一株在低pH值下產(chǎn)丁二酸工程菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株能在低pH值下產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌BA601（EscherichiacoliBA601），其保藏號編號為CCTCCNO：M2014210。本發(fā)明還公開了該菌在產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性和磷酸轉移酶系統(tǒng)的ptsG自發(fā)突變的大腸桿菌AFP111為出發(fā)菌株，過量表達其耐酸基因gadBC。這種通過分子生物學及微生物馴化手段，使原先不能在低pH(pH5.6)條件下生長并發(fā)酵產(chǎn)酸的大腸桿菌AFP111能夠高效利用葡萄糖產(chǎn)丁二酸的方法未見公開，而這種應用將大大推進丁二酸產(chǎn)業(yè)的進步和發(fā)展。
CCTCC NO：M2014210
2014.05.18
【專利說明】一株在低pH值下產(chǎn)丁二酸工程菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸 的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二 酸的方法，具體是一株在低pH值下產(chǎn)丁二酸重組菌株及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方 法。
[0002]

【背景技術】 丁二酸（succinic acid)又稱琥拍酸，被廣泛應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品 和塑料等行業(yè)，作為C4平臺化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等有機 化學品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來12種 最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一。此外，丁二酸還用于生產(chǎn)藥物、抗生素、氨基酸及維生素等 利于人類健康中間體。
[0003] 丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉 化可再生資源，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸 收固定C02，能有效緩解溫室效應，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來成為研 究的熱點。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要集中在、 Actinobaci 11 us succinogenes^ Mannheimia 重組谷氛酸棒桿菌-口 重組大腸桿菌。其中利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培 養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進程。而重組大腸桿菌由 于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，近年來被廣泛用于 研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。
[0004] 現(xiàn)有產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌的構建思路主要包括失活副產(chǎn)物生成途徑的關鍵酶 (如丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶)、增強丁二酸合成途徑中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶）的活性以及外源導入可以引導合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶）提高其對葡萄糖的 利用率以及生產(chǎn)速率。其中，凡cWi NZN111由于同時失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫 氫酶，NADH不能及時再生為NAD+，引起胞內(nèi)輔酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD+比例超過2)， 最終導致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發(fā)突變株凡cWi AFP111由于突變了葡 萄糖專性轉運系統(tǒng)中的基因，降低了在EMP途徑中NADH的產(chǎn)生速率，恢復了 NAD(H) 平衡，使得菌株在厭氧條件下能夠利用葡萄糖，且產(chǎn)物主要為丁二酸，在有氧厭氧兩階段發(fā) 酵培養(yǎng)AFP111過程中，丁二酸質(zhì)量收率達到96%，生產(chǎn)強度為1. 21 g rV1。
[0005] 利用生物技術生產(chǎn)丁二酸過程中60-70%的成本是用在將最終發(fā)酵產(chǎn)生的丁二酸 鹽分離得到游離丁二酸的純化階段，這也是整個過程中耗費成本最多的階段。為了降低生 產(chǎn)成本，最可行的方法是發(fā)酵過程中不用或用少量的堿滴定中和而使游離丁二酸成為主要 產(chǎn)物。但是至今為止用于丁二酸生產(chǎn)的細菌都不能在低pH值有效的生長并產(chǎn)丁二酸。然 而能有效維持胞內(nèi)pH的原核微生物則可用于在低pH值下發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。
[0006] 大腸桿菌廣泛應用于工業(yè)，但目前大多數(shù)大腸桿菌由于不能在耐受低pH值，從而 不能在低pH值下發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供了一株在pH值下產(chǎn)丁二酸大腸桿菌菌株，并利用該菌株 厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，達到菌株的方法簡單方便，得到的菌株發(fā)酵方法簡單可行，易于工業(yè) 化，產(chǎn)酸能力強的目的，從而大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。
[0008] 為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案： 一、本發(fā)明提供一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌BA601 (萬scAericAia BA601)，其保藏號編號為 CCTCC NO :M2014210。
[0009] 二、本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌co/i)BA601的構建方法，其特征在 于以缺乏乳酸脫氫酶（LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶（PFL)基因活性且磷酸轉移酶系統(tǒng)的 染色體發(fā)生自發(fā)突變的大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用過表達谷氨酸脫羧酶、γ -氨基丁 酸反向轉運蛋白基因后，經(jīng)連續(xù)馴化培養(yǎng)，得到能夠在低pH值下高產(chǎn)丁二酸大腸埃希氏菌 BA601 ； 進一步地，所述的具體步驟如下： (1) 利用CaCl2法制備缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和磷酸轉移 酶系統(tǒng)的/7^6染色體發(fā)生自發(fā)突變的凡感受態(tài)菌株； (2) 純化擴增出包含其耐酸原件gat/系統(tǒng)的谷氨酸（Glumate)脫羧酶（GadB)、谷氨 酸-Y -氨基丁酸（GABA)反向轉運蛋白（GadC)基因的質(zhì)粒； (3) 將步驟（2)所述的質(zhì)粒利用熱擊法導入步驟（1)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽性轉 化子； (4) 利用步驟（3)的陽性轉化子表達耐酸基因得到一株能在低pH值下發(fā)酵產(chǎn) 丁二酸的大腸埃希氏菌 BA600 co/iBA600)。
[0010] (5 )大腸埃希氏菌BA600經(jīng)連續(xù)馴化培養(yǎng)后，利用低pH值的固體培養(yǎng)基平板，篩選 得到可以快速生長的突變株，再經(jīng)過厭氧搖瓶發(fā)酵篩選獲得可以在低pH值條件下高效產(chǎn) 丁二酸的菌株為目標菌株大腸埃希氏菌BA601 co/i BA601)。
[0011] 三、利用本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA601發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于 采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產(chǎn)酸。
[0012] 進一步地，具體步驟如下： 將大腸埃希氏菌BA601按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，有 氧培養(yǎng)菌體至0D_= 3時，按接種量10%轉接至含有厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中，充 C022 min，并在 37 °C，200 r/min 厭氧發(fā)酵 48 h。
[0013] 或者將大腸埃希氏菌BA601按10%的接種量將種子液接入裝有1. 5 L發(fā)酵培養(yǎng) 基的3 L發(fā)酵罐中，37 °C有氧培養(yǎng)至菌體生長達到穩(wěn)定期，37 °C、200 r/min以0. 5 L/min 的速率持續(xù)通入C02，進行厭氧發(fā)酵，優(yōu)選的，其中有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基維持在pH 5. 6。
[0014] 進一步地，所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是維持在pH 5. 6。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明以缺乏乳酸脫氫酶（LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解 酶（PFL)基因活性和磷酸轉移酶系統(tǒng)的自發(fā)突變的大腸桿菌AFP111為出發(fā)菌株， 過量表達其耐酸基因這種通過分子生物學及微生物馴化手段，使原先不能在低 pH (pH5. 6)條件下生長并發(fā)酵產(chǎn)酸的大腸桿菌AFP111能夠高效利用葡萄糖產(chǎn)丁二酸的方 法未見公開，而這種應用將大大推進丁二酸產(chǎn)業(yè)的進步和發(fā)展。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1大腸桿菌中耐酸基因 ^300^的耐酸途徑。
[0017] 圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳鑒定圖。
[0018] 圖3質(zhì)粒pMD19-T-辟單酶切、雙酶切電泳鑒定圖。
[0019] 圖4大腸埃希氏菌C&cAericAia co/i) BA601在pH 5. 6時產(chǎn)丁二酸結果。
[0020] 本發(fā)明的微生物分類命名為大腸埃希氏菌BA601 (fccAericAia coB BA601)，其 保藏日期為2014年5月18日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱為CCTCC，保 藏地址為中國.武漢.武漢大學，其保藏號編號為CCTCC N0:M2014210。

【具體實施方式】
[0021] 下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。
[0022] 本發(fā)明所述的質(zhì)粒用pMD19_T的來源是：購自Takara公司 本發(fā)明所述的出發(fā)菌株么cWi AFP111的感受態(tài)菌株的來源有兩處： (1) Applied and environmental microbiology, 2001, 67(1): 148-154. 申請人:首 先通過查閱到該生物材料的上述文獻出處，并聯(lián)系了發(fā)表人系美國芝加哥大學的David P. Clark教授，并郵件請求其贈與該生物材料，并免費獲得了該生物材料；且 申請人:保證從本 申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料。
[0023] (2)該生物材料還在中國專利（申請?zhí)朇N 96198547,申請日1996. 10. 31，授權日 為2003年1月1日，授權
【發(fā)明者】姜岷, 陳吳方, 吳明科, 馬江鋒, 劉嶸明, 陳可泉, 韋萍, 歐陽平凱 申請人:南京工業(yè)大學