抽出液，DL蘋(píng)果酸，D-異抗壞血酸鈉，硅酸鉀，吲哚乙酸，萘乙酸，麥飯石粉，鈦溶液，谷朊粉，羥丙基甲基纖維素等營(yíng)養(yǎng)成分，不僅廢物利用，還可獲得有重要保健價(jià)值的微藻，有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥混合使用，營(yíng)養(yǎng)更全面，操作方便，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、規(guī)?；a(chǎn)，成本低，效益高，藻產(chǎn)量提高240%。
【專(zhuān)利說(shuō)明】以羊糞浸出液培養(yǎng)蛋白核小球藻的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種用羊糞浸出液培養(yǎng)蛋白核小球藻的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著養(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的羊場(chǎng)采取規(guī)?；?、集約化、工廠(chǎng)化養(yǎng) 殖，產(chǎn)生的大量羊糞也就成了亟待解決的有機(jī)垃圾資源之一。羊糞中含有病原微生物、寄生 蟲(chóng)、某些化學(xué)藥物、有毒金屬和激素等，若不及時(shí)、科學(xué)處理，不僅會(huì)惡化羊場(chǎng)衛(wèi)生環(huán)境，使 羊感染疾病，同時(shí)糞便任意排放也會(huì)造成環(huán)境污染，傳播疾病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。羊糞大 小如黃豆，黑色，近橢圓形，是一種用途極廣的動(dòng)物糞便。發(fā)酵羊糞是一種優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥，可增 高地溫、疏松土壤、改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)、防止板結(jié)，特別對(duì)改良鹽堿地和重粘土有明顯效果。 俗話(huà)說(shuō)"一斤羊糞一斤糧，萬(wàn)斤羊糞糧滿(mǎn)倉(cāng)"。羊糞質(zhì)量在六畜糞便中首屈一指。羊?qū)︼暡?擇優(yōu)而食，嫩芽、嫩草、鮮花、綠葉是其采食對(duì)象，而這部分是植物氮素集中的部位。因此，新 鮮羊糞雖含磷0. 46 %，鉀0. 23 %，和一般畜糞相差無(wú)幾，但氮素含量達(dá)0. 66 %，有機(jī)質(zhì)含量 高達(dá)30%，遠(yuǎn)超其它畜糞，氮素含量更比牛糞多一倍。一只羊全年可排糞750-1000公斤， 含氮8-9公斤,肥效相當(dāng)于35-40公斤硫酸銨,可施用1-1. 5畝土地。羊糞見(jiàn)效快，宜做追 月巴，可用來(lái)養(yǎng)花、種牧草、種茶、蔬菜、糧食和果樹(shù)。除用作農(nóng)肥，傳統(tǒng)上羊糞還有以下利用途 徑：
[0003] 1養(yǎng)殖蘑菇、口菇等食用菌?？谀⑹巧L(zhǎng)在蒙古草原上的一種白色傘菌屬野生蘑 菇，一般生長(zhǎng)在有羊骨或羊糞的地方，味道異常鮮美，由于產(chǎn)量不大，需求量大，目前是中國(guó) 市場(chǎng)上最昂貴的一種蘑菇。
[0004] 2作蚯蚓餌料。牛糞、豬糞、馬糞、羊糞、兔糞，豬，羊、兔糞加秸桿、稻草混合處理飼 喂蚯蚓，效果最好。
[0005] 3發(fā)酵生產(chǎn)沼氣。特別是規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)，羊糞量大，不僅可以發(fā)酵生產(chǎn)沼氣作燃料，沼 池廢渣還可制成有機(jī)肥，肥效高、安全方便、抗病促長(zhǎng)、改良土質(zhì)。
[0006] 4用作飼料。羊糞經(jīng)曬干、滅菌、除蟲(chóng)、去臭后，可作豬、魚(yú)等的飼料，但僅用作配料， 含量不超過(guò)20%為宜。
[0007] 5用作燃料。大部分牧區(qū)都將羊糞用作燃料，含水量30%以下的羊糞，可直接燃 燒，但須有專(zhuān)門(mén)的燒糞爐；羊糞也可發(fā)酵產(chǎn)熱，方法是將羊糞水分調(diào)整到65 %左右，通氣堆 積發(fā)酵而產(chǎn)熱，溫度可達(dá)70°C以上。在堆糞中安放金屬水管，通過(guò)水的吸熱作用回收發(fā)酵 熱，用于畜舍保溫、取暖。
[0008] 但是，羊糞以上傳統(tǒng)利用方法或多或少存在技術(shù)不成熟、效益低、操作麻煩、費(fèi)時(shí) 費(fèi)力等缺點(diǎn)，不能充分發(fā)揮羊糞的開(kāi)發(fā)潛力。為了克服這些缺點(diǎn)，我發(fā)明了一種利用羊糞浸 出液培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法。實(shí)驗(yàn)證明，用羊糞浸出液培養(yǎng)蛋白核小球藻，小球藻不僅生 長(zhǎng)快，產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)良，而且不易污染，操作方便、靈活，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、工廠(chǎng)化、程序化、規(guī) 模化生產(chǎn)，成本低，效益高，還廢物利用，變廢為寶，為羊糞開(kāi)發(fā)應(yīng)用開(kāi)辟了新途徑，使羊糞 發(fā)揮出更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0009] 蛋白核小球藻是一種低等植物，屬于綠藻門(mén)，綠藻綱，綠球藻目，小球藻屬，是本屬 唯一具有蛋白核的種。因具有蛋白核，其營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值尤其高。小球藻繁殖能力極強(qiáng)，能 利用太陽(yáng)光制造大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量50 %，超過(guò)牛肉、大?等1?蛋白食物，不飽和脂肪 酸10-30%、碳水化合物10-25%并含有8種必需氨基酸、多種維生素及鐵、鋅、鈣、鉀等礦物 質(zhì)。另外，人們還發(fā)現(xiàn)小球藻含有一種珍貴的生長(zhǎng)因子CGF，能促進(jìn)機(jī)體特別是兒童及老年 人體質(zhì)增強(qiáng)，還能增強(qiáng)人體免疫、防止病毒增殖、抑制癌細(xì)胞增殖、抑制血糖上升、降低血清 膽固醇、排除毒素、迅速修復(fù)機(jī)體損傷。
[0010] 小球藻是最早開(kāi)發(fā)的藻類(lèi)蛋白，早在20世紀(jì)60年代初，日本就開(kāi)始工廠(chǎng)化生產(chǎn)。 小球藻經(jīng)過(guò)馴化，可以在淡水、海水、半咸水中生活，有橢圓小球藻、小球藻和蛋白核小球藻 3種，都可進(jìn)行人工培養(yǎng)。小球藻借助陽(yáng)光、水和二氧化碳，以每隔20小時(shí)一分為四的速度 繁殖，不停地將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化成蘊(yùn)涵多種營(yíng)養(yǎng)成分的藻體并釋放出大量氧氣；它的光合能力 高于其它植物10倍以上，人們贊美它是"罐裝的太陽(yáng)"。小球藻為世界上公認(rèn)健康食品，在 世界微藻產(chǎn)業(yè)中產(chǎn)量最高，在日本保健品中連續(xù)十年銷(xiāo)量第一。2013年，全世界產(chǎn)量500萬(wàn) 噸，主產(chǎn)地為東南亞地區(qū)。日本九州大學(xué)教授、日本綠藻研究所所長(zhǎng)中村博士用自己的親身 經(jīng)歷證明了在缺少其它食物情況下，小球藻可以作為全營(yíng)養(yǎng)食品提供給人類(lèi)，使人體生理 機(jī)能維持健康和正常運(yùn)轉(zhuǎn)。日本在小球藻研發(fā)及利用方面領(lǐng)先世界。在日本，小球藻已應(yīng) 用于臨床，對(duì)創(chuàng)傷、便秘、白細(xì)胞減少、缺鐵性貧血、營(yíng)養(yǎng)不良、高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬 化和高膽固醇血癥及腫瘤進(jìn)行輔助治療。20世紀(jì)五、六十年代中國(guó)的自然災(zāi)害導(dǎo)致了大面 積饑荒，為解決口糧不足問(wèn)題，全國(guó)掀起了群眾性培養(yǎng)、食用小球藻熱潮。日本第二次世界 大戰(zhàn)期間也曾出現(xiàn)過(guò)嚴(yán)重糧荒，日本學(xué)者倡導(dǎo)用小球藻來(lái)充饑并進(jìn)行規(guī)模養(yǎng)殖，實(shí)現(xiàn)了工 業(yè)化生產(chǎn)。隨著科技發(fā)展，小球藻已廣泛用于制造保健食品、化妝品、醫(yī)藥、海產(chǎn)魚(yú)、蝦及寵 物飼料。用破壁小球藻加工成的保健食品，已成健康食品新寵，人們?cè)O(shè)想將它作為太空生存 宇宙食品并制造氧氣。
[0011] 蛋白核小球藻傳統(tǒng)上采用f/2培養(yǎng)液且采用敞口的開(kāi)放水泥池粗放培養(yǎng)，培養(yǎng)液 成分單調(diào)，生長(zhǎng)慢，易污染，成本高，效益低，操作費(fèi)力，工作量大，現(xiàn)在我采用臥式白塑料貯 水罐充氣培養(yǎng)，以羊糞浸出液為主要氮源并在培養(yǎng)基中添加了適量硝酸銨，磷酸二氫鈉，氯 化銨，海泥抽取液，土壤抽出液，碳酸氫鈉，硫酸亞鐵，f/2微量元素，f/2維生素，酵母膏， 蛋白胨，DL蘋(píng)果酸，D-異抗壞血酸鈉，硅酸鉀，檸檬酸鈉，吲哚乙酸，α -萘乙酸，麥飯石粉， 鈦溶液，920植物生長(zhǎng)刺激素，山梨酸鉀，海藻酸丙二醇酯，乙酸鈉，谷朊粉，羥丙基甲基纖維 素，硬脂酸鎂，三聚甘油單硬脂酸酯，人尿等營(yíng)養(yǎng)成分，不僅可以廢物利用，變廢為寶，而且 可獲得有重要保健價(jià)值的微藻，一舉多得。有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥混合使用，營(yíng)養(yǎng)更加全面、均衡， 操作方便，靈活掌握，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、工廠(chǎng)化、程序化、規(guī)?；a(chǎn)，成本低，效益高，蛋白核 小球藻生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量大幅提高，培養(yǎng)周期縮短，產(chǎn)量提高240%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為了克服蛋白核小球藻傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種以用羊糞浸出液 為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法，配方如下：
[0013] 羊糞浸出液85暈升，硝酸銨3暈克，磷酸二氫鈉5暈克，氯化銨2暈克，海泥抽取 液1毫升，土壤抽出液1毫升，碳酸氫鈉50毫克，硫酸亞鐵I. 5毫克，f/2微量元素溶液I. 2 毫升，f/2維生素溶液1. 2毫升，酵母膏8毫克，蛋白胨5毫克，DL蘋(píng)果酸10毫克，D-異抗 壞血酸鈉4毫克，硅酸鉀6毫克，檸檬酸鈉6毫克，吲哚乙酸1毫克，α -萘乙酸0. 1毫克， 麥飯石粉5毫克，鈦溶液1毫升，920植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，海藻酸 丙二醇酯10毫克，乙酸鈉4毫克，谷朊粉10毫克，羥丙基甲基纖維素3毫克，硬脂酸鎂2毫 克，三聚甘油單硬脂酸酯4毫克，人尿1毫升，次氯酸鈉消毒后的純凈海水1000毫升；其中 f/2 微量元素溶液配方：ZnSO4 · 4Η20 23 毫克，MnCl2 · 4Η20 178 毫克，CuSO4 · 5H20 10 毫克， FeC6H5O7 · 5Η20 3. 9 克，Na2MoO4 · 2Η20 7. 3 毫克，CoCl2 · 6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4. 35 克，純 水1000毫升；f/2維生素溶液配方：維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素HO. 5毫 克，純水1000毫升。
[0014] 一種利用羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法，具體步驟如下：
[0015] 培養(yǎng)容器為容積為3立方米的臥式白色塑料貯水罐，一體式結(jié)構(gòu)，堅(jiān)固耐用，強(qiáng)度 大，抗沖擊，市場(chǎng)有售。頂部有一蓋子，帶旋絲。蓋子打上3個(gè)孔，其中一個(gè)穿過(guò)電源導(dǎo)線(xiàn)， 導(dǎo)線(xiàn)末端連著一個(gè)40瓦節(jié)能燈，還有一個(gè)孔插入充氣管，另一孔插入排氣管，充氣管和排 氣管都是玻璃管，內(nèi)徑6毫米。將塑料貯水罐先用砂濾海水洗凈，再用工業(yè)用鹽酸浸泡、消 毒30分鐘，然后用冷開(kāi)海水沖洗3遍，裝入上述的培養(yǎng)基1800升，充氣混合10分鐘，選擇 生命力旺盛、無(wú)污染的蛋白核小球藻接種，接種密度20X IO4ceIVmL;蓋子上插入兩根干凈 玻璃管，一根較長(zhǎng)，90厘米，頂端露出蓋子10厘米，下端通過(guò)料管與2個(gè)散氣石連接，用以 充氣（散氣石作用是形成很小的氣泡，避免大氣泡或翻滾的波浪打碎藻細(xì)胞）；另一根較 短，16厘米，兩端露出蓋子即可，用以排氣；兩根玻璃管同樣粗細(xì)；用干凈的透明膠帶將兩 根玻璃管固定；長(zhǎng)的玻璃管上端用料管與充氣泵相連，充入混合氣體，混合氣體成分和體積 比例是空氣：純二氧化碳：氨氣=92% : 7% : 1% ;白天連續(xù)充氣，夜間行間隔充氣，即 充氣30分鐘，停止30分鐘，如此反復(fù)；充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可；室外培 養(yǎng)，太陽(yáng)光照射，最佳溫度25±2°C，最佳光照強(qiáng)度3000-15000LUX ;夜間打開(kāi)節(jié)能燈進(jìn)行照 明。培養(yǎng)的前6天，塑料貯水罐上方搭建一簡(jiǎn)易棚，上放置簾子遮擋光線(xiàn)，使光照強(qiáng)度維持 在3000-8000LUX，避免強(qiáng)烈陽(yáng)光對(duì)細(xì)胞造成光傷害；第7天撤掉簾子，較強(qiáng)的光照有利于細(xì) 胞的生長(zhǎng)繁殖和高不飽和脂肪酸的合成；培養(yǎng)至第8天，停止充氣，拿開(kāi)蓋子，補(bǔ)充新鮮培 養(yǎng)基80升，以彌補(bǔ)蒸發(fā)掉的水分，蓋上蓋子，充氣，繼續(xù)培養(yǎng)，至第10天，蛋白核小球藻密度 增加至6000X 104cell/mL，停止培養(yǎng)，從底部的水龍頭將藻液放出，將塑料貯水罐用砂濾海 水洗凈，加入消毒液消毒30分鐘后進(jìn)入下一輪培養(yǎng)；。所述消毒液由以下重量比的物質(zhì)組 成：每100份85%乙醇中加入以下重量份的中藥材和輔料：土荊皮30?50份、杠板歸15? 25份、黃柏15?25份、苦參5?15份、艾葉5?15份、輔料3-5份；消毒液制作方法：將土 荊皮、杠板歸、黃柏、苦參、艾葉分別切碎，于60-70°C下烘干，再用中藥材粉碎機(jī)分別粉碎至 70目備用；分別稱(chēng)取以重量份計(jì)烘干并粉碎的土荊皮30?50份、杠板歸15?25份、黃柏 15?25份、苦參5?15份、艾葉5?15份，置于三角燒瓶中充分混合后，加入100份85% 乙醇，浸泡48小時(shí)，200篩絹過(guò)濾，將清液靜置沉淀36小時(shí)，撇去液面漂浮物，取中上層的清 液備用，在上述清液中加入輔料3-5份混合攪拌均勻得到消毒液，所述輔料為半胱氨酸鹽 酸鹽、硫酸鈉、維生素C的混合物，混合比例為重量比2 : 1 : 1;將所述消毒液密封于黑色 試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱備用。
[0016] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用紫外燈消毒，消毒 10-20分鐘。
[0017] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓氮?dú)鈬娚湎?毒，消毒5-10分鐘。
[0018] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓二氧化碳噴射 消毒，消毒5-6分鐘。
[0019] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后分兩個(gè)階段消毒，先使用高壓氮?dú)?噴射消毒，消毒2-3分鐘，使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒2-3分鐘，消毒完畢后再進(jìn)行藻 類(lèi)培養(yǎng)。
[0020] 有益結(jié)果
[0021] 蛋白核小球藻傳統(tǒng)上采用f/2培養(yǎng)液且采用敞口的開(kāi)放水泥池粗放培養(yǎng)，培養(yǎng)液 成分單調(diào)，生長(zhǎng)慢，易污染，成本高，效益低，操作費(fèi)力，工作量大，現(xiàn)在我采用臥式白塑料貯 水罐間隔充氣培養(yǎng)，以羊糞浸出液為主要氮源并在培養(yǎng)基中添加了適量的硝酸銨，磷酸二 氫鈉，氯化銨，海泥抽取液，土壤抽出液，碳酸氫鈉，硫酸亞鐵，f/2微量元素溶液，f/2維生 素溶液，酵母膏，蛋白胨，DL蘋(píng)果酸，D-異抗壞血酸鈉，硅酸鉀，檸檬酸鈉，吲哚乙酸，α-萘 乙酸，麥飯石粉，鈦溶液，920植物生長(zhǎng)刺激素，山梨酸鉀，海藻酸丙二醇酯，乙酸鈉，谷朊粉， 羥丙基甲基纖維素，硬脂酸鎂，三聚甘油單硬脂酸酯，人尿等營(yíng)養(yǎng)成分，不僅可以廢物利用， 變廢為寶，而且可獲得有重要保健價(jià)值的微藻，一舉多得。有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥混合使用，營(yíng)養(yǎng) 更加全面、均衡，操作方便，靈活掌握，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、工廠(chǎng)化、程序化、規(guī)?；a(chǎn)，成本低， 效益高，蛋白核小球藻生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量大幅提高，培養(yǎng)周期縮短，產(chǎn)量提高240%。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為蛋白核小球藻形態(tài)結(jié)構(gòu)圖；
[0023] 其中附圖標(biāo)記為：1細(xì)胞壁，2葉綠體，3蛋白核；
[0024] 圖2為利用臥式塑料貯水罐培養(yǎng)蛋白核小球藻方法圖；
[0025] 其中附圖標(biāo)記為：4排氣管，5節(jié)能燈，6臥式塑料貯水罐，7散氣石，8水龍頭，9藻 液，10充氣管。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 羊糞浸出液制備方法：取新鮮羊糞100公斤，加入麩皮10公斤，玉米面5公斤，鋸 末2公斤，金寶貝發(fā)酵劑（市場(chǎng)有售）100克，自來(lái)水10升，充分?jǐn)嚢?，裝入塑料袋密閉發(fā)酵 8天，后取20公斤放入大塑料桶中，加入60升自來(lái)水，充分?jǐn)嚢?5分鐘，靜置、沉淀24小時(shí) 后，棄沉渣，取上清液100目篩絹過(guò)濾，取清液加熱煮沸30分鐘，以殺死其中的細(xì)菌、病毒等 微生物，冷卻、沉淀、靜置24小時(shí)，取上清液，即為羊糞浸出液，裝入磨口塞試劑瓶或黑色塑 料桶，密封，置于4°C冰箱或冷庫(kù)保存，備用。
[0027] 塑料貯水罐消毒方法：塑料貯水罐先用砂濾海水洗凈，再用工業(yè)用鹽酸浸泡、消毒 30分鐘,然后用冷開(kāi)海水沖洗3遍。
[0028] 土壤抽出液制備方法：取樹(shù)林中松散、富含有機(jī)質(zhì)的上層土壤1公斤，加純水2000 毫升，煮沸30分鐘，在暗處放置2天，過(guò)濾，濾液600毫升加純水400毫升使用。
[0029] 因檸檬酸鐵（FeC6H5O7 ·5Η20)較難溶解，可加少量自來(lái)水在火爐上微熱至80-90°C， 并不斷攪拌至全部融化。
[0030] 海泥抽取液制備方法：取比較肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2份淡水，充分 攪拌均勻，靜置1-2分鐘，取上層泥漿于鋁鍋中，按每1000毫升泥漿加1克NaOH的量加入 NaOH，煮沸25分鐘。煮時(shí)需不斷攪拌均勻，煮后靜置24小時(shí)取上清液，密封，置于4°C冰箱 或冷庫(kù)備用。
[0031] 麥飯石粉是麥飯石粉制品，由麥飯石原礦經(jīng)過(guò)篩選，粉碎，加工成面粉狀，顆粒大 小可以通過(guò)200目篩絹即可。
[0032] 920植物生長(zhǎng)刺激素為白色結(jié)晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解（每克 用50毫升酒精或60度白酒溶解1小時(shí)），再加5倍體積的蒸餾水稀釋。
[0033] 次氯酸鈉消毒海水方法：取海水，脫脂棉過(guò)濾，按1立方米海水中加入漂白粉75克 的量加入漂白粉，使海水中有效氯含量達(dá)到20mg/L，用空氣壓縮機(jī)強(qiáng)力充氣12小時(shí)后，用 硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來(lái)確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色 為止。
[0034] 鈦溶液配法：把736. 6毫克草酸鈦，溶解于100毫升蒸餾水中，加入5克氫氧化銨， 使之成堿性，發(fā)生沉淀，用離心法將沉淀集中，用20毫升0. 05mol/L的硫酸溶解即得。
[0035] 接種用的蛋白核小球藻預(yù)先進(jìn)行提純（本領(lǐng)域常規(guī)方法，只要可實(shí)現(xiàn)提純即可， 例如凱氏提取法），以確保接種時(shí)藻種處于生長(zhǎng)旺盛的指數(shù)生長(zhǎng)期。
[0036] 各種無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽和維生素需預(yù)先配成母液且置于4°C冰箱或冷庫(kù)冷藏保存?zhèn)溆茫?放置時(shí)間不要超過(guò)30天。
[0037] 人尿制備方法：取人尿1000毫升，燒瓶煮沸15分鐘后，冷卻、沉淀24小時(shí)，取上清 液，裝入棕色磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用。
[0038] 各種營(yíng)養(yǎng)鹽要按配方中提供的順序依次加入，同時(shí)不斷攪拌，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
[0039] 所用化學(xué)藥品純度均需化學(xué)純級(jí)別。
[0040] 一種以用羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的培養(yǎng)基，配方如下：
[0041] 羊糞浸出液85毫升，硝酸銨3毫克，磷酸二氫鈉5毫克，氯化銨2毫克，海泥抽取 液1毫升，土壤抽出液1毫升，碳酸氫鈉50毫克，硫酸亞鐵1. 5毫克，f/2微量元素溶液1. 2 毫升，f/2維生素溶液1. 2毫升，酵母膏8毫克，蛋白胨5毫克，DL蘋(píng)果酸10毫克，D-異抗 壞血酸鈉4毫克，硅酸鉀6毫克，檸檬酸鈉6毫克，吲哚乙酸1毫克，α -萘乙酸0. 1毫克， 麥飯石粉5毫克，鈦溶液1毫升，920植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，海藻酸 丙二醇酯10毫克，乙酸鈉4毫克，谷朊粉10毫克，羥丙基甲基纖維素3毫克，硬脂酸鎂2毫 克，三聚甘油單硬脂酸酯4毫克，人尿1毫升，次氯酸鈉消毒后的純凈海水1000毫升，其中 f/2 微量元素溶液配方：ZnSO4 · 4Η20 23 毫克，MnCl2 · 4Η20 178 毫克，CuSO4 · 5H20 10 毫克， FeC6H5O7 · 5Η20 3. 9 克，Na2MoO4 · 2Η20 7. 3 毫克，CoCl2 · 6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4. 35 克，純 水1000毫升；f/2維生素溶液配方：維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素HO. 5毫 克，純水1000毫升。
[0042] 一種以羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法，具體步驟如下：
[0043] 培養(yǎng)容器為容積為3立方米的臥式白色塑料貯水罐，一體式結(jié)構(gòu)，堅(jiān)固耐用，強(qiáng)度 大，抗沖擊，市場(chǎng)有售，頂部有一蓋子，帶旋絲，蓋子打上3個(gè)孔，其中一個(gè)穿過(guò)電源導(dǎo)線(xiàn)，導(dǎo) 線(xiàn)末端連著一個(gè)40瓦節(jié)能燈，還有一個(gè)孔插入充氣管，另一孔插入排氣管，充氣管和排氣 管都是玻璃管，內(nèi)徑6毫米，將塑料貯水罐先用砂濾海水洗凈，再用工業(yè)用鹽酸浸泡、消毒 30分鐘，然后用冷開(kāi)海水沖洗3遍，裝入所述的培養(yǎng)基1800升，充氣混合10分鐘，選擇生 命力旺盛、無(wú)污染的蛋白核小球藻接種，接種密度20X 104cell/mL，蓋子上插入兩根干凈玻 璃管，一根較長(zhǎng)，90厘米，頂端露出蓋子10厘米，下端通過(guò)料管與2個(gè)散氣石連接，用以充 氣（散氣石作用是形成很小的氣泡，避免大氣泡或翻滾的波浪打碎藻細(xì)胞），另一根較短， 16厘米，兩端露出蓋子即可，用以排氣，兩根玻璃管同樣粗細(xì)，用干凈的透明膠帶將兩根玻 璃管固定，長(zhǎng)的玻璃管上端用料管與充氣泵相連，充入混合氣體，混合氣體成分和體積比例 是空氣：純二氧化碳：氨氣=92% : 7% : 1%，白天連續(xù)充氣，夜間行間隔充氣，即充氣 30分鐘，停止30分鐘，如此反復(fù)，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，室外培養(yǎng)， 太陽(yáng)光照射，最佳溫度25±2°C，最佳光照強(qiáng)度3000-15000LUX，夜間打開(kāi)節(jié)能燈進(jìn)行照明， 培養(yǎng)的前6天，塑料貯水罐上方搭建一簡(jiǎn)易棚，上放置簾子遮擋光線(xiàn)，使光照強(qiáng)度維持在 3000-8000LUX，避免強(qiáng)烈陽(yáng)光對(duì)細(xì)胞造成光傷害，第7天撤掉簾子，較強(qiáng)的光照有利于細(xì)胞 的生長(zhǎng)繁殖和高不飽和脂肪酸的合成，培養(yǎng)至第8天，停止充氣，拿開(kāi)蓋子，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng) 基80升，以彌補(bǔ)蒸發(fā)掉的水分，蓋上蓋子，充氣，繼續(xù)培養(yǎng)，至第10天，蛋白核小球藻密度增 加至6000 X 104cell/mL，停止培養(yǎng)，從底部的水龍頭將藻液放出，將塑料貯水罐用砂濾海水 洗凈，加入消毒液消毒30分鐘，后進(jìn)入下一輪培養(yǎng)；
[0044] 所述消毒液由以下重量比的物質(zhì)組成：每100份85%乙醇中加入以下重量份的中 藥材和輔料：土荊皮30份、杠板歸15份、黃柏15份、苦參5份、艾葉5份、輔料3份；消毒液 制作方法：將土荊皮、杠板歸、黃柏、苦參、艾葉分別切碎，于60°C下烘干，再用中藥材粉碎 機(jī)分別粉碎至70目備用；分別稱(chēng)取以重量份計(jì)烘干并粉碎的土荊皮30份、杠板歸15份、黃 柏15份、苦參5份、艾葉5份，置于三角燒瓶中充分混合后，加入100份85%乙醇，浸泡48 小時(shí)，200篩絹過(guò)濾，將清液靜置沉淀36小時(shí)，撇去液面漂浮物，取中上層的清液備用，在上 述清液中加入輔料3份混合攪拌均勻得到消毒液，所述輔料為半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸鈉、維 生素C的混合物，混合比例為重量比2 : 1 : 1;將所述消毒液密封于黑色試劑瓶中，貼上 標(biāo)簽，置于4°C冰箱備用。
[0045] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用紫外燈消毒，消毒 10分鐘。
[0046] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓氮?dú)鈬娚湎?毒，消毒5分鐘。
[0047] 優(yōu)選地，對(duì)選用的塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓二氧化碳噴射消 毒，消毒5分鐘。
[0048] 優(yōu)選地，對(duì)選用的塑料貯水桶，洗刷干凈后分兩個(gè)階段消毒，先使用高壓氮?dú)鈬娚?消毒，消毒2分鐘，使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒2分鐘，消毒完畢后再進(jìn)行藻類(lèi)培養(yǎng)。
[0049] 實(shí)施例2
[0050] 其他步驟同于實(shí)施例1，區(qū)別在于所述消毒液由以下重量比的物質(zhì)組成：每100份 85%乙醇中加入以下重量份的中藥材和輔料：土荊皮40份、杠板歸20份、黃柏20份、苦參 10份、艾葉10份、輔料4份；消毒液制作方法：將土荊皮、杠板歸、黃柏、苦參、艾葉分別切 碎，于65°C下烘干，再用中藥材粉碎機(jī)分別粉碎至70目備用；分別稱(chēng)取以重量份計(jì)烘干并 粉碎的土荊皮40份、杠板歸20份、黃柏20份、苦參10份、艾葉10份，置于三角燒瓶中充分 混合后，加入100份85%乙醇，浸泡48小時(shí)，200篩絹過(guò)濾，將清液靜置沉淀36小時(shí)，撇去 液面漂浮物，取中上層的清液備用，在上述清液中加入輔料4份混合攪拌均勻得到消毒液， 所述輔料為半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸鈉、維生素C的混合物，混合比例為重量比2 : 1 : 1;將 所述消毒液密封于黑色試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱備用。
[0051] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用紫外燈消毒，消毒 15分鐘。
[0052] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓氮?dú)鈬娚湎?毒，消毒7. 5分鐘。
[0053] 優(yōu)選地，對(duì)選用的塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓二氧化碳噴射消 毒，消毒5. 5分鐘。
[0054] 優(yōu)選地，對(duì)選用的塑料貯水桶，洗刷干凈后分兩個(gè)階段消毒，先使用高壓氮?dú)鈬娚?消毒，消毒2. 5分鐘，使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒2. 5分鐘，消毒完畢后再進(jìn)行藻類(lèi)培 養(yǎng)。
[0055] 實(shí)施例3
[0056] 其他步驟同于實(shí)施例1，區(qū)別在于所述消毒液由以下重量比的物質(zhì)組成：每100份 85%乙醇中加入以下重量份的中藥材和輔料：土荊皮50份、杠板歸25份、黃柏25份、苦參 15份、艾葉15份、輔料5份；消毒液制作方法：將土荊皮、杠板歸、黃柏、苦參、艾葉分別切 碎，于70°C下烘干，再用中藥材粉碎機(jī)分別粉碎至70目備用；分別稱(chēng)取以重量份計(jì)烘干并 粉碎的土荊皮50份、杠板歸25份、黃柏25份、苦參15份、艾葉15份，置于三角燒瓶中充分 混合后，加入100份85 %乙醇，浸泡48小時(shí)，200篩絹過(guò)濾，將清液靜置沉淀36小時(shí)，撇去 液面漂浮物，取中上層的清液備用，在上述清液中加入輔料5份混合攪拌均勻得到消毒液， 所述輔料為半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸鈉、維生素C的混合物，混合比例為重量比2 : 1 : 1;將 所述消毒液密封于黑色試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱備用。
[0057] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用紫外燈消毒，消毒 20分鐘。
[0058] 優(yōu)選地，對(duì)選用的所述塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓氮?dú)鈬娚湎?毒，消毒10分鐘。
[0059] 優(yōu)選地，對(duì)選用的塑料貯水桶，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓二氧化碳噴射消 毒，消毒6分鐘。
[0060] 優(yōu)選地，對(duì)選用的塑料貯水桶，洗刷干凈后分兩個(gè)階段消毒，先使用高壓氮?dú)鈬娚?消毒，消毒3分鐘，使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒3分鐘，消毒完畢后再進(jìn)行藻類(lèi)培養(yǎng)。
[0061] 最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡 管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然 可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換； 而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種以用羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的培養(yǎng)基，其特征在于配方如 下： 羊糞浸出液85暈升，硝酸銨3暈克，磷酸二氫鈉5暈克，氯化銨2暈克，海泥抽取液1 毫升，土壤抽出液1毫升，碳酸氫鈉50毫克，硫酸亞鐵1. 5毫克，f/2微量元素溶液1. 2毫 升，f/2維生素溶液1. 2毫升，酵母膏8毫克，蛋白胨5毫克，DL蘋(píng)果酸10毫克，D-異抗壞 血酸鈉4毫克，硅酸鉀6毫克，檸檬酸鈉6毫克，吲哚乙酸1毫克，α-萘乙酸0. 1毫克，麥 飯石粉5毫克，鈦溶液1毫升，920植物生長(zhǎng)刺激素8國(guó)際單位，山梨酸鉀10毫克，海藻酸 丙二醇酯10毫克，乙酸鈉4毫克，谷朊粉10毫克，羥丙基甲基纖維素3毫克，硬脂酸鎂2毫 克，三聚甘油單硬脂酸酯4毫克，人尿1毫升，次氯酸鈉消毒后的純凈海水1000毫升，其中 f/2 微量元素溶液配方：ZnSO4 · 4Η20 23 毫克，MnCl2 · 4Η20 178 毫克，CuSO4 · 5H20 10 毫克， FeC6H5O7 · 5Η20 3. 9 克，Na2MoO4 · 2Η20 7. 3 毫克，CoCl2 · 6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4. 35 克，純 水1000毫升；f/2維生素溶液配方：維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素HO. 5毫 克，純水1000毫升。
2. -種以羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法，其特征在于具體步驟如 下： 培養(yǎng)容器為容積為3立方米的臥式白色塑料貯水罐，一體式結(jié)構(gòu)，堅(jiān)固耐用，強(qiáng)度大， 抗沖擊，市場(chǎng)有售，頂部有一蓋子，帶旋絲，蓋子打上3個(gè)孔，其中一個(gè)穿過(guò)電源導(dǎo)線(xiàn)，導(dǎo)線(xiàn) 末端連著一個(gè)40瓦節(jié)能燈，還有一個(gè)孔插入充氣管，另一孔插入排氣管，充氣管和排氣管 都是玻璃管，內(nèi)徑6毫米，將塑料貯水罐先用砂濾海水洗凈，再用工業(yè)用鹽酸浸泡、消毒30 分鐘，然后用冷開(kāi)海水沖洗3遍，裝入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基1800升，充氣混合10分鐘， 選擇生命力旺盛、無(wú)污染的蛋白核小球藻接種，接種密度20X 104cell/mL，蓋子上插入兩根 干凈玻璃管，一根較長(zhǎng)，90厘米，頂端露出蓋子10厘米，下端通過(guò)料管與2個(gè)散氣石連接， 用以充氣（散氣石作用是形成很小的氣泡，避免大氣泡或翻滾的波浪打碎藻細(xì)胞），另一根 較短，16厘米，兩端露出蓋子即可，用以排氣，兩根玻璃管同樣粗細(xì)，用干凈的透明膠帶將兩 根玻璃管固定，長(zhǎng)的玻璃管上端用料管與充氣泵相連，充入混合氣體，混合氣體成分和體積 比例是空氣：純二氧化碳：氨氣=92% : 7% : 1%，白天連續(xù)充氣，夜間行間隔充氣，即 充氣30分鐘，停止30分鐘，如此反復(fù)，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，室外培 養(yǎng)，太陽(yáng)光照射，最佳溫度25±2°C，最佳光照強(qiáng)度3000-15000LUX，夜間打開(kāi)節(jié)能燈進(jìn)行照 明，培養(yǎng)的前6天，塑料貯水罐上方搭建一簡(jiǎn)易棚，上放置簾子遮擋光線(xiàn)，使光照強(qiáng)度維持 在3000-8000LUX，避免強(qiáng)烈陽(yáng)光對(duì)細(xì)胞造成光傷害，第7天撤掉簾子，較強(qiáng)的光照有利于細(xì) 胞的生長(zhǎng)繁殖和高不飽和脂肪酸的合成，培養(yǎng)至第8天，停止充氣，拿開(kāi)蓋子，補(bǔ)充新鮮培 養(yǎng)基80升，以彌補(bǔ)蒸發(fā)掉的水分，蓋上蓋子，充氣，繼續(xù)培養(yǎng)，至第10天，蛋白核小球藻密度 增加至6000X 104cell/mL，停止培養(yǎng)，從底部的水龍頭將藻液放出，將塑料貯水罐用砂濾海 水洗凈，加入消毒液消毒30分鐘，后進(jìn)入下一輪培養(yǎng)； 所述消毒液由以下重量比的物質(zhì)組成：每100份85 %乙醇中加入以下重量份的中藥 材和輔料：土荊皮30?50份、杠板歸15?25份、黃柏15?25份、苦參5?15份、艾葉 5?15份、輔料3-5份；消毒液制作方法：將土荊皮、杠板歸、黃柏、苦參、艾葉分別切碎，于 60-70°C下烘干，再用中藥材粉碎機(jī)分別粉碎至70目備用；分別稱(chēng)取以重量份計(jì)烘干并粉 碎的土荊皮30?50份、杠板歸15?25份、黃柏15?25份、苦參5?15份、艾葉5?15 份，置于三角燒瓶中充分混合后，加入100份85%乙醇,浸泡48小時(shí),200篩絹過(guò)濾,將清液 靜置沉淀36小時(shí)，撇去液面漂浮物，取中上層的清液備用，在上述清液中加入輔料3-5份混 合攪拌均勻得到消毒液，所述輔料為半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸鈉、維生素C的混合物，混合比 例為重量比2 : 1 : 1;將所述消毒液密封于黑色試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種以羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法， 其特征在于，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用紫外燈消毒，消毒10-20 分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種以羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法，其 特征在于，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓氮?dú)鈬娚湎?，消?5-10分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種以羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法，其 特征在于，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后進(jìn)行消毒，使用高壓二氧化碳噴射消毒， 消毒5-6分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種以羊糞浸出液為主要氮源培養(yǎng)蛋白核小球藻的方法，其 特征在于，對(duì)選用的所述塑料貯水罐，洗刷干凈后分兩個(gè)階段消毒，先使用高壓氮?dú)鈬娚湎?毒，消毒2-3分鐘，使用高壓二氧化碳噴射消毒，消毒2-3分鐘，消毒完畢后再進(jìn)行藻類(lèi)培 養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK104212718SQ201410436472
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】王培磊 申請(qǐng)人:臨沂大學(xué)