一種植物甾醇制備4-雄烯二酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種植物甾醇制備4-雄烯二酮的方法，包括如下步驟：步驟1，將自主分離與篩選得到的一株分桿菌株、種子斜面固體培養(yǎng)基和無菌水，恒溫培養(yǎng)5-6天，得到種子；步驟2，將一級(jí)種子培養(yǎng)基溶于水，移入由步驟1得到的種子，在搖床上放置72h，得到一級(jí)種子；步驟3，將二級(jí)種子培養(yǎng)基溶于水，移入由步驟2得到的一級(jí)種子，反應(yīng)48h，得到二級(jí)菌種；步驟4，將植物甾醇、豆油、吐溫分別放入發(fā)酵罐中，同時(shí)加入生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，移入步驟3得到的二級(jí)菌種，直至檢測(cè)無植物甾醇?xì)埩魹橹梗訜岬?0℃，靜止3h，分出水層；步驟5，油層用有機(jī)溶劑萃取，減壓濃縮到溶劑體積的1/4，冷卻到5℃，過濾，得到粗品；用甲醇重結(jié)晶，得到4-雄烯二酮成品。
【專利說明】-種植物Η醇制備4-雄烯二酮的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物留醇制備4-雄烯二酮的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 4_雄烯二酮(化學(xué)名稱：雄_4烯_3,17-二酮，英文名Anostenedione---簡稱AD)， 該產(chǎn)品外觀形狀呈近白色晶體粉末，無異味，無毒性，不溶于水，是留體類激素藥物的重要 中間體?？梢哉f幾乎所有留體激素藥物都可以以雄烯二酮為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)，如用于生 產(chǎn)皮質(zhì)激素、性激素、孕激素及蛋白同化激素，又可用于制備可的松、強(qiáng)的松、黃體酮、雌烯 醇、地塞米松等100余種藥物，也可以直接用于生產(chǎn)抗早孕米非司酮和各類計(jì)劃生育用藥 的必不可少的基本原料。留體藥物具有很強(qiáng)的抗感染、抗病毒和抗休克等藥理作用，廣泛用 于治療風(fēng)濕病、心血管病、癌癥、皮膚病等。留體藥物的發(fā)現(xiàn)及成功合成是近半個(gè)世紀(jì)來醫(yī) 藥工業(yè)取得最引人注目的兩大進(jìn)展之一，成為僅次于抗生素的第二大類藥物。合成原料一 般為薯蕷皂素、劍麻皂素、番麻皂素等，隨著薯蕷資源日漸枯竭，使得留體藥物工業(yè)不得不 尋求新的原料，而微生物降解膽固醇和植物留醇合成雄烯二酮（AD) D成為新興的留體原料 吸引了人們的注意。
[0003] 中國專利文獻(xiàn)CN103773832A公開了 一種從植物留醇水相發(fā)酵液中提取4-雄烯二 酮的方法，其特征在于，包括：采用植物留醇為原料進(jìn)行微生物發(fā)酵生成4-雄烯二酮；將發(fā) 酵結(jié)束后的發(fā)酵液通過離心機(jī)進(jìn)行液固分離，提取濕固體物料；在所述濕固體物料中加入 丙酮-純水的混合溶劑，在升溫至40-60°C的條件下持續(xù)攪拌60-90分鐘后，在40°C以上的 溫度條件下進(jìn)行固液分離，其中，每千克濕固體物料加入4升混合溶劑，所述混合溶劑中丙 酮的比例為70?80wt% ;對(duì)固液分離后得到的溶液進(jìn)行結(jié)晶處理，所述結(jié)晶處理包括：將所 述溶液升溫至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，對(duì)所述溶液逐漸降溫 至0-KTC后保溫0. 5-2. 0小時(shí)，降溫速度為每小時(shí)5?7°C，所述結(jié)晶的過程中持續(xù)攪拌， 攪拌的速度為15?25r/min ;對(duì)結(jié)晶后的物料進(jìn)行離心得到4-雄烯二酮的粗品，對(duì)所述粗 品進(jìn)行精制得到4-雄烯二酮成品。
[0004] 中國專利文獻(xiàn)CN 103159816 A公開了一種從植物甾醇發(fā)酵液中提取4-雄烯二酮 的方法，其特征在于：該方法包括下列步驟：（1)收集發(fā)酵液中的菌絲體及渣料：通過板框 壓濾機(jī)或碟片式離心機(jī)收集發(fā)酵液中的菌絲體及渣料；（2)提取4-雄烯二酮粗品（I ):將 步驟（1)的菌絲體及渣料用1:〇.5~4 (W/V)丙酮在常溫條件下浸提:Γ5次，每次l~3h，合并 丙酮浸提液，于〇?4°C靜置5h，離心收集濾液和未反應(yīng)的植物甾醇，濾液在45°C、_0. 095MPa 條件下減壓蒸發(fā)回收丙酮，當(dāng)有大量結(jié)晶出現(xiàn)時(shí)停止?jié)饪s，冷卻至4°C養(yǎng)晶3h，離心收集晶 體，即得粗品（I ); (3)制備4-雄烯二酮純品：用1:15?25 (W/V)50wt%的丙酮水溶液溶解粗 品（I )，加熱回流，過濾，濾液冷卻至4°C攪拌結(jié)晶3h，離心收集粗品（II);粗品（II)用1:10 (W/V)乙醇加熱回流溶解，加入0. f 1. Owt% (W/V)活性碳攪拌脫色30min，過濾，濾液冷卻 至4°C攪拌結(jié)晶3h，離心，用少量冰乙醇洗滌晶體，于45°C、-0. 095MPa真空干燥5?8h得純 品4-雄烯二酮。
[0005] 中國專利文獻(xiàn)CN102432657 A公開了 一種從植物甾醇發(fā)酵液中提取純化4-雄烯 二酮的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：1)取植物留醇發(fā)酵液加熱，加入中性鹽使 分層，收集上層，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上層，加熱減壓蒸餾， 得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上層，加熱減壓濃縮，降溫結(jié)晶，得4-雄烯 二酮粗品；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加熱溶解，加水?dāng)嚢瑁o置分層，取乙酸 乙酯層，降溫結(jié)晶；5)向步驟4)所得結(jié)晶中加入甲醇溶解，脫色，結(jié)晶，得到4-雄烯二酮純 品。
[0006] 中國專利文獻(xiàn)CN103382445 A公開了一種用于制備雄烯二酮的微生物菌株，其 保藏號(hào)為CCTCC N0:M2012522。利用上述菌株制備雄烯二酮的步驟包括：A、一級(jí)種子罐 發(fā)酵，菌株的接種量為〇· 5-1. 5wt%，在27-35°C，160-200rpm，0. 03-0. 07MPa條件下培養(yǎng) 30-42h ;B、二級(jí)種子罐發(fā)酵，菌株的接種量為8-12wt%，同條件下培養(yǎng)20-30h ;C、發(fā)酵罐發(fā) 酵轉(zhuǎn)化生成雄烯二酮，菌株的接種量為10-14%;在27-35°C，0. 03-0. 07MPa條件下培養(yǎng)；D、 停止轉(zhuǎn)化：甾醇低于〇. 5%，PH8. 9-9. 0,放罐，升溫到90-100°C維持30-50min，然后冷卻到 30-50°C，停止攪拌，靜置4-6小時(shí)。本發(fā)明提供了一種分枝桿菌的高效發(fā)酵菌株，同時(shí)利用 表面活性劑、豆油與發(fā)酵液形成雙向系統(tǒng)，改進(jìn)發(fā)酵工藝，極大的提升了原料的投料量和微 生物的轉(zhuǎn)化率。
[0007] 中國專利文獻(xiàn)CN 103789386A公開了由植物甾醇組合物為底物制備雄甾-4烯-3， 17二酮和/或雄留-1，4-二烯-3,17-二酮的方法，其特征在于在具有諾卡氏菌屬或分支桿 菌屬微生物的反應(yīng)器中加入用含有十二烷基硫酸鈉的增溶劑或乳化劑和植物留醇組合物， 調(diào)節(jié)PH值大于7,在20-37°C之間進(jìn)行發(fā)酵，使植物甾醇組合物轉(zhuǎn)變?yōu)樾坨?4烯-3,17二 酮和/或雄甾-1，4-二烯-3,17二酮。
[0008] 從現(xiàn)有技術(shù)來看，植物留醇的投料量和4-雄烯二酮的收率還有待優(yōu)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提高植物留醇的投料濃度和4-雄烯二酮的收率。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種一種植物留醇制備4-雄烯二酮的方 法。
[0011] 本發(fā)明通過由自主分離與篩選得到的一株分桿菌株的傳代接種、一級(jí)種子培養(yǎng)、 二級(jí)種子培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化、萃取、精制得到4-雄烯二酮。
[0012] 具體地，本發(fā)明包括如下步驟 步驟1，將自主分離與篩選得到的一株分桿菌株、種子斜面固體培養(yǎng)基和無菌水，控制 pH=6. 90-7. 30,在31 °C恒溫培養(yǎng)5-6天，然后在4°C保存；得到種子； 步驟2,將一級(jí)種子培養(yǎng)基溶于水，控制pH=6. 90-7. 30,在121-125°C滅菌30min，移入 由步驟1得到的種子，在轉(zhuǎn)速170r/min，溫度31-33°C的搖床上，放置72h ;得到一級(jí)種子， 檢測(cè)合格后，即可進(jìn)行二級(jí)接種； 步驟3,將二級(jí)種子培養(yǎng)基溶于水，控制pH=7. 90-8. 10,在121-125°C滅菌30min，移入 由步驟2得到的一級(jí)種子，在轉(zhuǎn)速170r/min，溫度31-33°C，通氣流量0. 3m3/h，反應(yīng)48h ;得 到二級(jí)菌種，檢測(cè)合格后，即可進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化； 步驟4,將植物留醇、豆油、吐溫分別放入發(fā)酵罐中，同時(shí)加入生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，在 121-125°C滅菌30min，冷卻到33-34°C，移入步驟3得到的二級(jí)菌種，壓力控制在0. 05MPa， 通氣流量3. 5m3/h，溫度控制在33-34°C，轉(zhuǎn)速控制在300-350r/min，直至檢測(cè)無植物留醇?xì)?留為止；加熱到90°C，靜止3h，分出水層； 步驟5,油層用有機(jī)溶劑萃取，減壓濃縮到溶劑體積的1/4,冷卻到5°C，過濾，得到粗 品；用甲醇重結(jié)晶，得到4-雄烯二酮成品。
[0013] 本發(fā)明的具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明通過由自主分離與篩選得到的一株分桿菌株的傳代接種、一級(jí)種子培養(yǎng)、二 級(jí)種子培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化、萃取、精制得到4-雄烯二酮。優(yōu)化了工藝參數(shù)。提高了植物留醇的 濃度和4-雄烯二酮的收率，保證了產(chǎn)品質(zhì)量。
[0014] 2、本發(fā)明提高了植物留醇的發(fā)酵濃度（2. 2wt%)。植物留醇的微生物轉(zhuǎn)化過程中， 底物在水溶液培養(yǎng)基中的溶解度是主要問題。為了提高底物的濃度，本發(fā)明采用在體系中 加入適量的溶劑和表面活性劑，底物濃度達(dá)到2. 2wt%時(shí)，菌體代謝正常。目前國內(nèi)報(bào)道底 物濃度最高的是天津藥業(yè)的1. 5wt%。
[0015] 3、本發(fā)明4-雄烯二酮的收率（38wt%)。植物留醇的微生物轉(zhuǎn)化，主要生成兩種物 質(zhì)，4-雄烯二酮和1，4-雄烯二酮。要提高4-雄烯二酮的收率，就必須降低1，4-雄烯二酮 的生成量，本發(fā)明采用自主分離與篩選得到的一株分桿菌株，對(duì)4-雄烯二酮有很高的選擇 性，收率達(dá)到38wt%。目前國內(nèi)報(bào)道4-雄烯二酮的收率最高的是天津藥業(yè)的32wt%。
[0016] 4、本發(fā)明具有發(fā)酵工藝簡單，投料濃度高，產(chǎn)品收率高，成本低，市場(chǎng)競(jìng)爭明顯等 特點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0018] 實(shí)施例1 第一步：將自主分離與篩選得到的一株分桿菌株、4g酵母膏、6g蛋白胨、18g葡萄糖、 23g瓊脂加到到母瓶里，用水定容到1L，調(diào)節(jié)pH=6. 90-7. 30,在31°C (可以是在25-36°C之 間）恒溫培養(yǎng)5天，然后在4°C (可以是在2-6°C之間）保存。
[0019] 第二步：將4g酵母膏、6g蛋白胨、18g葡萄糖加到搖瓶中，用水定容到1L，調(diào)節(jié) ρΗ=6·90-7·30,在121-125°C滅菌30min，冷卻到30°C (可以是在25-32°C之間），移入第一 步培養(yǎng)的種子，在轉(zhuǎn)速170r/min，溫度31-33°C的搖床上，放置72h。檢測(cè)菌絲量3wt%左右 后，即可進(jìn)行二級(jí)接種。
[0020] 第三步：將162.5g玉米漿、49g蔗糖、44. lg硝酸鉀、4.9g磷酸氫二銨、2.6g消 泡劑加到發(fā)酵罐中，加水到6. 5Kg，調(diào)節(jié)pH=7. 90-8. 10,在121-125°C滅菌30min，冷卻到 30°C (可以是在25-32°C之間）。移入200g第二步得到的一級(jí)菌種，在轉(zhuǎn)速170r/min，溫度 31-33°C下，壓力0. 05Mpa，通氣流量控制在0. 3m3/h，檢測(cè)菌絲量10wt%左右后，即可進(jìn)行生 物轉(zhuǎn)化。
[0021] 第四步：將1625g玉米漿、409. 5g硝酸鉀、45. 5g磷酸氫二銨、10L豆油、15ml吐溫、 1625g植物留醇和2600g乙醇組成的溶液加到發(fā)酵罐中，加水加到65Kg，在121-125°C滅 菌30min，冷卻到33-34°C，移入第三步得到的二級(jí)菌種，流量控制在3. 5 m3/h，壓力控制在 0. 05mpa，溫度控制在33_34°C，轉(zhuǎn)速控制在300_350r/min，直至檢測(cè)無植物留醇?xì)埩魹橹埂?加熱到90°C，靜止3h，分出水層。
[0022] 第五步：油層用4倍量的乙酸乙酯萃取，減壓濃縮到溶劑體積的1/4,冷卻到5°C， 過濾，得到粗品。用10倍量甲醇重結(jié)晶，得到618g4_雄烯二酮成品。
[0023] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是 作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范 圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于包括： 步驟1，將自主分離與篩選得到的一株分桿菌株、種子斜面固體培養(yǎng)基和無菌水，控制 pH=6. 90-7. 30,在31 °C恒溫培養(yǎng)5-6天，然后在4°C保存；得到種子； 步驟2,將一級(jí)種子培養(yǎng)基溶于水，控制pH=6. 90-7. 30,在121-125°C滅菌30min，移入 由步驟1得到的種子，在轉(zhuǎn)速170r/min，溫度31-33°C的搖床上，放置72h ;得到一級(jí)種子； 步驟3,將二級(jí)種子培養(yǎng)基溶于水，控制pH=7. 90-8. 10,在121-125°C滅菌30min，移入 由步驟2得到的一級(jí)種子，在轉(zhuǎn)速170r/min，溫度31-33°C，通氣流量0. 3m3/h，反應(yīng)48h ;得 到二級(jí)菌種； 步驟4,將植物留醇、豆油、吐溫分別放入發(fā)酵罐中，同時(shí)加入生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，在 121-125°C滅菌30min，冷卻到33-34°C，移入步驟3得到的二級(jí)菌種，壓力控制在0. 05MPa， 通氣流量3. 5m3/h，溫度控制在33-34°C，轉(zhuǎn)速控制在300-350r/min，直至檢測(cè)無植物留醇?xì)?留為止；加熱到90°C，靜止3h，分出水層； 步驟5,油層用有機(jī)溶劑萃取，減壓濃縮到溶劑體積的1/4,冷卻到5°C，過濾，得到粗 品；用甲醇重結(jié)晶，得到4-雄烯二酮成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中，所述種子斜面固體培養(yǎng)基為： 酵母膏0. 4wt%，蛋白腺0. 6wt%，葡萄糖1. 8wt%，瓊脂2. 3wt%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中，所述一級(jí)種子培養(yǎng)基為：酵母 膏0. 4wt%，蛋白腺0. 6wt%，葡萄糖1. 8wt%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中，所述二級(jí)種子培養(yǎng)基為：玉米 漿2. 5wt%，硝酸鉀0· 63wt%，蔗糖0· 7wt%，磷酸氫二銨0· 07wt%，消泡劑0· 04wt%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4中，所述生物培養(yǎng)基為：玉米 楽2. 5wt%，硝酸鉀0. 63wt%，磷酸氫二銨0. 07wt%，豆油16 (v/v)，吐溫0. 02wt%，植物甾醇 2.5wt%〇
【文檔編號(hào)】C12R1/32GK104195209SQ201410441970
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】吳衛(wèi)忠, 蔣澄宇 申請(qǐng)人:常州大學(xué)