Igf-1基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)性的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種用于IGF-1基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星（序列表SEQIDNo.3）多態(tài)性的檢測試劑盒。所述試劑盒由1）PCR擴增體系，瓊脂糖凝膠電泳體系，聚丙烯酰胺凝膠電泳系,和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒以及說明書組成。本發(fā)明利用PCR技術，瓊脂糖凝膠電泳技術和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，通過分析聚丙烯酰胺凝膠電泳上電泳條帶位置以及條帶數(shù)目對不同樣本IGF-1基因啟動子區(qū)CA重復序列多態(tài)性進行檢測，本發(fā)明試劑盒經(jīng)濟實用且特異性好，靈敏度高，在IGF-1基因啟動子區(qū)CA重復序列多態(tài)性的檢測上具有廣泛的應用前景，該試劑盒可以用于糖尿病伴結直腸癌疾病發(fā)生的早期輔助診斷，糖尿病患者臨床用藥評估等研究領域。
【專利說明】IGF-1基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)性的檢測試劑盒

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種IGF-1基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)性的檢測試劑盒。本試劑盒能對IGF-1基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星既(CA)重復序列多態(tài)性進行檢測，尤其可以檢測出(CA)重復次數(shù)為(19)和(CA)重復次數(shù)為非19，以及(CA)重復次數(shù)為19的純合子和雜合子?？梢杂糜谔悄虿』颊甙殡S結直腸癌發(fā)生的輔助診斷，糖尿病患者臨床用藥的評估等研究領域。

【背景技術】
[0002]結直腸癌(Colorectal cancer, CRC)作為最常見的消化道腫瘤之一,在癌癥發(fā)病率中所占比例高達9%，發(fā)病率和死亡率分別居所有癌癥的第三位和第四位。其很多研究者也將目光鎖定在其研究機制上，流行病學研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病(Diabetes mellitus,DM)與包括結直腸癌在內的多種惡性腫瘤的發(fā)病密切相關。且長期接受胰島素治療患者該病發(fā)生的危險性增加2-3倍。
[0003]關于DM患者伴CRC發(fā)生風險增加的機制，有人提出了胰島素-胰島素樣生長因子(IGF)軸學說，即血清異常增高的胰島素水平可通過胰島素-1GF-1軸促進結直腸上皮細胞增殖轉化、抑制細胞凋亡導致CRC的發(fā)生。而大量研究報道，“高胰島素血癥”及高濃度的IGF-1會增加CRC的發(fā)生風險，有meta分析表明IGF-1濃度與大腸癌的發(fā)生風險正相關，總OR=L 56 ( 95% Cl:1.14-2.13)，血清高水平IGF-1是大腸癌的獨立危險因子。
[0004]國外研究報道表明血清IGF-1水平與IGF-1基因啟動子CA重復序列有關，IGF-1基因啟動子上游約Ikb處一段含有11-23個CA重復的多態(tài)性微衛(wèi)星片段，其中19次CA重復的等位基因頻率最高，被認為是野生型等位基因。攜帶(CA) 19/19的IGF-1濃度低于其雜合子基因型及其它基因型，所以CA重復次數(shù)與IGF-1的濃度相關。有學說認為高胰島素血癥可以通過胰島素-1GF-1軸促進結直腸上皮細胞增殖轉化、抑制細胞凋亡導致CRC的發(fā)生，所以非攜帶(CA) 19/19的基因型可能是易受胰島素影響而導致結直腸癌發(fā)生的高?；蛐汀＜葦y帶非(CA) 19/19的基因型的糖尿病患伴結直腸癌發(fā)生的風險會明顯，該基因型可能是易于發(fā)生結直腸癌的胰島素敏感基因型，所以在臨床上明確糖尿病患者IGF-1基因啟動子(CA)重復序列多態(tài)性，確定其基因型，可以對攜帶胰島素敏感基因型的糖尿病患者在使用胰島素上進行評估，為其提供個性化的治療方案，降低該類糖尿病患者伴結直腸癌發(fā)生的風險。所以(CA)重復序列多態(tài)性的檢測對于避免糖尿病患者伴結直腸癌發(fā)生至關重要。
[0005]關于(CA)重復序列多態(tài)性的檢測方法，目前較常用的方法是測序的方法，但是該方法的價格比較昂貴，不適合醫(yī)院廣泛開展，因此必須尋找一種應用簡單、結果可靠、價格低廉的，且適合臨床開展的技術來開發(fā)IGF-1基因啟動子區(qū)(CA)重復序列多態(tài)性檢測試劑盒以解決上述問題。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測IGF-1基因啟動子區(qū)(CA)重復序列多態(tài)性的試劑盒，以便篩查出糖尿病受試者的基因型是否是易受胰島素刺激而誘發(fā)結直腸癌的高危基因型，可以用于糖尿病患者伴隨結直腸癌發(fā)生的早期輔助診斷，以及糖尿病患者臨床使用藥的評估等研究領域。
[0007]我們經(jīng)過與測序等方法的對比評估，選擇了 PCR-單核苷酸構象多態(tài)性技術。
[0008]PCR-單核苷酸構象多態(tài)性技術是一種直接檢測基因突變的分子生物學技術，具有靈敏度高，特異性好，簡便，廉價等優(yōu)點。本發(fā)明采用PCR技術，根據(jù)單鏈DNA構象差別，即長度不同或單個核苷酸不同的單鏈DNA片段空間構象不同，當其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，電泳的位置會不同，根據(jù)電泳DNA marker分析不同受試者的基因型。本發(fā)明涉及的試劑盒可以廣泛用于糖尿病患者(CA)重復序列多態(tài)性檢測，提高檢測的可重復性和準確性，更準確的篩查出易受方案，可以大大地降低醫(yī)療成本和費用，減少醫(yī)療資源的浪費，對部分患者胰島素使用進行評估，為其提供個性化的治療方案，降低其結直腸癌發(fā)病風險，提聞患者生存質量。
[0009]本發(fā)明在對GENBANK上所有已知的IGF-1啟動子核酸序列進行比對的基礎上，最后選定GENBANK數(shù)據(jù)庫的序列NC_012920為模板設計引物，該引物在含有耐熱DNA聚合酶、高質量的脫氧糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等的PCR反應緩沖液中能實現(xiàn)體外擴增出特異性強含(CA)重復序列大小為150bp左右的擴增產(chǎn)物，擴增物的特異性和準確度經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，將在非變性的聚丙烯酰胺凝膠通過電泳條帶位置和數(shù)目實現(xiàn)對(CA)重復序列多態(tài)性的檢測。
[0010]本發(fā)明首先提供了與結直腸癌和糖尿病伴結直腸癌患者相關基因人胰島素樣生長因子I (IGF-1)基因啟動子微衛(wèi)星(CA)重復序列，該序列如序列表SEQ ID N0.1所示，該序列多態(tài)性影響IGF-1的表達水平。
[0011]本發(fā)明提供的IGF-1基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)性的檢測試劑盒，主要由1)PCR擴增體系，瓊脂糖凝膠電泳體系，聚丙烯酰胺凝膠電泳系，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒以及說明書組成。
[0012]本發(fā)明所述PCR擴增體系包括一對IGF-1啟動子特異的正、反向引物，MIX, DMSO,ddH20 ；所述的IGF-1特異的正反向引物分別為5’ -AACACACTCTGGCACACAGAC -3’和5，-ACCACTCTGGGAGAAGGGTAC-3，，濃度均為 0.16 μ M ；ΜΙΧ 是由濃度為 50mmol/L、pH =8.0的Tris-HCl、8mmol/L的MgC12、250mmol/L的KC1、5 %的甲酰胺組成的PCR緩沖液，和25mmol/L的dNTP組成；瓊脂糖凝膠電泳體系包括瓊脂糖，EB溶液，I X TBE緩沖液，10bpDNA ladder marker ;聚丙烯酰胺凝膠電泳體系包括I XTBE緩沖液，20%丙烯酰胺溶液，AP粉末，ddH20，攜帶(CA) 19的和不攜帶(CA) 19的DNA marker。
[0013]本發(fā)明PCR擴增的條件為:94°C 5分鐘；94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，30個循環(huán)；72°C 5分鐘。
[0014]本發(fā)明所述瓊脂糖凝膠的濃度為3%，即將0.6g瓊脂糖溶于20mLddH20中，且EB的終濃度為2.Sμg/ml。
[0015]所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃度為12%，且為非變性，既由20%丙烯酰胺溶液12.0mL, IXTBE 2.0mL (由 5 X TBE 稀釋所得)，ddH205.7 mL，TEMED 0.02mL, 10%AP 0.3mL 配制而成。
[0016]本發(fā)明在檢測待檢樣本時，通過參照DNA marker分析聚丙烯酰胺凝膠上電泳條帶所在的位置以及數(shù)目對糖尿病患者的IGF-1基因啟動子區(qū)(CA)重復序列多態(tài)性進行檢測。進而明確受試者的基因型，其中有兩條帶且兩條帶與DNA marker (CA) 19/19對應的位置一致是攜帶(CA) 19純合子，是野生基因型，四條帶為攜帶(CA) 19或不攜帶(CA) 19的雜合子，或有兩條帶且兩條帶與DNA marker (CA) 19/19對應的位置不一致是不攜帶(CA) 19的純合子，均為突變型。攜帶該類基因型的糖尿病患者IGF-1濃度高于野生型患者，是易受胰島素刺激而誘發(fā)結直腸癌的高危基因型，檢測結果可以用于糖尿病患者伴隨結直腸癌發(fā)生的早期輔助診斷，以及糖尿病患者臨床使用藥的評估等研究領域。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，優(yōu)點為:①可對糖尿病患者的IGF-1基因啟動子區(qū)(CA)重復序列多態(tài)性進行檢測，真實反映出糖尿病患者(CA)重復序列多態(tài)性，確定其基因型，有助于糖尿病患者伴結直腸癌發(fā)生的早期輔助診斷，以及糖尿病患者臨床使用藥的評估等研究領域?級PCR-單核苷酸構象多態(tài)性技術與測序方法比具有操作簡便、易行、價格低廉的優(yōu)點，更適合臨床開展，適用于大多數(shù)糖尿病患者的檢測；③通過對非聚丙烯酰胺凝電泳條帶分析，使結果更直觀，

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1顯示3%瓊脂糖凝膠電泳結果圖，含有(CA)重復序列片段的擴增和擴增特異性的檢測，147bp處即是目的片段。
[0018]圖2顯示12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果圖，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(CA)重復序列多態(tài)性的檢測，含不同重復次數(shù)的(CA)重復序列片段電泳條帶在膠上的位置會不同。
[0019]圖3顯示臨床樣本3%瓊脂糖凝膠電泳結果圖
圖4顯示臨床樣本12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果圖，其中純合子樣本有2條電泳條帶，雜合子樣本有4條電泳條帶，含不同重復次數(shù)的(CA)重復序列片段電泳條帶在膠上的位置不同。
[0020]

【具體實施方式】
[0021]技術熟練人員可以利用本發(fā)明試劑盒開展IGF-1啟動子(CA)重復序列多態(tài)性的檢測。在實施例中，引物序列由上海生工生物有限公司合成(PAEG純)。以下是在實施例中應用引物序列和名稱:
RJL-1 (SEQ ID NO:1) 5’-AACACACTCTGGCACACAGAC -3’ (21bp)
RJL-2(SEQ ID NO: 2) 5’ -ACCACTCTGGGAGAAGGGTAC-3’ (2lbp)
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0022]實施例1 IGF-1基因啟動子區(qū)微衛(wèi)星多態(tài)性的檢測試劑盒及其使用
1、制備包括下列組成成分的試劑盒:PCR反應體系中ΜΙΧ(1000μ1/管)1管，IGF-1基因正反向引物(400 μ I/管)各I管；瓊脂糖凝膠電泳體系中瓊脂糖(2g/瓶)I 瓶，EB 溶液(100 μ I/ 管)I 管，5ΧΤΒΕ 緩沖液(100ml/ 瓶)I 瓶，10bp DNA laddermarker (100 μ I/管)I管；聚丙烯酰胺凝膠電泳體系5XTBE緩沖液(100ml/瓶)I瓶，20%丙烯酰胺溶液(100ml/瓶)1瓶，AP粉末(lg/瓶)I瓶，攜帶(CA) 19的和不攜帶(CA)19 的 DNA marker (100 μ I/ 管)各 I 管。
[0023]2、標本的采集、保存和運輸:
2.1適用標本類型:EDTA抗凝的全血；
2.2標本采集:受試者的全血標本立即用于提取基因組DNA或置于_80°C保存以備后用。
[0024]3、含有(CA)重復序列片段擴增和擴增特異性的檢測；
3，I儀器設備、器材、試劑和材料
低溫冰箱超，超凈工作臺，微型低速離心機，快速混勻器，電子天平，加樣器，基因擴增儀，凝膠成像系統(tǒng)，電熱恒溫水浴鍋，各種規(guī)格的滴管等。
[0025]紅細胞裂解液:8.26克氯化銨，1.0克碳酸氫鉀，0.93克乙二胺四乙酸二鈉，加雙蒸水至1L。
[0026]10%SDS配制:IgSDS粉末溶解到1ml水中。室溫保存。
[0027]飽和Nacl配制:0.585g Nacl溶解到1ml容量瓶中，分別X2配20ml容量瓶。
[0028]200ml TKM 配制:0.24g Tris ；0.15g Kcl ；0.41g Mgcl2
TE (pH8.0):1OmmoIALTris.Cl (pH8.0), lmmol/LEDTA (pH8.0)
5XTBE 緩沖液配制:Tris 54g ；EDTA-Na2 3.72g ;硼酸 27.5g 配成 1000ml。
[0029]瓊脂糖(Agarose)凝膠配制:1.5g瓊脂糖加50ml IXTBE緩沖液,加熱、防溢；稍涼后加2.5 μ I核酸染液。
[0030]3.2基因組DNA的提取
⑴.抽取外周靜脈血8ml，其中4ml用EDTA抗凝用于提取DNA。
[0031](2).取0.5ml TKM緩沖液+ 0.5ml全血，充分混勻。
[0032](3).加13 μ I TritonX—100，充分混勻，靜置10分鐘以上，破壞紅細胞。
[0033](4).6500r/min離心5min,輕輕將上清倒掉。
[0034](5).向沉淀中加入1ml TKM液，用槍將沉淀打散，充分混勻，6500r/min離心5min。
[0035](6).重復3、4步驟，3次，至上清變無色。
[0036](7).將沉淀溶于200 μ I TKM液，用槍將沉淀打散，充分混勻，加15 μ I 10%SDS,充分混勻后加3 μ I蛋白酶K，再混勻，用封條將關口封緊，放水浴箱100°C，1min (勿將水浴箱門關上)。破壞白細胞。
[0037](8).加 75 μ I 飽和 NaCl，混勻。DNA 溶于其中，12000r/min，5min。
[0038](9).將240 μ I上清液轉移到另一個EP管，加750 μ I 95%冰乙醇，沉淀DNA，_20°C1min以上。
[0039](10).離心 12000r/min, 20min。
[0040](11).小心去上清,加入1ml 75%冰乙醇,洗漆沉淀,離心15000r,5min,去酒精,曬干沉淀。
[0041 ] (12).沉淀溶于25 μ I雙蒸水，-20 V短期保存。
[0042]3.3 DNA純度鑒定待提取的DNA完全溶于TE后，測定其在260nm， 280nm, 230nm下的0.D.值，計算每個樣本的純度和濃度。純度過低的樣本需重新提取。根據(jù)濃度將DNA原液稀釋成合適濃度的工作液。
[0043]3.4引物的設計
以人g基因組核酸序列(NCBI數(shù)據(jù)庫序列NC_012920)為模板，設計可以擴增出含CA重復的序列的片段的引物，序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，擴增產(chǎn)物長度在200bp內，以利于實施例2的實施。
[0044]3.5 PCR擴增體系構建表1 PCR擴增體系各組分

【權利要求】
1.一種與結直腸癌和糖尿病伴結直腸癌患者相關基因人胰島素樣生長因子I (IGF-1)基因啟動子微衛(wèi)星(CA)重復序列，該序列如序列表SEQ ID N0.3所不,該序列多態(tài)性影響IGF-1的表達水平。
2.一種檢測如權利要求1所述序列多態(tài)性的試劑盒，由I) PCR擴增體系，瓊脂糖凝膠電泳體系，聚丙烯酰胺凝膠電泳系，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒以及說明書組成；其特征在于，所述PCR擴增體系包括一對IGF-1啟動子特異的正、反向引物，MIX, DMSO, ddH20 ；IGF-1 啟動子特異的正、反向引物分別為 5’ -AACACACTCTGGCACACAGAC-3，和 5’ -ACCACTCTGGGAGAAGGGTAC-3，，濃度均為 0.16 μ M ；ΜΙΧ 是由濃度為 50mmol/L、pH =8.0 的 Tris-HCl、8mmol/L 的 MgCl2、250mmol/L 的 KC1、質量分數(shù)為 5% 的甲酰胺組成的PCR緩沖液，和25mmol/L的dNTP組成；瓊脂糖凝膠電泳體系包括瓊脂糖，EB溶液，I XTBE緩沖液，10bp DNA ladder marker ;聚丙烯酰胺凝膠電泳體系包括I X TBE緩沖液，20%丙烯酰胺溶液，AP粉末，ddH20,攜帶(CA) 19的和不攜帶(CA) 19的DNA marker。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于PCR擴增的條件為:94°C5分鐘；94°C30 秒，58 °C 30 秒，72°C 30 秒，30 個循環(huán)；72°C 5 分鐘。
4.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于瓊脂糖凝膠的濃度為3%，且EB的終濃度為 2.5 μ g/ml ο
5.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃度為12%，且非變性，既由 20% 丙烯 酰胺溶液 12.0ml, I XTBE 2.0ml, ddH20 5.7ml, TEMED 0.02ml, 10%AP0.3ml配制而成。
6.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于在檢測待檢樣本時，通過分析聚丙烯酰胺凝膠上電泳條帶所在的位置以及數(shù)目對糖尿病患者的IGF-1基因啟動子區(qū)(CA)重復序列多態(tài)性進行檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK104164432SQ201410439642
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權日:2014年9月1日
【發(fā)明者】劉蕊, 胡麗玲, 吳萍, 趙立杰, 許丹丹 申請人:天津市人民醫(yī)院