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一種神經(jīng)肽及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):486485閱讀:554來源:國知局
一種神經(jīng)肽及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種神經(jīng)肽及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明公開一種蛋白,為如下(1)-(4)任一所示:(1)SEQ ID No.4所示的蛋白;(2)將SEQ ID No.4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明證明抑制神經(jīng)肽的表達(dá)使得亞洲玉米螟的體長顯著縮短、體重增加量減少、取食量顯著減少、生長速率和攝食速率均顯著降低,證明神經(jīng)肽及其編碼基因在促進(jìn)動(dòng)物生長和動(dòng)物攝食方面具有重要作用。
【專利說明】-種神經(jīng)肽及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種神經(jīng)肽及其編碼基因與應(yīng)用,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 亞洲玉米螟俗名鉆心蟲,成蟲屬鱗翅目螟蛾科,是我國玉米生產(chǎn)中的主要害蟲,該 蟲不僅取食玉米葉片、蛀入玉米主莖或果穗內(nèi),降低光合作用,影響?zhàn)B分運(yùn)輸,還產(chǎn)生各種 次級(jí)病害,致使玉米減產(chǎn)降質(zhì)。近年來,隨著氣候條件的變化、耕作制度的改變、玉米種植密 度的加大、肥水條件的提高,玉米螟的危害日益加重。
[0003] 神經(jīng)肽NPY (Neuropeptide Y)首先在高等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),之后相繼在無脊椎動(dòng)物中 發(fā)現(xiàn),在昆蟲中的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚。由于最早發(fā)現(xiàn)的Neuropeptide Y成熟肽C-末端為酪氨 酸(Y)而被命名NPY,無脊椎動(dòng)物中以苯丙氨酸(F)結(jié)尾,所以將無脊椎動(dòng)物此類神經(jīng)肽統(tǒng) 稱為NPF或無脊椎動(dòng)物的NPY家族。目前在昆蟲中NPY命名尚未統(tǒng)一,以酪氨酸結(jié)尾的稱 NPY (如意大利蜜蜂),以苯丙氨酸結(jié)尾的稱NPF (如果蠅),昆蟲NPF或者NPY總稱NPY類神 經(jīng)肽。目前,昆蟲其他目的物種中,僅發(fā)現(xiàn)有NPF或者NPY,而在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有 NPF和NPY。該類基因主要分布于腦和中腸中,在取食、酒精過敏、性行為、學(xué)習(xí)和記憶、生物 節(jié)律等許多方面都起著重要的調(diào)控作用。
[0004] 目前,在無脊椎動(dòng)物中,對(duì)NPF基因功能的研究相對(duì)滯后,主要集中在果蠅和線蟲 的NPF上。在鱗翅目昆蟲中的研究較少,從煙蛾夜和棉鈴蟲腦組織中分別克隆出NPY家族 基因,發(fā)現(xiàn)其中不僅含有無脊椎動(dòng)物特有的NPF神經(jīng)肽,而且同時(shí)發(fā)現(xiàn)了類似脊椎動(dòng)物的 神經(jīng)肽NPY。對(duì)神經(jīng)肽的研究對(duì)于害蟲防治新技術(shù)的開發(fā)具有廣泛的前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)肽及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供一種蛋白,為如下(1)-(4)任一所示:
[0007] (l)SEQ ID No. 4 所示的蛋白;
[0008] (2)將SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì);
[0009] (3) SEQ ID No. 5 所示的蛋白;
[0010] (4)將SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0011] 上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012] 上述編碼基因中,所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N:
[0013] 1) SEQ ID No. 3中自5'末端起第28位至第393位核苷酸所示的DNA分子;
[0014] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子;
[0015] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA 分子。
[0016] 含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017] 一種抑制動(dòng)物生長和/或抑制動(dòng)物攝食的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,是抑制 動(dòng)物體內(nèi)上述任一所述編碼基因的表達(dá)。
[0018] 上述方法中,所述抑制動(dòng)物體內(nèi)上述任一所述編碼基因的表達(dá)的方法為將SEQ ID No. 9所示的dsRNA分子導(dǎo)入所述動(dòng)物體內(nèi)。
[0019] 上述任一所述的方法中,所述dsRNA分子導(dǎo)入所述動(dòng)物體內(nèi)的方法為如下(1)或 (2)所述的任一種方法:
[0020] (1)將所述dsRNA通過注射的方法導(dǎo)入所述動(dòng)物體內(nèi);
[0021] (2)將所述dsRNA通過飼喂的方法導(dǎo)入所述動(dòng)物體內(nèi);
[0022] 所述dsRNA導(dǎo)入所述動(dòng)物體內(nèi)后,dsRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正 義鏈和反義鏈;所述反義鏈與動(dòng)物體內(nèi)的蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物,即RISC ;RISC 與目的編碼基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合,抑制目的編碼基因的表達(dá)。
[0023] -種促進(jìn)動(dòng)物生長和/或促進(jìn)動(dòng)物攝食的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,是使上 述任一所述的編碼基因在動(dòng)物中過表達(dá)。
[0024] 上述任一所述的方法中,所述動(dòng)物為昆蟲,具體為鱗翅目昆蟲,再具體為亞洲玉米 螟;
[0025] 所述生長為體重增加和/或體長增長。
[0026] -種dsRNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,該分子的序列如SEQ ID No. 9所示。
[0027] 抑制上述任一所述編碼基因表達(dá)的抑制劑在制備抑制動(dòng)物生長和/或抑制動(dòng)物 攝食的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍;
[0028] 所述抑制劑具體為上述dsRNA分子;
[0029] 或,
[0030] 上述蛋白、上述任一所述的編碼基因在制備促進(jìn)動(dòng)物生長和/或促進(jìn)動(dòng)物攝食的 產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍;
[0031] 所述動(dòng)物具體為昆蟲,再具體為鱗翅目昆蟲,更具體為亞洲玉米螟;
[0032] 所述生長為體重增加和/或體長增長。
[0033] 本發(fā)明證明抑制神經(jīng)肽的表達(dá)使得亞洲玉米螟的體長顯著縮短、體重增加量減 少、取食量顯著減少、生長速率和攝食速率均顯著降低,證明神經(jīng)肽及其編碼基因在促進(jìn)動(dòng) 物生長和動(dòng)物攝食方面具有重要作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為PCR擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳。
[0035] 圖2為NPF2成熟肽的形成過程。
[0036] 圖3為亞洲玉米螟NPF2的dsNPF2和dsGFP的瓊脂糖凝膠電泳。
[0037] 圖4為取食前飼料和取食后飼料的示意圖。
[0038] 圖5為亞洲玉米螟的體重增長量測定。
[0039] 圖6為亞洲玉米螟的取食量檢測。
[0040] 圖7為亞洲玉米螟的生長速率檢測。
[0041] 圖8為亞洲玉米螟的攝食速率檢測。
[0042] 圖9為亞洲玉米螟的中腸和腦的NPF2基因相對(duì)表達(dá)量檢測。
[0043] 圖10為亞洲玉米螟的形態(tài)比較。
[0044] 圖11為亞洲玉米螟的體長比較。
[0045] 圖12為亞洲玉米螟的體重比較。
[0046] 圖13為亞洲玉米螟的中腸的NPF2基因相對(duì)表達(dá)量檢測。

【具體實(shí)施方式】
[0047] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。
[0048] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
[0049] 亞洲玉米螟(英文名稱為asian corn borers,拉丁名為Ostrinia furnacalis (guenee),簡寫為 0. fg)在文獻(xiàn) "Physiological significance of alternatively spliced exon combinations of the single-copy gene class A chitin synthase in the insect Ostrinia furnacalis(Lepidoptera). Qu, M. and Q. Yang (2012). Insect Molecular Biology.21(4):395-404. "中公開過,公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0050] 亞洲玉米螟用人工飼料飼養(yǎng),人工飼料的成分如下:玉米粉150克、大豆粉150g、 酵母粉90g、葡萄糖75g、瓊脂22g、維生素 C 4g、山梨酸5g、水1400ml和丙酸2ml ;飼養(yǎng)條件 為:溫度25±1°C,光周期為16L:8D,相對(duì)濕度控制在65%;飼養(yǎng)容器為塑料食品盒,塑料盒 長 20cm、寬 14cm、高 8cm。
[0051] T7 RiboMAX?expression RNAi system 購自 Promega。
[0052] 實(shí)施例1、亞洲玉米螟的NPF2蛋白及其編碼基因的獲得
[0053] 提取5齡亞洲玉米螟幼蟲的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,以NPFpf和 NPFpr為引物,采用2XTaq PCR MasterMix(購自北京艾德萊生物科技有限公司)作為DNA 聚合酶,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0054] 引物如下:
[0055] NPFpf :5, -CGTTCCGCACATCTATC-3, ;(SEQ ID No. 1)
[0056] NPFpr :5, -CGCCCCTCATCTCCTT-3,。(SEQ ID No. 2)
[0057] PCR 擴(kuò)增體系:2XTaq PCR MasterMix 10μ L、濃度為 10ymol/L 的 NPFpf 0· 5 μ L、濃度為 10 μ mol/L 的 NPFpr 0· 5 μ L、cDNA 1 μ L、ddH20 8 μ L。
[0058] PCR 擴(kuò)增程序:94°C 4min ;94°C 30s,55°C 30s,72°C 45s,35 個(gè)循環(huán);72°C lOmin ; 4°C保存。
[0059] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖1所示。
[0060] 圖1中,NPF1和NPF2分別代表含有NPF1的PCR擴(kuò)增片段和含有NPF2的PCR擴(kuò) 增片段。
[0061] 含有NPF2的PCR擴(kuò)增片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示,NPF2蛋白的編碼 基因序列如SEQ ID No. 3中自5'末端起第28位至第393位核苷酸所示,NPF2蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0062] 利用在線軟件 SignalP3. 0 :http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/ 分析 信號(hào)肽剪切位點(diǎn),依據(jù)在線軟件 http://neuroproteomics. scs. illinois. edu/cgi-bin/ neuropred. py分析預(yù)測前體前導(dǎo)神經(jīng)肽的切割位點(diǎn)。結(jié)合已知節(jié)肢動(dòng)物神經(jīng)肽前體加工 過程或者已經(jīng)純化出的神經(jīng)肽同源性進(jìn)行人工分析,亞洲玉米螟NPF神經(jīng)肽前體蛋白NPF2 經(jīng)過一系列的加工剪切,預(yù)測獲得成熟肽,加工過程如圖2所示,NPF2蛋白的成熟肽序列如 SEQ ID No. 5 所示。
[0063] 實(shí)施例2、亞洲玉米螟NPF2的dsNPF2的體外合成以及dsGFP的合成
[0064] 一、亞洲玉米螟NPF2的dsNPF2的體外合成 [0065](一)設(shè)計(jì)并合成如下引物 :
[0066] dsNPFtf :5, ~TAATACGACTCACTATAGGCGTTCCGCACATCTATC~3, ; (SEQ ID No. 6)
[0067] dsNPFtr :5, ~TAATACGACTCACTATAGGCGCCCCTCATCTCCTT~3, ; (SEQ ID No. 7)
[0068] dsNPFtf和dsNPFtr中,下劃線所示的序列為19bp的T7啟動(dòng)子序列。
[0069] (二)以SEQ ID No. 3所示的DNA分子為模板,用dsNPFtf和dsNPFtr組成的引物 對(duì)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(如SEQ ID No. 8所示)。
[0070] (三)體外轉(zhuǎn)錄
[0071] 體外轉(zhuǎn)錄體系(T7RiboMax 反應(yīng)體系):RiboMax?Express T7 2XbufferlO μ L, 步驟(二)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μ g、Enzyme Mix 2 μ L,用RNase Free水將體系定容至 20 μ L〇
[0072] RiboMax?Express T72Xbuffer、Enzyme Mix 都是 T7 RiboMAX?expression RNAi system試劑盒所帶。
[0073] 按照T7 RiboMAX?expression RNAi system試劑盒說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物的序列如SEQ ID No. 9所示,并將其命名為dsNPF2。
[0074] 二、dsGFP的體外合成
[0075] ( -)綠色熒光蛋白GFP的編碼基因序列如SEQ ID No. 10所示,以其為模板,以 dsGFPtf和dsGFPtr為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(如SEQ ID No. 13所示)。
[0076] dsGFPtf:5, ~TAATACGACTCACTATAGGCAGCGTGTCCGGCGAGG~3, ; (SEQ ID No. 11)
[0077] dsGFPtr:5' -TAATACGACTCACTATAGGGTTCACCTTGATGCCGT-3'。(SEQ ID No. 12)
[0078] dsGFPtf和dsGFPtr中,下劃線所示的序列為19bp的T7啟動(dòng)子序列。
[0079] (二)按照步驟一中(三)的方法進(jìn)行dsGFP的轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如SEQ ID No. 14 所示,并將其命名為dsGFP。
[0080] 三、dsNPF2和dsGFP的瓊脂糖凝膠電泳如圖3所示。
[0081] 實(shí)施例3、注射dsNPF2對(duì)亞洲玉米螟幼蟲取食的影響
[0082] 一、設(shè)立如下各組
[0083] dsNPF組:取蛻皮當(dāng)天的亞洲玉米螟5齡幼蟲,應(yīng)用10 μ L量進(jìn)樣器通過體腔注射 的方法(先將亞洲玉米螟用co2麻醉,然后從腹部倒數(shù)第二第三節(jié)的節(jié)間膜進(jìn)行注射)將 實(shí)施例2制備的亞洲玉米螟NPF2的dsNPF2按照10 μ g/頭的劑量導(dǎo)入亞洲玉米螟體內(nèi)。 [0084] 體腔注射后將亞洲玉米螟放入裝有新鮮飼料的養(yǎng)蟲管中進(jìn)行飼養(yǎng)(每支養(yǎng)蟲管 加入5g長方形餅狀的飼料),每24小時(shí)取出飼料,去除飼料中的糞便(糞便為顆粒狀,可以 較為容易的從餅狀飼料中去除,取食前飼料和取食后飼料的示意圖如圖4所示,圖4中餅狀 的為飼料,顆粒狀的為糞便),然后將飼料稱重后放回養(yǎng)蟲管。
[0085] 同時(shí)設(shè)置dsGFP和DEPC H20組作為對(duì)照,各組的處理方法均與dsNPF2組相同, dsGFP和DEPC H20組僅將亞洲玉米螟NPF2的dsNPF2替換為等質(zhì)量的dsGFP或等體積的 DEPC H20。
[0086] 二、將上述各組的亞洲玉米螟進(jìn)行各個(gè)營養(yǎng)指標(biāo)的測定
[0087] 下述方法及涉及的計(jì)算公式可參見文獻(xiàn)"陳志輝.昆蟲營養(yǎng)指標(biāo)的定量測量與計(jì) 算·昆蟲知識(shí)· 1987 (5) : 299-301. "
[0088] (一)體重增長量測定
[0089] 每天定點(diǎn)用電子天平稱量并記錄每只蟲子的體重,記為Ln (以注射當(dāng)天為第0天, 此時(shí)η即為0),L(n+1)-L(n),作為第n+1天的體重增長量。
[0090] 實(shí)驗(yàn)第1天(24h)、2天(48h)、3天(72h)的體重增長量測定結(jié)果如圖5所示。
[0091] 圖5表明,與其余兩組相比,dsNPF組的亞洲玉米螟的體重增長量顯著降低。
[0092] (二)取食量測定
[0093] 測量試驗(yàn)期間飼料因含水量改變而發(fā)生重量變化,因此設(shè)飼料對(duì)照組,取相同體 積和質(zhì)量的飼料3塊分別放到3個(gè)相同的養(yǎng)蟲管里(不放亞洲玉米螟),將其放置在與上述 各組的養(yǎng)蟲管相同的環(huán)境下;飼料對(duì)照組放置和取出飼料的時(shí)間與各組相同;首先稱量飼 料對(duì)照組最初的飼料重量,每24小時(shí)取出飼料并稱取重量。
[0094] 幼蟲取食量的計(jì)算公式如下:
[0095]

【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白,為如下(1)-(4)任一所不: (1) SEQIDNo·4所示的蛋白; (2) 將SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì); (3) SEQ ID No. 5所示的蛋白; (4) 將SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因,其特征在于:所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N: 1. SEQ ID No. 3中自5'末端起第28位至第393位核苷酸所示的DNA分子; 2) 在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì) 的DNA分子。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5. -種抑制動(dòng)物生長和/或抑制動(dòng)物攝食的方法,是抑制動(dòng)物體內(nèi)權(quán)利要求2或3所 述編碼基因的表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于:所述抑制動(dòng)物體內(nèi)權(quán)利要求2或3所述 基因的表達(dá)的方法為將SEQ ID No. 9所示的dsRNA分子導(dǎo)入所述動(dòng)物體內(nèi)。
7. -種促進(jìn)動(dòng)物生長和/或促進(jìn)動(dòng)物攝食的方法,是使權(quán)利要求2或3所述的編碼基 因在動(dòng)物中過表達(dá)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的方法,其特征在于:所述動(dòng)物為昆蟲,具體為鱗翅目昆 蟲,再具體為亞洲玉米螟。
9. 一種dsRNA分子,該分子的序列如SEQ ID No. 9所不。
10. 抑制權(quán)利要求2或3所述編碼基因表達(dá)的抑制劑在制備抑制動(dòng)物生長和/或抑制 動(dòng)物攝食的產(chǎn)品中的應(yīng)用; 或, 權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2或3所述的編碼基因在制備促進(jìn)動(dòng)物生長和/或 促進(jìn)動(dòng)物攝食的產(chǎn)品中的應(yīng)用; 所述動(dòng)物具體為昆蟲,再具體為鱗翅目昆蟲,更具體為亞洲玉米螟。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK104250296SQ201410448514
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】趙章武, 岳臻 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
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