運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌、鹵醇脫鹵酶、基因、載體、重組菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌、鹵醇脫鹵酶、基因、載體、重組菌及其應(yīng)用；所述重組鹵醇脫鹵酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述鹵醇脫鹵酶能夠不對(duì)稱催化1,3-二氯丙醇和1,3-二溴丙醇生成(S)-環(huán)氧氯丙烷和(S)-環(huán)氧溴丙烷，同時(shí)對(duì)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的活性要明顯遠(yuǎn)高于其它鹵醇脫鹵酶，是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)于該底物活性最高的一種天然鹵醇脫鹵酶，可作為催化劑應(yīng)用于制備環(huán)氧化物或手性環(huán)氧化物以及阿托伐他汀中間體，催化效率高，對(duì)映選擇性強(qiáng)，底物適應(yīng)性廣，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。CCTCC NO:M 20141872014.05.07
【專利說明】運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌、鹵醇脫鹵酶、基因、載體、重組菌及其應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種來源運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌的鹵醇脫鹵酶基因，含有該基因的重組表達(dá) 載體和重組菌，利用重組菌制備重組酶的方法，以及該重組鹵醇脫鹵酶制備環(huán)氧化物、手性 環(huán)氧化物、β-取代醇，以及在制備阿托伐他汀關(guān)鍵手性中間體（R)-4-氰基-3-羥基丁酸 乙酯中的應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 鹵醇脫鹵酶，也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶，通過分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化芳香族或 者脂肪族鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和鹵化氫，是微生物降解有機(jī)鹵化合物的關(guān)鍵酶之一。根 據(jù)其序列同源性分為Hhe A、Hhe B和Hhe C3類。有機(jī)鹵化合物已成為當(dāng)今重要環(huán)境污染 物之一，主要是由于排廢以及人工合成鹵化物的廣泛應(yīng)用造成的。在自然界中，大部分異生 質(zhì)鹵化物自降解能力很差，同時(shí)許多化合物被疑是致癌或高誘變物質(zhì)。因此，應(yīng)用微生物和 脫鹵酶降解有機(jī)鹵化物已引起人們廣泛的關(guān)注，在環(huán)境污染治理，特別是手性環(huán)氧化物合 成方面等具有十分重要的作用。
[0003] 鹵醇脫鹵酶主要通過蛋白結(jié)構(gòu)中保守的絲氨酸與底物羥基氧原子之間形成氫鍵， 穩(wěn)定與底物結(jié)合，通過精氨酸降低酪氨酸的PKa值，酪氨酸從底物上的氧原子作為親核試 齊U，進(jìn)攻鄰位鹵素取代的碳原子，進(jìn)而釋放鹵離子，形成環(huán)氧化物。鹵醇脫鹵酶不但可以催 化碳-鹵鍵的斷裂進(jìn)行脫鹵反應(yīng)，可以高選擇性地催化接受除了鹵離子以外的一系列非 自然親核試劑，如N 3' NO2' Cf等所介導(dǎo)的環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)，用以生成一系列光學(xué)純的 β_取代醇。因此可以用來合成一些非自然手性化合物。
[0004] 鹵醇脫鹵酶可以廣泛應(yīng)用于環(huán)氧化物以及β-取代醇。其中疊氮化醇、氰取代 醇以及硝基醇是合成氨基醇的前體；手性氨基醇在生物制藥領(lǐng)域是一類很重要的化合物， 可用來合成多種生物活性物質(zhì)。異硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在農(nóng)用化學(xué)試劑、醫(yī)藥和高 分子化學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用。鹵醇脫鹵酶已成功應(yīng)用于他汀類藥物關(guān)鍵手性中間體的 合成。從目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道中可以知道，最適于催化（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯合成 (R) _4_氰基-3-輕基丁酸乙酯的齒醇脫齒酶是來源于Agrobacterium radiobacter ADl的 Hhe C。但是原始Hhe C活力還是很低。時(shí)空產(chǎn)率只有6X10_3g/L/h。對(duì)Hhe C改造最成 功的是來自Codexis公司的科學(xué)家，他們利用蛋白質(zhì)序列-活性相關(guān)性（ProSAR)驅(qū)動(dòng)的蛋 白質(zhì)定向進(jìn)化策略對(duì)Hhe C進(jìn)行了改造，經(jīng)過18輪的突變，得到了一株活力非常高的突變 株，其催化（S)-CHBE的活力是野生型酶的約4000倍。底物濃度為140g/L，酶量為I. 2g/L， 反應(yīng)5h，產(chǎn)率為92%，ee值大于99. 5%。目前能運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)的只有此突變酶，因此 挖掘?qū)υ摰孜锞哂休^高催化活性的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型鹵醇脫鹵酶，并將其運(yùn)用于工 業(yè)化生產(chǎn)，具有潛在的市場應(yīng)用前景。
[0005] 利用鹵醇脫鹵酶直接不對(duì)稱脫鹵合成手性環(huán)氧氯丙烷的文獻(xiàn)較少。Tetsuji等利 用來源于Corynebacterium sp.N-1074中的Hhe B催化5mM 1,3-二氯丙醇生成（R)-環(huán)氧 氯丙烷。反應(yīng)初始階段（R)-環(huán)氧氯丙烷的ee值最大可達(dá)90%，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，ee值 慢慢下降直至最終為零。
[0006] Lut je Spelberg 等利用來源于 Agrobacterium radiobacter ADl 的齒醇脫齒酶 Hhe C催化1，3_二氯丙醇或2, 3_二氯-1-丙醇合成環(huán)氧氯丙燒，其ee值小于5%。
[0007] 近年來，已從多種微生物中發(fā)現(xiàn)了鹵醇脫鹵酶，部分鹵醇脫鹵酶的基因已被 克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，獲得產(chǎn)酶活力較高的基因工程菌，并應(yīng)用于催化形成環(huán)氧 化合物及取代醇。目前已知的鹵醇脫鹵酶，僅有7種，分別來自于放射形土壤 桿菌（Agrobacterium radiobacter AD1),節(jié)桿菌（Agrobacter sp. AD2)、棒狀桿菌 (Corynebacterium sp.N-1074)、根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)、結(jié)核桿菌 (Mycobacterium sp·)、壤霉菌（Agromyces mediolanus ZJB120203)。所以對(duì)已有齒醇脫齒 酶進(jìn)行研究的同時(shí)，挖掘新的微生物來源的鹵醇脫鹵酶基因，并挖掘新型鹵醇脫鹵酶的應(yīng) 用前景是今后研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)鹵醇脫鹵酶的研究集中于發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)時(shí)間短、產(chǎn)物產(chǎn) 率高，對(duì)映體選擇性高且副反應(yīng)少的鹵醇脫鹵酶。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是提供一種編碼重組鹵醇脫鹵酶的堿基序列，編碼的重組鹵醇脫鹵 酶，同時(shí)提供了含有上述堿基序列的重組載體，以及由這種重組載體轉(zhuǎn)化宿主而得到的轉(zhuǎn) 化體。本發(fā)明還提供了重組鹵醇脫鹵酶對(duì)1，3-二氯丙醇、1，3-二溴丙醇和（S)-4_氯-3-羥 基丁酸乙酯顯示出高活性，利用該酶由1，3-二氯丙醇、1，3-二溴丙醇和（S)-4-氯-3-羥基 丁酸乙酯來制備（S)-環(huán)氧氯丙烷、（S)-環(huán)氧溴丙烷和（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的方 法。以及該重組鹵醇脫鹵酶在催化其它鹵代醇生物脫鹵或不對(duì)稱拆分環(huán)氧化物合成手性環(huán) 氧化物和β-取代醇中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明提供一種來源于運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405的重組齒 醇脫鹵酶，所述重組鹵醇脫鹵酶的氨基酸序列如SEQ ID N〇:2所示。
[0011] 本發(fā)明還提供一種所述重組鹵醇脫鹵酶的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列 為 SEQ ID No: 1 所示。
[0012] 本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因來源于Tistrella mobilis ZJB1405。具體制備方 法可為：根據(jù) Genbank 中收錄預(yù)測(cè)的 Tistrella mobilis KA081020-065 中 halohydrin 印oxidase A基因序列設(shè)計(jì)PCR引物。較佳的，引物1CGCCATATGATGCCTGTCACCGACACCGC(下 劃線為 Nde I 酶切位點(diǎn)），引物 2ATTTGCGGCCGC TTACGGCCAGCCGCCGGTG (下劃線為 Not I 酶 切位點(diǎn)）。然后以Tistrella mobilis ZJB1405的基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)進(jìn)行基因擴(kuò)增，獲得一條完整的鹵醇脫鹵酶全長基因序列，堿基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的基因，命名為HHDHtdi，全長747bp。其中，其編碼序列從第1個(gè)堿基至第744 個(gè)堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。
[0013] 本發(fā)明涉及一種所述編碼基因構(gòu)建的重組載體。其可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā) 明的重組鹵醇脫鹵酶基因連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的 各種載體，如市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒為pET28a (b)。較佳的，可通 過下述方法制得本發(fā)明的重組表達(dá)載體：將通過PCR擴(kuò)增所得的鹵醇脫鹵酶基因產(chǎn)物與載 體pGEM-T連接，獲得克隆載體pGEM-T-HHDHTm，之后將克隆載體和表達(dá)載體pET28b用限制 性內(nèi)切酶Nde I和Not I雙酶切，形成互補(bǔ)的粘性末端，再經(jīng)T4DNA連接酶連接，形成含有 本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因的重組表達(dá)載體pET28b-HHDH Tm。
[0014] 本發(fā)明涉及一種所述重組載體構(gòu)建的重組基因工程菌。其可通過將本發(fā)明的重組 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生 物，只要能滿足重組表達(dá)載體可穩(wěn)定的自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶基 因可被有效表達(dá)即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更優(yōu)選大腸埃希菌（E.coli)BL21(DE3)。將前 述重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b-HHDH Tm轉(zhuǎn)化至（E. coli)BL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工 程菌株，即 E. coli BL21 (DE3)/pET28b-HHDHTni.
[0015] 本發(fā)明涉及一種所述編碼基因在制備重組鹵醇脫鹵酶中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為： 構(gòu)建含所述重組鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的 重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細(xì)胞。其包括 如下步驟：培養(yǎng)本發(fā)明的重組工程菌，獲得重組表達(dá)鹵醇脫鹵酶。其中，所述的重組工程菌 同前述介紹，可通過將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物得到。其中，所述的培養(yǎng) 重組大腸桿菌所用的培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域任何可使重組工程菌生長并產(chǎn)生本發(fā)明的鹵醇脫 鹵酶的培養(yǎng)基，優(yōu)選LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC110g/L，溶劑為去離子水， pH7. 0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因素的不同 按本領(lǐng)域普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要使重組工程菌能夠生長并產(chǎn)生本發(fā)明所述的鹵醇 脫鹵酶即可。其他培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，優(yōu)選下述方法：將本發(fā) 明涉及的重組大腸桿菌重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體接種至含有終濃度50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度〇D_達(dá)到0. 8時(shí)，在終濃度為0. 2mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半 乳糖苷（IPTG)的誘導(dǎo)下，高效表達(dá)本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶。
[0016] 本發(fā)明還涉及一種所述重組鹵醇脫鹵酶在催化鹵代醇制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng) 用，所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑， 以鹵代醇為底物，在pH值為8?10的緩沖液中，于35°C、150r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束 后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物；所述鹵代醇為1，3-二氯丙醇、1，3-二溴丙醇、 2_氯-1-苯乙醇、1，3-二溴-2-丙醇或2, 3-二溴-2-丙醇，所述濕菌體的用量為10?50g/ L緩沖液（優(yōu)選20-40g/L)，所述底物的初始濃度為5?50mmol/L緩沖液（優(yōu)選20-40mmol/ L)。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述催化劑（即濕菌體）按如下方法制備：將含重組鹵醇脫鹵酶 基因的工程菌接種至含終濃度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按 體積濃度1 %的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，置37°C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的 0D600達(dá)到0. 6時(shí)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG作為誘導(dǎo)劑，28°C誘導(dǎo)10h，將培養(yǎng)液離心， 收集濕菌體。
[0018] 本發(fā)明還涉及一種所述重組鹵醇脫鹵酶在催化鹵代羥基丁酸乙酯脫鹵中的應(yīng)用， 所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以 鹵代羥基丁酸乙酯為底物，在PH值為7?10的緩沖液中，于35°C、150r/min條件下反應(yīng)， 反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯；所述鹵代羥基丁酸乙 酯為（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，所述濕菌體的用量為10?60g/L緩沖液（優(yōu)選20-40g/ L)，所述底物的初始濃度為10?150g/L緩沖液（優(yōu)選50-100g/L)。
[0019] 本發(fā)明還涉及一種所述重組鹵醇脫鹵酶在催化拆分環(huán)氧化物制備手性環(huán)氧化物 中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為 催化劑，以環(huán)氧化物為底物，加入親核試劑，在pH值為4?7的緩沖液中，于35°C、150r/ min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得手性環(huán)氧化物；所述環(huán)氧化物為苯 基環(huán)氧乙烷或環(huán)氧氯丙烷，所述濕菌體的用量為10?50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度 為10?lOOmmol/L緩沖液（優(yōu)選20-40mmol/L)，所述親核試劑為NaN 3, NaNO2或NaCN，所述 親核試劑的加入量為20?200mmol/L緩沖液（優(yōu)選50-100mmol/L)。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述的反應(yīng)各條件可按本領(lǐng)域此類反應(yīng)的常規(guī)條件進(jìn)行選擇。
[0021] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0022] 此外，本發(fā)明從土壤微生物中經(jīng)過初篩、復(fù)篩和分離純化，得到一種能夠產(chǎn)鹵醇脫 鹵酶的新菌株---運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405,保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏日期為2014年5月7日，保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2014187,保藏地址為中 國武漢武漢大學(xué)，郵編430072。
[0023] 本發(fā)明所述的運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌可在溫度25_35°C范圍內(nèi)生長，在pH5-9的環(huán)境中 生存。
[0024] 所述運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌ZJB1405的培養(yǎng)基組成：甘油l-30g/L，酵母膏l(xiāng)-30g/ L，蛋白胨 l_20g/L，（NH4)2SO4O. l-3g/L，K2HPO4O. l-3g/L，Na2HPO4 · 2Η200· l-3g/L， NaH2PO4 · 12Η200· l-3g/L，MgSO4 · 7Η200· l-3g/L，NaClO. l-3g/L，溶劑為去離子水，ρΗ5-8， 121°〇滅菌2〇111；[11。
[0025] 所述運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405的培養(yǎng)方法較佳地包括搖瓶 培養(yǎng)：其中，所述搖瓶裝液量為10% -30% (v/v)，接種量為1-8%，培養(yǎng)溫度為20-40°C，搖 床轉(zhuǎn)速為100-200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為24-72h，培養(yǎng)液離心、洗滌得到靜息細(xì)胞。
[0026] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：針對(duì)目前報(bào)道的產(chǎn)鹵醇脫鹵酶菌株和已克隆表達(dá) 研究的鹵醇脫鹵酶較少，并且僅有Hhe C的突變體應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)等問題。篩選到一株 產(chǎn)鹵醇脫鹵酶菌株：運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis ZJB1405)。本發(fā)明的鹵醇脫鹵 酶是首次從運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌中克隆表達(dá)得到，該鹵醇脫鹵酶與已確認(rèn)的其它鹵醇脫鹵酶相 似性很低（小于40% )，該鹵醇脫鹵酶能夠不對(duì)稱催化1，3-二氯丙醇（比活力：2696. 7U/ g)和1，3-二溴丙醇（比活力：6188. 7U/g)生成（S)-環(huán)氧氯丙烷和（S)-環(huán)氧溴丙烷，且比 活力和（S)-環(huán)氧氯丙烷和（S)-環(huán)氧溴丙烷的ee值都是目前最高的（>60%)。同時(shí)該原 始鹵醇脫鹵酶和其它野生型鹵醇脫鹵酶相比，對(duì)（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的活性要明顯 遠(yuǎn)高于其它鹵醇脫鹵酶，是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)于該底物活性最高的一種天然鹵醇脫鹵酶，可以 不經(jīng)改造直接用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的重組鹵醇脫鹵酶可作為催化劑應(yīng)用于制備環(huán)氧化 物或手性環(huán)氧化物以及阿托伐他汀中間體，催化效率高，對(duì)映選擇性強(qiáng)，底物適應(yīng)性廣，具 有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為克隆載體pGEM-T_HHDHTm物理圖譜；
[0028] 圖2為pET28b-HHDHTm重組質(zhì)粒物理圖譜；
[0029] 圖3為鹵醇脫鹵酶基因 PCR擴(kuò)增argrose電泳圖；其中，2?5為利用引物1和引 物2擴(kuò)增得到的鹵醇脫鹵酶基因片段；1為DL2000DNA Marker ;
[0030] 圖4陽性重組質(zhì)粒pET28b-HHDHTni的酶切結(jié)構(gòu)圖；其中，1為λ DNA/Hind III DNA Marker ;2 為 pET28b-HHDHTni/Nde I 樣品；3 為 pET28b-HHDHTni/Xho I 樣品；4 為 pET28b-HHDHTni/Nde I and Not I 樣品；5 為 DL2000DNA Marker 片段。
[0031] 圖 5 為鹵醇脫鹵酶 SDS-PAGE 圖；I :IPTG 未誘導(dǎo)的 Ε· coli BL21/pET28b-HHDHTni ; 2 :誘導(dǎo)的E. coli BL21/pET28b-HHDHTm ;3 :細(xì)胞破碎上清液，4 :細(xì)胞破碎沉淀，5 :蛋白質(zhì)分 子量 Marker ; (五）【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0033] 實(shí)施例1 :運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405的獲取
[0034] 本發(fā)明從浙江、江蘇、福建省沿海地區(qū)取海泥等樣品100余份，利用1，3-二氯丙醇 或（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯為唯一碳源，以溴百里香酚藍(lán)為pH指示劑，進(jìn)行兩輪富集 篩選培養(yǎng)，篩選鹵醇脫鹵酶產(chǎn)生菌，通過反復(fù)篩選，分離得到一株高活力的鹵醇脫鹵酶產(chǎn)生 菌。篩選的具體方法：將海泥樣品用無菌水制成土壤懸浮液，取I. OmL上清液，加入到篩選 培養(yǎng)基中，于30°C，150rpm搖床上振蕩培養(yǎng)4天，之后取該培養(yǎng)液無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀 釋，取10'10'KT 8的梯度稀釋液涂布到LB固體培養(yǎng)基上，置30°C恒溫培養(yǎng)3天。挑取生 長出的單菌落接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在30°C搖床上培養(yǎng)2天，離心收集菌體， 并用磷酸鹽緩沖液（PH8.0)洗滌，收集濕菌體。濕菌體用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件如下：磷酸鹽緩 沖液（200mM，pH8. 0)中加入30g/L濕菌體，1，3-二氯丙醇20mmol/L緩沖液，置于35°C水 浴搖床轉(zhuǎn)化2h，取ImL轉(zhuǎn)化液，乙酸乙酯萃取后，取有機(jī)層進(jìn)行氣相檢測(cè)分析。采用氣相檢 測(cè)環(huán)氧氯丙烷的濃度，采用GC-14A系統(tǒng)，色譜柱類型：BGB-175毛細(xì)管柱；色譜條件：柱溫 90°C，進(jìn)樣室溫度220°C，F(xiàn)ID檢測(cè)器220°C，氦氣流量為1.6mL/min ;分流比為40:1。酶活 單位（U)定義為：在35°C、pH10. 0條件下，在Imin內(nèi)催化1，3-二氯丙醇生成1 μ mol環(huán)氧 氯丙烷所需要的酶量定義為1U。根據(jù)體系中環(huán)氧氯丙烷的生成量推知重組菌酶活。根據(jù)活 力檢測(cè)，得到酶活最高的一株菌株，編號(hào)ZJB1405,并進(jìn)行鑒定。
[0035] 本發(fā)明篩選得到的菌株ZJB1405,按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》以及《伯杰氏細(xì)菌 鑒定手冊(cè)（第八版）》的生理生化鑒定，革蘭氏陰性、桿狀。固體平板培養(yǎng)基上的菌落特征： 菌落顏色白色、不透明、表面光滑、濕潤、邊緣規(guī)則、無暈環(huán)、菌落形態(tài)中小，圓，中央凸起。
[0036] 所述篩選培養(yǎng)基終濃度組成：1，3-DCP2. 7g/L或（S) -4-氯-3-羥基丁酸 乙酯 2. 4g/L，（NH4) 2S04lg/L，K2HP04lg/L，Na 2HPO4 · 2H201g/L，NaH2PO4 · 12H202g/L， MgSO4 · 7H200. 5g/L, FeSO4 · 7H200. Olg/L, CuSO4 · 5H200. Olg/L, MnSO4 · 5H200. Olg/L, pH6. 8, 溶劑為去離子水。
[0037] 所述固體LB培養(yǎng)基終濃度組成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC110g/L，ρΗ7· 0， 溶劑為去離子水，pH值自然。
[0038] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成：甘油10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5g/L， (NH4) 2S04lg/L，K2HP04lg/L，Na 2HPO4 · 2H201g/L，NaH2PO4 · 12H202g/L，MgSO4 · 7Η200· 5g/L， NaC13g/L，pH7. 0,溶劑為去離子水。
[0039] 篩選得到的菌株ZJB1405,進(jìn)行生理生化鑒定，并按精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南方法 提取染色體DNA，以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物16S-8 :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和16S-1541 :AAGGAGGTGATCCAGCCGCA擴(kuò)增菌株的16SrDNA基因，將基因產(chǎn)物同T載體連接 后，后委托上海桑尼對(duì)該菌16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序，得到該菌株的16S rDNA序列后，在NCBI 網(wǎng)站上用BLAST檢索GenBank中相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，并進(jìn)行同源性比對(duì)?；?形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析等方面的鑒定，確定該菌為運(yùn)動(dòng)替 斯崔納菌，命名為運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405,此菌株已于2014年5月 7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No:M 2014187。
[0040] 菌株 ZJB140516S rDNA 序列
[0041] I GGGCCTTCGA CTTCCTTGTT ACGACTTCAC CCCAGTCGCT GACCTTACCG TGGACGGCTG CCTCCCTTAC
[0042] 71 GGGTCAGCTC ACCGGCTTCG GGTAAAACCA ACTCCCATGG TGTGACGGGC GGTGTGTACA AGGCCCGGGA
[0043] 141 ACGTATTCAC CGCGGCATGC TGTTCCGCGA TTACTAGCGA TTCCGACTTC ATGCACTCGA GTTGCAGAGT
[0044] 211 ACAATCCGAA CTGAGACGAC TTTTTGAGAT TAGCTTCACC TCGCGATGTC GCTGCCCACT GTAGTCGCCA
[0045] 281 TTGTAGCACG TGTGTAGCCC AGCCCATAAG GGCCATGAGG ACTTGACGTC ATCCCCACCT TCCTCCGGCT
[0046] 351 TATCACCGGC AGTTTCCCTA GAGTGCCCAG CCGAACTGAT GGCAACTAAG GATGAGGGTT GCGCTCGTTG
[0047] 421 CGGGACTTAA CCCAACATCT CACGACACGA GCTGACGACA GCCATGCAGC ACCTGTGTGA CGTCCGGCCG
[0048] 491 AACCGAAAAC CCCGTCTCCA GGGTCGCGAC GTCCATGTCA AGGGCTGGTA AGGTTCTGCG CGTTGCTTCG
[0049] 561 AATTAAACCA CATGCTCCAC CGCTTGTGCG GGCCCCCGTC AATTCCTTTG AGTTTTAACC TTGCGGCCGT
[0050] 631 ACTCCCCAGG CGGAGTGCTT AACGCGTTAG CTACGACACT GCGATACTAA GTATCCCAAC GTCCAGCACT
[0051] 701 CATCGTTTAC GGCGTGGACT ACCAGGGTAT CTAATCCTGT TTGCTCCCCA CGCTTTCGTG CCTCAGCGTC
[0052] 771 AGTTTCGGGC CAGGCAGCCG CCTTCGCCAC CGGTGTTCTT CCCAATATCT ACGAATTTCA CCTCTACACT
[0053] 841 GGGAATTCCA CTACCCTCTC CCGACTCCAG CCTACCAGTC TCAAAGCAGT TCCGGAGTTG AGCCCGGGCT
[0054] 911 TTCACTTCTG ACTTGATAAG CCGCCTACGC ACGCTTTACG CCCAGTAAAT CCGAACACGC TAGCCCCCTT
[0055] 981 CGTATTACGC GGCTGCTGGC ACGAAGTTAG CGGGGCTTCT TCTACGGGTA CGTCATTATC TTCCCGTCGA
[0056] 1051 AAGAGCTTAC AATCGAAGAC CTTCATCACT CACGCGCATG CTGGAATCAA GCTTCGGCAA TGTCATAATC
[0057] 1121 CCACTGCTGC TCCGTAGGGA GTCTGACAG
[0058] 實(shí)施例2 :鹵醇脫鹵酶目的基因的克隆
[0059] 根據(jù)Genbank中收錄的預(yù)測(cè)為Tistrella mobilis酶基因序列（Genbank登錄號(hào)： CP003236. 1)為依據(jù)，設(shè)計(jì)PCR引物如下：
[0060] 上游引物：CGCCATATGATGCCTGTCACCGACACCGC
[0061] 下游引物：ATTTGCGGCCGC TTACGGCCAGCCGCCGGTG
[0062] 其中，上游引物中帶下劃線部分為Nde I酶切位點(diǎn)，下游引物中帶下劃線部分為 Not I酶切位點(diǎn)。
[0063] 以運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405的總基因組DNA為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系各組分加入量（總體積100 μ L) :10XPfu DNA Polymerase BufferlO μ L (Mg2+)，IOmM dNTP mixture (dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5mM) 0· 5 μ L，濃度 為 50 μ M 的克隆引物 1、引物 2 各 0.5 μ L，基因組 DNA 1 μ L，Pfu DNA Polymerasel μ L，無 核酸水86. 5 μ L。
[0064] 采用Biorad的PCR儀，PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94°C 3min，然后進(jìn)入溫度循環(huán) 94°C 30s，60°C 30s，72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin，終止溫度為 4°C。
[0065] PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收750bp左 右出現(xiàn)明顯條帶（圖3)。然后用Taq酶PCR加 A，再與T載體進(jìn)行連接，得到克隆重組質(zhì)粒 pGEM-T-HHDHTm(見圖1)。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，利用菌落PCR測(cè)序，挑 取陽性菌落培養(yǎng)送樣測(cè)序，利用軟件分析測(cè)序結(jié)果，結(jié)果表明：經(jīng)引物1和引物2擴(kuò)增到的 核苷酸序列長度為747bp (其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示），該序列編碼一個(gè)完整的開 放閱讀框。
[0066] I ATGCCTGTCA CCGACACCGC GCCCCGCGTG GCGCTGGTTA CCAATGCGAC CAAATATGCC
[0067] 61 GGCGCCCCCA CGGTGGCGGC GCTTGCCAGC CAGGGCTGGC AGATCATCGC CCATGACGCA
[0068] 121 TCCTTCACCG ACGTGGCGGC CCGTGCCGCC TGGGAGGCGG ACAACCAGGG CATGACCGCC
[0069] 181 GCCGAGGCTC AGGATCCGGC CGGGTTGATC GCCGAAGTGC GCGACCGGAT GGGCGGGCTG
[0070] 241 CACGGTATCG TTTCCAACGA CGCCTATCCC GCGATCCGTC GCCGTATCGA AGAGACCGAG
[0071] 301 GCGGAGGCGC TGCGCGAGAT GCTGGAGGCG CTGACCGTCT TCCCCTTCGC GCTCGCCTCG
[0072] 361 GCAGTGACCC CACACCTGAA GGCGCAGGGC GCCGGCGCCA TCGTGATGGT CACCTCCGCA
[0073] 421 TCGCCGCGCC GTCCCTACCC GGGGTTCGCG ATGTACGCAA CCGCCCGCTC GGCCTCGACC
[0074] 481 GGGCTTGCCA AGGCACTGGC GAACGAGCTG GCGCCCCATG GCATCCGGGT GAATGCCGTG
[0075] 541 GCGCCGAACT TCCTCTACAG CGAGACCTAT TACCCGCGCG CCAAATGGAT CGACGATCCC
[0076] 601 GCCGGTGCCG CCCGGGTGCG CGAGATGGTA CCGCTCGGCC GTCTGGGCCG GCCCGAGGAG
[0077] 661 ATCGGTGAAC TGATTGCTTT CCTGCTGTCC GACAAGGCCG GCTTTGTGGT CGGCGAGACC
[0078] 721 GTGGGCTTCA CCGGCGGCTG GCCGTAA
[0079] 利用軟件對(duì)該基因序列進(jìn)行分析，推知所述鹵醇脫鹵酶基因編碼SEQ ID NO :2所 示的氨基酸序列：
[0080] I MPVTDTAPRV ALVTNATKYA GAPTVAALAS QGffQIIAHDA SFTDVAARAA WEADNQGMTA
[0081] 61 AEAQDPAGLI AEVRDRMGGL HGIVSNDAYP AIRRRIEETE AEALREMLEA LTVFPFALAS
[0082] 121 AVTPHLKAQG AGAIVMVTSA SPRRPYPGFA MYATARSAST GLAKALANEL APHGIRVNAV
[0083] 181 APNFLYSETY YPRAKffIDDP AGAARVREMV PLGRLGRPEE IGELIAFLLS DKAGFVVGET
[0084] 241 VGFTGGWP*
[0085] 實(shí)施例3重組表達(dá)質(zhì)粒和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備
[0086] 將實(shí)施例2中獲得的含有鹵醇脫鹵酶基因克隆質(zhì)粒，37°C用限制性內(nèi)切酶Nde I 和Not I雙酶切5h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（愛思進(jìn)生物 技術(shù)（杭州）有限公司）回收目標(biāo)片段。在T4DNA連接酶的作用下，將目標(biāo)片段與同樣經(jīng)Nde I和Not I酶切后的載體質(zhì)粒pET28b，在16°C下連接過夜得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b-HHDHTm。
[0087] 將上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（E. coli)BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在含有 終濃度50mg/L硫酸卡那霉素的LB平板上對(duì)陽性重組體進(jìn)行篩選，挑取單克隆，菌落PCR 驗(yàn)證陽性克隆。獲得陽性重組轉(zhuǎn)化體大腸桿菌（E. coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm。隨 機(jī)挑取克隆抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖4所示，從圖4可以看出陽性重組質(zhì)粒 pET28b-HHDHTm單酶切在3泳道和4泳道出現(xiàn)單一的與預(yù)期相符的條帶，雙酶切后5泳道出 現(xiàn)兩條帶，一條帶與目的基因片段大小一致。該結(jié)果說明目的基因已經(jīng)克隆至pET28b的 Nde I和Not I位點(diǎn)。
[0088] 實(shí)施例4重組鹵醇脫鹵酶的表達(dá)
[0089] 將實(shí)施例3所得的重組大腸桿菌，接種至含終濃度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培 養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1% (v/v)的接種量接入裝有IOOmL LB培養(yǎng)基的500mL三角 瓶中，置37°C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD 600達(dá)到0. 6時(shí)，加入終濃度為0. 5mM 的IPTG作為誘導(dǎo)劑，28°C誘導(dǎo)10h，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞（即濕菌體），并用磷酸鹽緩沖 液洗滌兩次，得靜息細(xì)胞。將所得靜息細(xì)胞懸浮于20mL pH8. 0的緩沖液中，在冰浴中超聲破 碎，離心收集上清，即為重組鹵醇脫鹵酶的粗酶液。粗酶液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（圖 5)，重組蛋白在細(xì)胞中以部分可溶的形式存在，另外有部分蛋白存在于細(xì)胞碎片中。
[0090] 實(shí)施例5:鹵醇脫鹵酶催化1，3-二氯丙醇合成（S)-環(huán)氧氯丙烷
[0091] 以實(shí)施例4中獲得的含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌（E. coli) BL21 (DE3)/pET28b-HHDHTm濕菌體作為轉(zhuǎn)化用酶，并以大腸桿菌（E. coli)BL21 (DE3)、大腸 桿菌（E·coli)BL21(DE3)/pET28b、重組大腸桿菌（E·coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDH Tnl未誘 導(dǎo)發(fā)酵菌體作為對(duì)照菌。以1，3-二氯丙醇為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備環(huán)氧氯丙烷。轉(zhuǎn)化體 系組成及轉(zhuǎn)化操作如下：10mL甘氨酸-NaOH緩沖液（ρΗΙΟ. 0)中加入0. 2g濕菌體和40mmol/ L緩沖液的1，3-二氯丙醇（以不加菌體的反應(yīng)體系作為對(duì)照，有0. 5mmol/L消旋的環(huán)氧氯 丙烷生成），35°C搖床150r/min條件下反應(yīng)lmin，用等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取兩次， 合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用氣相色譜分析測(cè)定底物的轉(zhuǎn)化率和ee值。1，3-二氯丙 醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，（S)-環(huán)氧氯丙烷的收率達(dá)82. 4%，ee值達(dá)到60. 1 %。
[0092] 采用氣相檢測(cè)環(huán)氧氯丙烷的濃度，采用GC-14A系統(tǒng)，色譜柱類型：BGB_175毛細(xì)管 柱；色譜條件：柱溫90°C，進(jìn)樣室溫度220°C，F(xiàn)ID檢測(cè)器220°C，氦氣流量為I. 6mL/min ;分 流比為40:1。
[0093] 酶活單位（U)定義為：在35°C、pH10. 0條件下，在Imin內(nèi)催化1，3-二氯丙醇生成 1 μ mol環(huán)氧氯丙烷所需要的酶量定義為1U。根據(jù)體系中環(huán)氧氯丙烷的生成量推知重組菌 酶活。測(cè)定結(jié)果見表1。
[0094] 表1 :以重組大腸桿菌BL21/pET28b-HHDHTm為酶源測(cè)定的鹵醇脫鹵酶活力
[0095]

【權(quán)利要求】
1. 一種來源于運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405的重組齒醇脫齒酶，其 特征在于：所述重組鹵醇脫鹵酶的氨基酸序列如SEQ ID N〇:2所示。
2. -種權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷 酸序列為SEQ ID No:l所示。
3. -種權(quán)利要求2所述編碼基因構(gòu)建的重組載體。
4. 一種權(quán)利要求3所述重組載體構(gòu)建的重組基因工程菌。
5. -種權(quán)利要求2所述編碼基因在制備重組鹵醇脫鹵酶中的應(yīng)用，其特征在于所述的 應(yīng)用為：構(gòu)建含所述重組鹵醇脫鹵酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中， 獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組鹵醇脫鹵酶的菌體細(xì)胞。
6. -種權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶在催化鹵代醇制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用，其 特征在于所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催 化劑，以鹵代醇為底物，在pH值為8?10的緩沖液中，于35°C、150r/min條件下反應(yīng)，反 應(yīng)結(jié)束后，獲得含手性環(huán)氧化物的混合液；所述鹵代醇為1，3-二氯丙醇、1，3-二溴丙醇、 2_氯-1-苯乙醇、1，3-二溴-2-丙醇或2, 3-二溴-2-丙醇，所述濕菌體的用量為10?50g/ L緩沖液，所述底物的初始濃度為5?50mmol/L緩沖液。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將含重組鹵醇 脫鹵酶基因的工程菌接種至含終濃度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng) 過夜，按體積濃度1 %的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，置37°C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培 養(yǎng)液的OD600達(dá)到0. 6時(shí)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG作為誘導(dǎo)劑，28°C誘導(dǎo)10h，將培養(yǎng) 液離心,收集濕菌體。
8. -種權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶在催化鹵代羥基丁酸乙酯脫鹵中的應(yīng)用，其特 征在于所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化 齊U，以鹵代羥基丁酸乙酯為底物，在pH值為7?10的緩沖液中，于35°C、150r/min條件下 反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得含（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的混合液；所述鹵代羥基丁酸乙 酯為（S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯或（S)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，所述濕菌體的用量為 10?60g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為10?150g/L緩沖液。
9. 一種權(quán)利要求1所述重組鹵醇脫鹵酶在拆分環(huán)氧化物制備手性環(huán)氧化物中的應(yīng)用， 其特征在于所述的應(yīng)用為：以含重組鹵醇脫鹵酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體 為催化劑，以環(huán)氧化物為底物，加入親核試劑，在pH值為4. 0?7. 0的緩沖液中，于35°C、 150r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得含手性環(huán)氧化物的混合液；所述環(huán)氧化物為苯基 環(huán)氧乙烷或環(huán)氧氯丙烷，所述濕菌體的用量為10?50g/L緩沖液，所述底物的初始濃度為 10?100m 〇ml/L緩沖液，所述親核試劑為NaN3, NaN02或NaCN，所述親核試劑的加入量為 20?200mmol/L緩沖液。
10. 運(yùn)動(dòng)替斯崔納菌（Tistrella mobilis)ZJB1405,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏日期為2014年5月7日，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M 2014187,保藏地址為中國武漢武漢 大學(xué)，郵編430072。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK104263713SQ201410438169
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】柳志強(qiáng), 鄭裕國, 薛鋒, 王亞軍, 萬南微, 竇賓賢, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)