一種乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法。它是將乳腺組織先用組織勻漿機處理成乳糜狀的組織塊，然后將組織塊依次接種在標定的培養(yǎng)瓶底壁處進行培養(yǎng)，2-3天后每個組織塊周圍有成纖維細胞游離出來并貼壁生長，4-5天后上皮細胞開始游離出來貼壁生長，成纖維細胞被驅(qū)向上皮細胞外周并圍繞其生長；這時加入胰蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來，終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)，5-7天后有約80-90％細胞貼壁，得到較高純度的乳腺上皮細胞。與現(xiàn)有的培養(yǎng)方法相比，該方法在培養(yǎng)初期對成纖維細胞進行消化處理，這時僅有少量的上皮細胞游離生長(消化處理時可完全去掉)，之后游離生長的上皮細胞不受消化處理損傷，細胞活性和純度都非常高。
【專利說明】一種乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺是哺乳動物所特有的器官，具有合成和分泌乳汁的功能，是蛋白質(zhì)合成十分 活躍的場所。研究表明，乳蛋白編碼的基因其表達具有明顯的組織特異性和階段特異性， 即乳蛋白的合成僅在乳腺上皮細胞中進行，并且發(fā)生在哺乳母體即將分娩之前和分娩之后 的相當長一段時間的泌乳期中，所以乳腺上皮細胞被公認為是制作乳腺生物反應(yīng)器的靶細 胞。即利用體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞，通過構(gòu)建特異性表達載體生產(chǎn)醫(yī)療上價值極大的藥 用蛋白或其他蛋白質(zhì)。另外，乳腺上皮細胞也是研究乳蛋白基因表達、調(diào)控及細胞形態(tài)學的 有利工具，它從細胞水平上對泌乳機制進行深入研究，為進一步研究各種因素對乳腺發(fā)育 及泌乳過程的影響奠定了基礎(chǔ)。
[0003] 人們對乳腺細胞的培養(yǎng)始于上世紀五、六十年代，最初利用膠原酶消化乳腺組織， 將乳腺細胞從中分離出來直接培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)開始培養(yǎng)時上皮細胞所占比例很大，然而隨著傳 代的不斷進行，上皮細胞逐漸被生長較快的成纖維細胞所取代。為了解決培養(yǎng)的乳腺上皮 細胞中混有成纖維細胞的問題，McGrath等將含乳腺上皮細胞的膠原酶消化液進行密度梯 度離心，去除消化液中的成纖維細胞、脂肪顆粒、細胞碎片、DNA纖維等成分（McGrath MF. A novel system for mammary epithelial cell culture. J Dairy Sci. 1987, 70:1967-80), 但使用這種方法來分離乳腺上皮細胞會產(chǎn)生不可逆地機械性損傷。Wang等試圖通過細 胞克隆得到純凈的乳腺上皮細胞（Wang S,Haslam SZ. Serum-free primary culture of normal mouse mammary epithelial and stromal cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1994, 30A:859-66)，但正常乳腺上皮細胞的克隆率極低，要獲得上皮細胞的單細胞克 隆非常困難，即使有克隆出現(xiàn)，這些克隆極易老化，失去增殖能力。Zavizion等利用放射性 射線照射的方法去除成纖維細胞，即用小片鉛板擋住需保留的上皮細胞區(qū)域，讓射線照射 上皮細胞外的區(qū)域。這樣未受到射線照射的細胞便存活下來，照射過的細胞便失去增殖能 力，逐漸衰退、死亡（Zavizion B, van Duffelen M, Schaeffer W, Politis I. Establishment and characterization of a bovine mammary epithelial cell line with unique properties. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1996, 32:138-48)，但這種方法操作起來非常 困難，因為乳腺上皮細胞生長的區(qū)域不規(guī)則、大小不一，而鉛板的尺寸、形狀都是固定的， 所以很難控制鉛板能完全遮擋住上皮細胞，當然成纖維細胞也不可能完全被遮擋住，這樣 造成實際的純化效果并不理想。也有報道提出由于乳汁中含有上皮細胞，可低速離心然 后收集細胞沉淀進行培養(yǎng)（Buehring GC. Culture of mammary epithelial cells from bovine milk. J. Dairy Sci. 1990, 73:956-63)，但乳汁中的上皮細胞通常是從乳腺內(nèi)膜上 自然脫落下來，細胞狀態(tài)或活力很差，所以培養(yǎng)后細胞增殖能力很低，很難維持生長。近年 來研究人員在利用膠原酶將乳腺組織消化成單個細胞進行培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)成纖維細胞 和上皮細胞對胰蛋白酶敏感性不同及貼壁時間差異在消化傳代時逐步將成纖維細胞去除， 但這種方法由于最初是利用膠原酶分離乳腺組織，所以獲得的細胞是成纖維細胞和上皮細 胞的混合群體，培養(yǎng)后也是兩種細胞相互混雜生長。這就造成消化傳代時很難完全將成纖 維細胞去除，而且多次消化傳代造成乳腺上皮細胞活力下降和生物學功能降低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)方法存在的缺點，本發(fā)明提供了一種乳腺上 皮細胞的體外培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法根據(jù)乳腺組織塊中成纖維細胞和上皮細胞的生長特 性，采取不經(jīng)膠原酶消化，而是直接將組織塊接種培養(yǎng)，將先游離出來生長的成纖維細胞利 用胰蛋白酶消化徹底去掉，再培養(yǎng)后游離出來生長的細胞即為上皮細胞。與上述幾種培養(yǎng) 方法相比，該方法在培養(yǎng)初期對成纖維細胞進行消化處理，這時僅有少量的上皮細胞游離 生長（消化處理時可完全去掉），之后游離生長的上皮細胞不受消化處理損傷，所以細胞活 性和純度都非常高。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，將乳腺組織 先用組織勻漿機處理成乳糜狀的組織塊，然后將組織塊依次接種在標定的培養(yǎng)瓶底壁處進 行培養(yǎng)；2-3天后每個組織塊周圍有成纖維細胞游離出來并貼壁生長，4-5天后上皮細胞 開始游離出來貼壁生長，成纖維細胞被驅(qū)向上皮細胞外周并圍繞其生長；這時加入0. 25% 胰蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來（控制加入胰蛋白酶的量，使其消化時僅將貼壁 的成纖維細胞層去掉，而不會對組織塊進行消化處理），終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)，5-7天后有 80-90 %細胞貼壁，得到較高純度的乳腺上皮細胞。
[0006] 具體包括以下步驟：
[0007] (1)培養(yǎng)液配制
[0008] 細胞培養(yǎng)液：按照每450-500毫升的DMEM/F12培養(yǎng)液加入50-60毫升的胎牛血 清（FBS)、2-3毫升的青鏈霉素混合液、0. 12-0. 15g?；撬岷?. 3-0. 5毫升表皮生長因子 (10 μ g/ml)的比例配制細胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值為6. 9-7. 2 ;然后經(jīng)0. 22微米濾膜過濾后， 放置4°C保存；
[0009] (2)培養(yǎng)瓶處理
[0010] 將T25培養(yǎng)瓶的底壁朝上平放，然后在底壁上劃出橫向和縱向間距均為0. 4cm的 網(wǎng)格線，每個交匯點處即是組織塊的接種點；
[0011] (3)乳腺組織的取樣與勻漿處理
[0012] 首先將乳腺組織用含1 %青鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗，以徹底清除為組織中攜帶 的乳汁；然后將乳腺組織剪成〇. 5-0. 7cm3的塊狀，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾2-3 下，讓組織塊稍微干燥后，放入組織勻漿機的無菌試管內(nèi)，180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理2-3分 鐘，這時組織塊成大小均一、體積為0. 8-lmm3的乳糜粒狀的組織塊；
[0013] ⑷乳腺上皮細胞培養(yǎng)
[0014] 將乳糜粒狀的組織塊依次接種到培養(yǎng)瓶底壁的接種點處；然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入 4-5毫升細胞培養(yǎng)液，平放入含5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，0. 5-1小時后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓 培養(yǎng)液緩慢進入培養(yǎng)瓶底壁后立即放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；2-3天后每個組織塊有成纖維細 胞游離出來并貼壁生長，4-5天后上皮細胞開始游離出來貼壁生長并逐漸形成形狀大致規(guī) 則的圓形細胞區(qū)域，成纖維細胞被驅(qū)向這片細胞區(qū)域外周并圍繞其生長，這時加入〇. 8-1. 0 毫升的0.25%胰蛋白酶（含0.05% EDTA)輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加入 0. 4-0. 5毫升0. 25 %胰蛋白酶（含0. 05 % EDTA)，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下 每隔1-2分鐘觀察一次，待組織塊外周所有貼壁的成纖維細胞都徹底消化下來后加入5-6 毫升細胞培養(yǎng)液終止消化并棄掉，再加入5-6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細胞3-4 次；之后加入細胞培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；5-7天后有80-90%細胞貼壁，此即為乳腺 上皮細胞。
[0015] 備注：在培養(yǎng)至4-5天時采用胰蛋白酶消化，理論上可以除去所有的成纖維細胞； 如果有個別的組織塊的細胞游離速度較慢，胰蛋白酶消化結(jié)束后，組織塊周圍游離出來的 還是成纖維細胞，用細胞刮將組織塊連同其周圍的成纖維細胞直接刮掉。最后加入培養(yǎng)液 放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：（1)本發(fā)明先將乳腺組織勻漿成乳糜粒，這種處理不僅比 傳統(tǒng)的徒手剪碎省時、省力，而且使單個組織粒大小更均勻一致，接種到培養(yǎng)瓶底壁后從每 個乳糜粒游離出來的細胞生長速度基本一致，這樣既有利于判定并控制合適的胰蛋白酶處 理時間，又既能保證外周的成纖維細胞完全被消化下來。（2)本發(fā)明一改傳統(tǒng)培養(yǎng)中先用 膠原酶將乳腺組織消化成單個細胞的做法，而是使用組織勻漿機將乳腺組織處理成細小的 乳糜粒直接接種，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后成纖維細胞和上皮細胞生長區(qū)域存在明顯的界限，即以乳糜 粒為中心，上皮細胞基本按圓形區(qū)域生長，圍繞外周的是成纖維細胞及極少量的其他雜細 胞（如脂肪細胞、基質(zhì)細胞等），所以在上皮細胞剛游離出來生長時加入胰蛋白酶，將外周 的成纖維細胞消化下來漂洗去掉，繼續(xù)培養(yǎng)后游離出來生長的是上皮細胞，這些新生長的 上皮細胞不受消化處理的損傷，所以活性非常高。（3)本發(fā)明嚴格控制加入胰蛋白酶的量， 所以消化時僅將貼壁的成纖維細胞層（有時也有少許的上皮細胞）去掉，而不會對組織塊 進行消化處理，這樣不僅可以避免在后續(xù)培養(yǎng)中混入雜細胞，而且可以保持組織塊的位置 不動，進而保證在外周的成纖維細胞去掉后重新生長的全部為上皮細胞。（4)本發(fā)明在培 養(yǎng)液中添加促上皮細胞生長的能量物質(zhì)?；撬岷捅砥どL因子，有利于維持乳腺上皮細胞 活性，保持較高的增殖速度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為組織塊在培養(yǎng)瓶底壁的接種位置示意圖；其中，1、組織塊，2、劃線，3、培養(yǎng) 瓶底壁；4、瓶口；
[0018] 圖2為乳腺上皮細胞采用實施例1的方法培養(yǎng)6天后的100 X照片；
[0019] 圖3為乳腺上皮細胞進行角蛋白18單克隆抗體免疫熒光染色。A指示區(qū)（白色） 為細胞核，B指示區(qū)為角蛋白18陽性。

【具體實施方式】
[0020] 實施例1
[0021] 1、培養(yǎng)液配制
[0022] 將50毫升FBS、2. 5毫升青鏈霉素混合液[青霉素-鏈霉素混合液（100X)，青霉 素含量為l0000U/ml，鏈霉素的含量為10mg/ml]、0. 15克?；撬岷?. 4ml的表皮生長因子 (10 μ g/ml)溶解在450毫升DMEM/F12培養(yǎng)液中，經(jīng)0. 22微米濾膜過濾后分裝到滅菌的50 毫升離心管中，每管40毫升，放置4°C保存。細胞培養(yǎng)前半小時將兩管共80毫升培養(yǎng)液放 在37 °C水浴鍋中預(yù)熱。
[0023] 2、培養(yǎng)瓶處理
[0024] 將無菌包裝的T25培養(yǎng)瓶在超凈臺內(nèi)取出，培養(yǎng)瓶底壁朝上平放，用比例尺從底 壁靠瓶底處開始每隔〇. 4厘米用記號筆劃一橫線直到接近瓶口處，然后從培養(yǎng)瓶底壁一側(cè) 開始按每隔〇. 4厘米用記號筆劃一縱線直到底壁另一側(cè)，這樣每個交匯點處即是組織塊的 接種點（如圖1所示）。
[0025] 3、乳腺組織的取樣與勻漿處理
[0026] 乳腺組織必須選自處于泌乳中后期、不攜帶傳染性疾病及乳腺疾病的健康個體。 取樣前按常規(guī)消毒處理乳房，然后切取乳房后側(cè)乳溝處乳腺組織塊放在含1%青鏈霉素的 磷酸鹽緩沖液（PBS)中帶回實驗室。在無菌超凈臺內(nèi)首先將乳腺組織放在平皿中用含1% 青鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗，直到將組織中攜帶的乳汁徹底清除為止；然后將乳腺組織修 剪成0. 6cm3的塊狀，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾3下，讓組織塊稍微干燥后，放入 組織勻漿機的無菌試管內(nèi)，190轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理3分鐘，這時組織塊成大小均一、體積為 0. 8mm3的乳糜粒。
[0027] 4、乳腺上皮細胞培養(yǎng)
[0028] 用吸管將乳糜粒從無菌試管內(nèi)轉(zhuǎn)移到平皿中，輕輕攤成薄薄的一層，用尖端微細 的眼科鑷夾取乳糜粒，依次接種到培養(yǎng)瓶底壁劃線的交匯處；然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入5毫升 細胞培養(yǎng)液，平放入含5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，0. 5小時后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液緩 慢進入培養(yǎng)瓶底壁后立即放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2天后每個乳糜粒有成纖維細胞游離出來 并貼壁生長，4天后上皮細胞開始游離出來貼壁生長并逐漸形成形狀大致規(guī)則的圓形細胞 區(qū)域，成纖維細胞被驅(qū)向這片細胞區(qū)域外周并圍繞其生長。這時加入0. 8毫升0. 25%胰蛋 白酶（含0.05% EDTA)輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加入0.5毫升0.25%胰蛋 白酶（含0. 05% EDTA)，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下每隔1分鐘觀察一次，待 組織塊外周所有成纖維細胞都徹底消化下來后加入5毫升細胞培養(yǎng)液終止消化并棄掉，再 加入6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細胞4次，之后加入細胞培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱繼續(xù) 培養(yǎng)。后續(xù)如果有少許組織塊周圍游離出來的還是成纖維細胞，用細胞刮將組織塊連同其 周圍的成纖維細胞直接刮掉。最后加入培養(yǎng)液放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6天后有約80-90%細 胞貼壁（如圖2所示）。采用上皮細胞特征表達蛋白即角蛋白18單克隆抗體對培養(yǎng)的細胞 進行免疫熒光檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角蛋白18在乳腺上皮細胞中均呈陽性（如圖3所示）。
【權(quán)利要求】
1. 一種乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，將乳腺組織先用組織勻漿機處理成 乳糜狀的組織塊，然后將組織塊依次接種在標定的培養(yǎng)瓶底壁處進行培養(yǎng)；2-3天后每個 組織塊周圍有成纖維細胞游離出來并貼壁生長，4-5天后上皮細胞開始游離出來貼壁生長， 成纖維細胞被驅(qū)向上皮細胞外周并圍繞其生長；這時加入〇. 25%胰蛋白酶將貼壁的成纖 維細胞消化下來，終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)，5-7天后有80-90%細胞貼壁，得到較高純度的乳 腺上皮細胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，所述細胞培養(yǎng)采用 的細胞培養(yǎng)液為：按照每450-500ml的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入50-60ml的胎牛血清、2-3ml 的青鏈霉素混合液、〇. 12-0. 15g?；撬岷?. 3-0. 5ml表皮生長因子的比例配制細胞培養(yǎng) 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 9-7. 2 ;然后經(jīng)0. 22微米濾膜過濾后，放置4°C保存。
3. 如權(quán)利要求1所述的乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，所述加入0. 25%胰 蛋白酶將貼壁的成纖維細胞消化下來，終止消化后繼續(xù)培養(yǎng)的具體步驟如下：采用T25培 養(yǎng)瓶時，加入0. 8-1. 0毫升的0. 25%胰蛋白酶輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加 入0. 4-0. 5毫升0. 25 %胰蛋白酶，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下每隔1-2分鐘 觀察一次，待組織塊外周所有貼壁的成纖維細胞都徹底消化下來后加入5-6毫升細胞培養(yǎng) 液終止消化并棄掉，再加入5-6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細胞3-4次；所述0. 25 % 胰蛋白酶中含有〇. 05%的EDTA。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是， (1) 細胞培養(yǎng)液配制 細胞培養(yǎng)液：按照每450-500ml的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入50-60ml的胎牛血清、2-3ml 的青鏈霉素混合液、〇. 12-0. 15g?；撬岷?. 3-0. 5ml表皮生長因子的比例配制細胞培養(yǎng) 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 9-7. 2 ;然后經(jīng)0. 22微米濾膜過濾后，放置4°C保存； (2) 培養(yǎng)瓶處理 將T25培養(yǎng)瓶的底壁朝上平放，然后在底壁上劃出橫向和縱向間距均為0. 4cm的網(wǎng)格 線，每個交匯點處即是組織塊的接種點； (3) 乳腺組織的取樣與勻漿處理 首先將乳腺組織用含1 %青鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗清除組織中攜帶的乳汁；然后將 乳腺組織剪成〇. 5-0. 7cm3的塊狀，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾2-3下，放入組織勻 漿機的無菌試管內(nèi)，180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理2-3分鐘，這時組織塊成大小均一、體積為 0. 8-lmm3的乳糜粒狀的組織塊； (4) 乳腺上皮細胞培養(yǎng) 將乳糜粒狀的組織塊依次接種到培養(yǎng)瓶底壁的接種點處；然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入4-5毫 升細胞培養(yǎng)液，平放入含5% C02、37°C培養(yǎng)箱中，0. 5-1小時后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng) 液緩慢進入培養(yǎng)瓶底壁后立即放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；2-3天后每個組織塊有成纖維細胞游 離出來并貼壁生長，4-5天后上皮細胞開始游離出來貼壁生長并逐漸形成形狀大致規(guī)則的 圓形細胞區(qū)域，成纖維細胞被驅(qū)向這片細胞區(qū)域外周并圍繞其生長，這時加入〇. 8-1. 0毫 升的0. 25 %胰蛋白酶輕輕混勻覆蓋培養(yǎng)瓶底壁后棄掉，再重新加入0. 4-0. 5毫升0. 25 %胰 蛋白酶，然后放在37°C培養(yǎng)箱中，在相差顯微鏡下每隔1-2分鐘觀察一次，待組織塊外周所 有貼壁的成纖維細胞都徹底消化下來后加入5-6毫升細胞培養(yǎng)液終止消化并棄掉，再加入 5-6毫升PBS液輕輕漂洗殘留的成纖維細胞3-4次；5-7天后有80-90%細胞貼壁，得到較 高純度的乳腺上皮細胞；所述〇. 25%胰蛋白酶中含有0. 05%的EDTA。
【文檔編號】C12N5/071GK104195100SQ201410438103
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】游偉, 譚秀文, 趙紅波, 劉曉牧, 劉桂芬, 成海建, 劉倚帆, 萬發(fā)春, 宋恩亮 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所