豬sod1基因在抗prrs病毒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及豬SOD1基因在抗PRRS病毒中的新用途，具體提供了豬SOD1基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其是通過(guò)豬SOD1基因的CDS序列在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)來(lái)抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。本發(fā)明還提供了制備抗PRRS病毒轉(zhuǎn)基因豬的方法，以及利用SOD1基因表達(dá)量篩選抗PRRS病毒豬的方法。
【專利說(shuō)明】豬S0D1基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及豬SODl基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)，俗稱"藍(lán)耳病"是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)引起的，該病毒是巢狀病毒目動(dòng)脈炎病毒科的一個(gè)成員，同屬的病毒還有馬動(dòng)脈炎 病毒、鼠乳酸脫氫酶病毒和猴出血熱病毒。該病主要引起豬的繁殖與呼吸癥狀，表現(xiàn)為間 質(zhì)性肺炎和母豬流產(chǎn)木乃伊胎等，每年對(duì)全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2007年 在中國(guó)爆發(fā)了一場(chǎng)高熱病，該病迅速在全國(guó)范圍蔓延，超過(guò)200萬(wàn)頭豬被感染，40萬(wàn)頭豬死 亡，該病最后證實(shí)是由一種高致病性的藍(lán)耳病毒引起的。PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細(xì) 胞，現(xiàn)在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干擾素應(yīng) 答，體液免疫不能及時(shí)產(chǎn)生有效的中和抗體，而且會(huì)形成抗體依賴的病毒增強(qiáng)效應(yīng)，最終導(dǎo) 致免疫抑制和持續(xù)感染。由于該病毒的突變率極高，傳統(tǒng)疫苗方法也不能有效控制該病，很 多研究都致力于尋找RNAi、干擾素等新的方法來(lái)針對(duì)該病毒，用于彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供豬SODl基因在抗PRRS病毒中的新用途。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供豬SODl基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其是通過(guò) 豬SODl基因的CDS序列在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)來(lái)抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。本發(fā)明中涉 及的豬SODl基因的CDS序列如下：
[0005] i) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或
[0006] ii) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0007] iii)在嚴(yán)格條件下與Seq ID No. 1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0008] 所述嚴(yán)格條件為在含0. 1 % SDS的0. I X SSPE或含0. 1 % SDS的0. I X SSC溶液中， 在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0009] 本發(fā)明還提供豬SODl基因的表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為 pCMV-Myc-N，在出發(fā)載體pCMV-Myc-N中導(dǎo)入豬SODl基因的CDS序列。
[0010] 本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)載體的工程菌。
[0011] 本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞來(lái)自除胚胎細(xì) 胞外的豬體細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明還提供一種制備克隆胚胎的方法，其是以上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì) 胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過(guò)核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
[0013] 本發(fā)明還提供一種制備抗PRRS病毒轉(zhuǎn)基因豬的方法，其是將豬SODl基因的⑶S 序列整合至豬基因組中，從而實(shí)現(xiàn)在豬中過(guò)表達(dá)SODl基因。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種篩選抗PRRS病毒豬的方法，即根據(jù)豬SODl基因表達(dá)量篩 選抗PRRS病毒豬。SODl表達(dá)量高的豬比SODl表達(dá)量低的豬具有更高的抗PRRS病毒感染 能力。
[0015] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)SODl (superoxide dismutase 1)基因與抗藍(lán)耳病相關(guān)，它可以 編碼生成銅/鋅超氧化物歧化酶，其分布在生物體內(nèi)的各個(gè)組織器官中；超氧化歧化酶主 要負(fù)責(zé)清除生物體正常代謝產(chǎn)生的有害氧自由基(V (超氧陰離子自由基），而(V具有細(xì)胞 毒性，可使脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷細(xì)胞膜，引起炎癥，腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機(jī)體衰 老。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SODl可以顯著抑制PRRS病毒在猴胚胎腎上皮細(xì)胞Marcl45中的復(fù) 制。
[0016] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新的抑制PRRSV復(fù)制的豬SODl基因主要包括以下兩個(gè)用途：
[0017] (一）可以通過(guò)對(duì)豬的SODl基因的表達(dá)量的測(cè)定，篩選抗PRRS病毒豬。分析表 明，相對(duì)于沒(méi)有過(guò)表達(dá)SODl基因的細(xì)胞，過(guò)表達(dá)SODl基因的細(xì)胞可以顯著抑制PRRS病毒 的復(fù)制，因此，SODl表達(dá)量高的豬可能會(huì)比SODl表達(dá)量低的豬更加抗PRRSV的感染，從而 達(dá)到根據(jù)SODl基因的表達(dá)量高低來(lái)篩選抗PRRSV的豬。
[0018] (二）可以利用轉(zhuǎn)基因等基因工程技術(shù)手段，使得SODl基因在豬中的表達(dá)量升高， 從而得到SODl表達(dá)量高的豬，進(jìn)而培育出抗PRRSV的豬。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的SODl在通城豬和長(zhǎng)白豬感染 PRRSV的第0天、第3天、第5天和第7天肺組織中的表達(dá)模式和相對(duì)表達(dá)量；橫坐標(biāo)代表 時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)代表相對(duì)表達(dá)量（RPKM)。
[0020] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中原始載體pCMV-Myc-N的載體圖譜。
[0021] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中MARC145細(xì)胞攻毒實(shí)驗(yàn)后24小時(shí)PRRSV的拷貝數(shù)；橫坐 標(biāo)代表對(duì)照組和攻毒組；縱坐標(biāo)代表PRRSV 0RF7的相對(duì)表達(dá)量。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0023] 實(shí)施例1利用分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)方法發(fā)現(xiàn)新的抗PRRSV感染的基因 SODl
[0024] 由于不同的豬品種和個(gè)體的遺傳背景差異，對(duì)藍(lán)耳病的抗性也不同，研究表明在 臨床癥狀和生理生化指標(biāo)上，通城豬、梅山豬等國(guó)內(nèi)豬品種相較于國(guó)外長(zhǎng)白豬、大白豬等感 染高致病性PRRSV后有較強(qiáng)的抗性。通過(guò)高通量測(cè)序的方法，對(duì)感染PRRSV前后長(zhǎng)白豬和 通城豬的組織做差異基因表達(dá)分析，某些免疫相關(guān)的基因表達(dá)量在感染前后兩個(gè)品種間有 顯著的差異。通過(guò)對(duì)不同品種間PRRSV感染造成的基因表達(dá)差異的分析，不僅可以研究藍(lán) 耳病的感染機(jī)制，還可以找出抗性或易感相關(guān)的基因，從而為藍(lán)耳病的治療和預(yù)防提供新 方法。
[0025] 前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)6個(gè)品種豬（長(zhǎng)白豬、大白豬、杜洛克豬、清平豬、梅山豬、通城豬） 感染高致病性藍(lán)耳病毒（PRRSV)進(jìn)行抗病豬的篩選，通過(guò)臨床癥狀記錄：采食量、體溫、生 理生化、細(xì)胞因子以及存活時(shí)間等的檢測(cè)，最后得到了對(duì)藍(lán)耳病抗性差異較大的兩個(gè)品種， 長(zhǎng)白豬（易感豬）、通城豬（抗病豬）。
[0026] 選取抗病豬和易感豬各8頭，分別在第0天和感染高致病PRRSV后第3、5、7天宰 殺取樣，肺組織提取總RNA，建庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果表明，在 攻毒后第3天，SODl在通城豬肺組織中的相對(duì)表達(dá)量（RPKM) 72. 17,大于長(zhǎng)白豬的41. 77 ; 而且在通城豬肺組織中SODl的表達(dá)在感染后3、5、7天持續(xù)升高，在長(zhǎng)白豬肺組織中SODl 在感染后第3和第5天卻大幅度下調(diào)（圖1)。
[0027] 實(shí)施例2利用細(xì)胞生物學(xué)研究方法驗(yàn)證SODl基因抗PRRSV感染
[0028] 1.設(shè)計(jì)針對(duì)SODl基因（GenBank登錄號(hào)為NM_001190422)的引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)，反轉(zhuǎn)錄mRNA并擴(kuò)增得到SODl基因的CDS序列，引物序列如下：
[0029] 上游引物 SODl-F :5' -GCGTCGAC CATGGCGACGAAGGCCGTGT-3'
[0030] 下游引物 SOD I-R : 5 ' -CCCTCGAG TTACTGGGTGATCCCAATTAC-3 '
[0031] 將擴(kuò)增得到的SODl基因的⑶S序列（SEQ ID No. 1)導(dǎo)入原始載體pCMV-Myc-N (購(gòu) 自Clonetech公司，載體圖譜如圖2所示），構(gòu)建pCMV-SODl-Myc載體。由于pCMV-Myc-N具 有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠使導(dǎo)入其中的SODl基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)。
[0032] pCMV-SODl-Myc載體的構(gòu)建方法如下：提取豬肺組織的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)形成 cDNA，利用引物擴(kuò)增得到SODl基因的⑶S序列；將⑶S序列進(jìn)行酶切并連接到pCMV-Myc-N 質(zhì)粒上；測(cè)序鑒定序列正確。
[0033] 2. SODl基因過(guò)表達(dá)的驗(yàn)證
[0034] 將構(gòu)建好的連有SODl基因 CDS序列的pCMV-SODl-Myc載體和未連接有SODl基因 的⑶S序列的pCMV-Myc-N載體，分別轉(zhuǎn)染MARC145細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)之后，按PRRSV病毒 CH-Ia 株感染劑量為 0.1 Μ. 0.1 (multiplicity of infection)感染細(xì)胞。
[0035] 3.細(xì)胞接種病毒后，培養(yǎng)24小時(shí)，并用Reed和Muench氏法計(jì)算病毒滴度，分析轉(zhuǎn) 染了帶有SODl基因 CDS序列的質(zhì)粒的細(xì)胞中的病毒滴度與轉(zhuǎn)染了不帶有SODl基因 CDS序 列的質(zhì)粒的細(xì)胞中的病毒滴度是否有顯著差異。結(jié)果顯示，在攻毒完成并培養(yǎng)24小時(shí)后， 轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)SODl基因 CDS序列的細(xì)胞中的PRRS病毒的病毒滴度要顯著的低于對(duì)照組 (圖 3)。
[0036] 通過(guò)比較過(guò)表達(dá)SODl基因的MARC145細(xì)胞和正常MARC145細(xì)胞中的PRRS的病 毒滴度，來(lái)分析SODl基因?qū)τ赑RRS病毒在MARC145細(xì)胞中復(fù)制的影響。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) SODl基因后，PRRS病毒在MARC145細(xì)胞中的復(fù)制明顯受到抑制，說(shuō)明SODl基因?qū)τ赑RRS 病毒的復(fù)制具有抑制作用，可以通過(guò)過(guò)表達(dá)SODl基因來(lái)達(dá)到抑制PRRS病毒復(fù)制的目的。
[0037] 本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作中包括：
[0038] (1)細(xì)胞培養(yǎng)
[0039] 在超凈工作臺(tái)中，利用胰酶（0. 25%胰酶+0. 04% EDTA)，消化細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基 (含10% FBS的DMEM)終止消化后，吹勻至單細(xì)胞懸液，按I X IO5?2 X IO5個(gè)/ml/孔的密 度接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞搖勻后，于37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0040] (2)細(xì)胞接毒及收毒
[0041] 細(xì)胞培養(yǎng)24h后，PBS清洗3遍，利用含1%雙抗（青、鏈霉素）的DMEM稀釋病毒，按 CH-Ia株病毒感染劑量為0. I M. 0. I感染細(xì)胞，將稀釋好的病毒加入到培養(yǎng)板中，于37°C， 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，棄去上清液，PBS清洗3遍，利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含1%雙抗的 DMEM)進(jìn)行維持培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞上清液，進(jìn)行TCID50測(cè)定。
[0042] (3) TCID5tl 測(cè)定
[0043] 用96孔板鋪48個(gè)孔的待感染細(xì)胞，每行從第10孔至第3孔依次將病毒原液利用 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含1 %雙抗的DMEM)進(jìn)行8個(gè)梯度稀釋，每個(gè)梯度設(shè)6孔重復(fù)，每孔100 μ 1的 病毒稀釋液，37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，PBS洗干凈培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，顯微鏡下 觀察細(xì)胞死亡率，記錄結(jié)果，按Reed和Muench氏法計(jì)算病毒滴度：
[0044] 距離比例=(高于50 %的死亡百分?jǐn)?shù)-50 % V (高于50 %的死亡百分?jǐn)?shù)-低于 50%的死亡百分?jǐn)?shù)）
[0045] Log(TCID5tl) = log(高于50%的死亡百分?jǐn)?shù)的稀釋度）+ (距離比例X稀釋倍數(shù)）
[0046] 實(shí)施例3過(guò)表達(dá)SODl基因的抗PRRSV的轉(zhuǎn)基因豬制備方法
[0047] 1、供體細(xì)胞（豬的胎兒成纖維細(xì)胞）的復(fù)蘇。從液氮中取出凍存管，快速投入37°C 水浴中，并不斷快速搖動(dòng)凍存管。待冷凍液徹底解凍后，轉(zhuǎn)移至離心管中，用新鮮培養(yǎng)液稀 釋3倍，lOOOrpm，離心5分鐘，出去上清，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需 濃度，接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
[0048] 2、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將連有SODl基因⑶S序列的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入供體細(xì)胞 中。常規(guī)方法消化細(xì)胞，用100 μ 1無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM稀釋0. 8 μ g待轉(zhuǎn)質(zhì)粒PCMV-SODl-Myc 和2 μ 1脂質(zhì)體（lip〇fectamineTM2000)。室溫孵育20分鐘后，向24孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔內(nèi) 添加100 μ 1上述液體。將培養(yǎng)板前后輕輕晃動(dòng)搖勻，培養(yǎng)4-6小時(shí)后更換培養(yǎng)液為完全細(xì) 胞培養(yǎng)基。
[0049] 3、轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞的篩選。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48小時(shí)的細(xì)胞加入800 μ g/mL G418,每 2-3天換液一次，篩選14天后，用PBS洗2遍，收集陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
[0050] 4、轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞的DNA檢測(cè)。按照常規(guī)分子克隆方法，提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞DNA 并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0051] 5、以上述轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，以體外成熟的初情期前母豬卵母細(xì) 胞為核移植受體細(xì)胞。將供體細(xì)胞以及成熟卵母細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)入39°C，5% C02,100%濕度平 衡10分鐘，然后在配有顯微操作儀器及恒溫臺(tái)的倒置顯微鏡上用固定吸管吸持卵母細(xì)胞， 用注射針將吸取卵母細(xì)胞核。然后挑選表面光滑的體細(xì)胞，從去核時(shí)裂口處放入卵周隙，用 注射針點(diǎn)壓透明帶，使供體細(xì)胞與受體卵的胞膜接觸緊密。將供體細(xì)胞-卵胞質(zhì)構(gòu)成的重 構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液？210中，在391：，5%0) 2，100%濕度培養(yǎng)箱中恢復(fù)1小時(shí)。
[0052] 6、將恢復(fù)好的重構(gòu)卵分批轉(zhuǎn)移到融合液中平衡2分鐘，用融合/激活液洗滌3遍 后，每批放5-8個(gè)放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，使供體細(xì)胞-受體卵細(xì)胞膜接觸面與電 極平行，用CUY-21融合儀（BEX，日本）施加1個(gè)lOOus，I. 4kv/cm的直流電脈沖誘導(dǎo)融合同 時(shí)激活，接著用PZM3培養(yǎng)液洗滌3遍，立即轉(zhuǎn)入礦物油覆蓋胚胎培養(yǎng)液中或輔助激活液中， 39°C，5% C02,100%濕度培養(yǎng)4小時(shí)后再體視顯微鏡下判定融合。
[0053] 7、克隆胚胎體外培養(yǎng)。將融合的重構(gòu)胚用胚胎培養(yǎng)液洗滌5遍后，轉(zhuǎn)入預(yù)平衡2 小時(shí)以上的胚胎培養(yǎng)液PZM3中，培養(yǎng)條件39°C，5% C02, 5% O2，90% N2，飽和濕度。
[0054] 8、挑選形態(tài)優(yōu)良的克隆胚胎用非手術(shù)法移入自然發(fā)情的經(jīng)產(chǎn)母豬子宮內(nèi)進(jìn)行妊 娠。
[0055] 9、對(duì)出生的克隆轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行PCR和Southern檢測(cè)，進(jìn)行功能研究。
[0056] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 豬S0D1基因在抗PRRS病毒中的應(yīng)用，其特征在于，其是通過(guò)豬S0D1基因的⑶S序 列在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)來(lái)抑制PRRS病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，所述豬S0D1基因的CDS序列為 ： i) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或 ii) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá) 相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 iii) 在嚴(yán)格條件下與Seq ID No. 1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0. 1 X SSPE或含0. 1 % SDS的0. 1 X SSC溶液中，在 65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
2. 豬S0D1基因的表達(dá)載體，其特征在于，出發(fā)載體為pCMV-Myc-N，在出發(fā)載體 pCMV-Myc-N中導(dǎo)入豬S0D1基因的CDS序列。
3. 含有權(quán)利要求2所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，其為轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞系。
5. 含有權(quán)利要求2所述表達(dá)載體的工程菌。
6. -種篩選抗PRRS病毒豬的方法，其特征在于，根據(jù)豬S0D1基因表達(dá)量篩選抗PRRS 病毒豬。
7. -種制備抗PRRS病毒轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于，其是將豬S0D1基因的CDS序列 整合至豬基因組中，從而實(shí)現(xiàn)在豬中過(guò)表達(dá)S0D1基因。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104263743SQ201410438876
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】李寧, 李佳, 任立明, 胡曉湘, 楊倩 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)