一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明研究了一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的增殖、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明方法利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法可以快速獲得遺傳性狀穩(wěn)定的黃葛細(xì)胞，繁殖率高，在短期內(nèi)提供大量的制藥原料，并能有效降低生產(chǎn)成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下黃葛懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]黃葛樹(shù),拉丁^iFicus rire/75.,別名黃桷樹(shù)、大葉格樹(shù)、馬尾格、雀樹(shù),?？聘駥俾淙~大喬木。重慶、四川、湖北等地栽培最佳，宅旁、橋畔、路側(cè)隨處可見(jiàn)，新葉展放后鮮紅色的托葉紛紛落地，甚為美觀。是常用的庭蔭樹(shù)、行道樹(shù)之一?，F(xiàn)為中國(guó)重慶的市樹(shù)。黃葛樹(shù)喜光，耐旱，耐瘠薄，有氣生根，適應(yīng)能力特別強(qiáng)。生態(tài)環(huán)境:生于疏林中或溪邊濕地，耐寒性較榕樹(shù)稍強(qiáng)。黃葛樹(shù)其根、葉入藥。根:祛風(fēng)除濕，清熱解毒。用于風(fēng)濕骨痛，感冒，扁桃體炎，眼結(jié)膜炎。葉:消腫止痛。外用治跌打腫痛。目前主要的繁殖方式是扦插繁殖和播種繁殖。組培快繁方法尚無(wú)人研究，利用組培懸浮細(xì)胞培養(yǎng)可以縮短培養(yǎng)周期，保持遺傳穩(wěn)定性，短期內(nèi)獲得大量的制藥原料。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供黃葛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，快速獲得遺傳性狀穩(wěn)定的黃葛細(xì)胞，繁殖率高，在短期內(nèi)提供大量的制藥原料，并能有效降低生產(chǎn)成本。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理1min,無(wú)菌水沖洗5_7遍,消毒處理過(guò)的黃葛葉片接入培養(yǎng)基MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸100mg/L進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x,增殖后的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.3mg/L+ABA2mg/L+硝酸鑭2mg/L進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25°C，光照 11 ?13 h/d，轉(zhuǎn)速 100 ?120 r/min。
[0005]采用本發(fā)明制備的黃葛懸浮細(xì)胞，生長(zhǎng)速度快，增殖率高，利于大生產(chǎn)操作，能耗小，污染少。
[0006]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。

【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施例1
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理1min,無(wú)菌水沖洗5_7遍，消毒處理過(guò)的黃葛葉片接入培養(yǎng)基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸100mg/L進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+NAA 0.05mg/L+ZT0.2mg/L+ABAlmg/L+硝酸鑭lmg/L進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0008]實(shí)施例2
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理1min,無(wú)菌水沖洗5_7遍，消毒處理過(guò)的黃葛葉片接入培養(yǎng)基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸lOOmg/L進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001X，增殖后的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.4 mg/L+ABA3mg/L+硝酸鑭3 mg/L進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0009]實(shí)施例3
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理1min,無(wú)菌水沖洗5_7遍，消毒處理過(guò)的黃葛葉片接入培養(yǎng)基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸lOOmg/L進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.4 mg/L+ABA3mg/L+硝酸鑭2mg/L進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0010]實(shí)施例4
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理1min,無(wú)菌水沖洗5_7遍，消毒處理過(guò)的黃葛葉片接入培養(yǎng)基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸lOOmg/L進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.05mg/L+ZT0.3 mg/L+ABA2mg/L+硝酸鑭2mg/L進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
【權(quán)利要求】
1.一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的增殖、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)等，主要步驟如下: (1)取黃葛幼嫩葉片，按照常規(guī)的消毒方法對(duì)其進(jìn)行消毒處理； (2)將步驟(I)消毒處理過(guò)的黃葛葉片接入培養(yǎng)基MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期 8h ； (3)取步驟(2)誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+2，4-D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸100mg/L進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x ； (4)取步驟(3)增殖后的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.05-0.lmg/L+ZT0.2-0.4mg/L +ABAl-3mg/L+硝酸鑭1-3 mg/L進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x ； 按照權(quán)利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(I)中所述黃葛無(wú)菌葉片的獲得為，取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min,超凈工作臺(tái)上次氯酸鈉處理1min,無(wú)菌水沖洗5_7遍。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(2)中所述愈傷組織的誘導(dǎo)在培養(yǎng)基中附加了 15mg/L廣大霉素，可以消除內(nèi)生菌。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(3)中所述愈傷組織的增殖中附加了檸檬酸，可以有效防止愈傷組織的褐化現(xiàn)象。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)所述的黃瑞木懸浮細(xì)胞按照按照下述方法得到:挑選松散性好，健康的愈傷組織，繼代3次以后，在無(wú)菌條件下分別放入裝有25 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶?jī)?nèi)，加入已消毒滅菌的玻璃珠振搖后，置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行水平振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25°C,光照 11 ?13 h/d，轉(zhuǎn)速 100 ?120 r/min。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種黃瑞木愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)中加入了稀土硝酸鑭，對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。
【文檔編號(hào)】C12N5/02GK104263690SQ201410446370
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】張金芳, 楊存 申請(qǐng)人:南京標(biāo)科生物科技有限公司