一種堿性纖維素酶及其dna序列和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種堿性纖維素酶基因及其在紡織或洗滌劑領域的應用，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。該基因是通過宏基因組技術從土壤宏基因組中得到的新的尚未有功能研究的DNA序列，對該DNA序列所編碼的蛋白的結構和功能研究結果表明，該DNA序列表達的重組蛋白具有較好的耐堿纖維素酶活性，且部分金屬離子和表面活性劑能顯著提高該重組蛋白分解纖維素底物的活性。該DNA序列的表達產(chǎn)物可作為一種新的酶源用于紡織或洗滌劑行業(yè)，具有廣闊的工業(yè)應用前景。
【專利說明】一種堿性纖維素酶及其DNA序列和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽【技術領域】。更具體地，涉及一種堿性纖維素酶及其DNA序列和應 用。

【背景技術】
[0002] 纖維素是植物細胞壁的主要成分，也是地球上最豐富最廉價的可再生資源，每年 的植物通過光合作用產(chǎn)生的植物干質(zhì)量高達220億噸，其中纖維素占50%，所以能利用纖維 素的微生物具有物種多樣性和分布廣泛的特點。在微生物、植物、昆蟲甚至哺乳動物中都有 發(fā)現(xiàn)纖維素酶，其中來源于真菌、放線菌、細菌的纖維素酶得到了一定研究。據(jù)報道，目前為 止，已從40多種細菌和數(shù)種真菌中克隆到了多種纖維素酶基因，其中產(chǎn)纖維素酶的真菌粗 略估計已達68個屬。但由于纖維素具有水不溶性的高結晶結構，其外圍又被木質(zhì)素層包圍 著，要把它水解成可利用的葡萄糖相當困難，纖維素的再生利用一直受到限制。
[0003] 內(nèi)切葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4)又稱為羧甲基纖維素酶、Cl酶等，主要作用于纖維素 的非結晶區(qū)，隨機水解β _1，4糖苷鍵，將長鏈的纖維素截短，并通過與外切葡聚糖酶或葡 萄糖苷酶的復配協(xié)調(diào)作用，可以有效地降解結晶纖維素。在纖維素酶系中，內(nèi)切葡聚糖苷酶 作為首先作用于纖維素的第一個酶而尤為重要。
[0004] 纖維素酶也屬于糖基水解酶類，后者與蛋白酶，脂肪酶組成目前的三大工業(yè)酶，其 中洗滌劑用酶占了工業(yè)酶的32%，但由于目前的洗滌劑多為堿性，而已報道的內(nèi)切纖維素酶 卻多偏酸性或中性，因此迫切需要從自然界中發(fā)現(xiàn)更多新的、耐堿的內(nèi)切葡聚糖酶，以促進 紡織或洗滌劑領域行業(yè)的發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有纖維素酶的局限和不足，提供一種在紡織和 洗滌行業(yè)具有潛在應用前景的堿性纖維素酶及其DNA序列。該序列是通過宏基因組技術， 從土壤宏基因組中得到的新的尚未有功能研究的DNA序列。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種可應用于紡織和洗滌行業(yè)的堿性纖維素酶及其DNA序 列。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供所述堿性纖維素酶及其DNA序列的應用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)： 本發(fā)明通過宏基因組技術，從河南省南陽市的造紙廠沉積物土壤樣品所構建的宏基因 組文庫中得到一個新的尚未有功能研究的DNA序列，接著本發(fā)明人采用基因工程技術對該 DNA序列進行功能研究，結果發(fā)現(xiàn)該DNA序列所表達的重組蛋白具有耐堿內(nèi)切葡聚糖酶的 特點，而且部分金屬離子和表面活性劑能顯著提高該重組蛋白分解纖維素底物的活性，因 此可用于紡織或洗滌劑領域。該DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，該DNA序列 編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，即堿性纖維素酶。
[0009] 宏基因組學的功能篩選技術可直接從土壤基因組中篩到具有特定功能的DNA序 列，有利于發(fā)現(xiàn)新型基因和新型酶，并能通過構建表達載體，使功能基因獨立于宿主細胞表 達出相應的功能蛋白。在高通量測序發(fā)展迅猛的今天，宏基因功能篩選技術仍有其不可替 代的優(yōu)勢。
[0010] 另外，在嚴格條件下與本發(fā)明所述SEQ ID NO: 1所不序列雜交或與本發(fā)明所述SEQ ID NO: 1所示序列具有90%以上同源性，且編碼與纖維素降解相關蛋白的DNA分子，也應在 本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種由上述堿性纖維素酶基因編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。該多肽具有耐堿內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0012] 在本發(fā)明公開的基礎上，由出發(fā)載體的多克隆位點插入SEQ ID NO: 1所示序列構 建而成的重組表達載體、含有SEQ ID NO: 1所示序列的轉(zhuǎn)基因細胞系、含有SEQ ID NO: 1所 示序列的重組菌，也都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0013] 另外，本發(fā)明還提供了一種堿性纖維素酶的制備方法，包括以下步驟： 51. 獲得權利要求書1所述SEQ ID NO: 1所示序列； 52. 將SEQ ID NO: 1所示序列克隆到表達載體； 53. 將S2構建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，得到可生產(chǎn)堿性纖維素酶的基因工程菌； 54. 培養(yǎng)基因工程菌，得到堿性纖維素酶。
[0014] 其中，S2所述表達載體為本領域常用的表達載體，不做嚴格控制，如pyeS2載體 等；S3所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，原核細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌或 分支桿菌；真核細胞包括酵母細胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動植物細胞。
[0015] 本發(fā)明人將SEQ ID NO: 1所示DNA序列克隆到pyeS2載體上，然后電擊轉(zhuǎn)化釀酒 酵母INVScl感受態(tài)細胞，通過對陽性轉(zhuǎn)化子的誘導表達得到重組蛋白。接著對該重組蛋白 進行了酶學性質(zhì)研究，結果如下： (1) 該重組蛋白在釀酒酵母中具有高度可溶性表達的特點，無包涵體形成； (2) 該重組蛋白在羧甲基纖維素鈉（CMC)平板上有明顯的透明圈； (3) 該重組蛋白的分子量約為13. 4KDa ; (4) 該重組蛋白在對CMC底物進行酶解反應時，最適反應pH為9. 2,且在pH 6. 0時有 93%的相對酶活，而在pH KX 0?12. 0保留60%以上的酶活，且在pH 9. 0, KX 0和IL 0處 理6 h后分別保留89%，73%，64%的相對酶活(如附圖4所示）； (5) 該重組蛋白最適溫度為50°C，且在70°C處理6 h后仍保留51%的相對酶活，該重組 蛋白在50°C、60°C和70°C的半衰期分別為12. 6、7. 6和6. I h (如附圖5所示)。
[0016] (6)該重組蛋白在加入高濃度（10 mM)的金屬離子后，可顯著提高酶活。加入Fe2+ 和Mn2+分別提高了酶活約43倍和19倍，相對于中低濃度，加入高濃度的金屬離子后酶活 提高的倍數(shù)更多，而Na+、Mg 2+和Zn2+在不同濃度下則均能抑制重組蛋白降解底物的活性。
[0017] (7)該重組蛋白在添加高濃度的有機溶劑后幾乎都能明顯提高重組蛋白降解底物 的活性，特別是添加表面活性劑Tritonx-100和Tween 20至濃度為10%時，能分別提高重 組蛋白分解底物的活性約16倍和13倍。而EDTA在不同濃度下都能抑制該重組蛋白分解 纖維素底物的活性。
[0018] 通過以上研究結果可以看出，SEQ ID NO: 1所示序列所表達的重組蛋白具有較好 的耐堿纖維素酶活性，同時具有良好的高濃度金屬離子和有機溶劑耐受性，因此該DNA序 列的表達產(chǎn)物可作為一種新的酶源用于紡織或洗滌劑領域。
[0019] 最后，SEQ ID NO:2所示多肽在纖維素分解方面的應用也在本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。更近一步地，在紡織或洗滌劑領域的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0020] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明人通過宏基因組技術，從土壤宏基因組中得到一種新的尚未有功能研究的DNA 序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0021 ] 對該DNA序列所編碼的蛋白的結構和功能研究結果表明，該DNA序列表達的重組 蛋白具有很好的耐堿纖維素酶活性，可作為一種新的酶源用于紡織或洗滌劑領域，具有廣 闊的工業(yè)應用前景。
[0022] 另外，通過研究發(fā)現(xiàn)，部分金屬離子和表面活性劑能顯著提高該重組蛋白分解纖 維素底物的活性，因此本發(fā)明提供的該耐堿纖維素酶的活性可調(diào)，對其廣泛推廣應用具有 很大的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為實施例3中的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為標準蛋白分子量標記，1為重組 蛋白粗提物，2為純化后的重組蛋白。
[0024] 圖2為重組蛋白分解羧甲基纖維素鈉（CMC)后，用剛果紅染色并用NaCl脫色的結 果，黑色圓圈代表接種區(qū)域。
[0025] 圖3為重組蛋白作用于不同底物的酶活，以CMC為底物時的酶活作為100%。
[0026] 圖4為重組蛋白降解CMC底物時pH對酶活的影響。
[0027] 圖5為重組蛋白在不同堿性條件（pH 8. 0-12. 0)下處理不同時間后，殘余的對CMC 底物的酶活的情況。
[0028] 圖6為重組蛋白降解CMC底物時溫度對酶活的影響。
[0029] 圖7為重組蛋白在不同溫度條件（4°C -70°C)下處理不同時間后，殘余的對CMC底 物的活性的情況。

【具體實施方式】
[0030] 以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本【技術領域】常規(guī)試 齊U、方法和設備。
[0031] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0032] 實施例1 土壤樣品中宏基因組DNA的獲得 造紙廢水沉積物樣品采集自河南省許昌市造紙廠排污口。
[0033] 取兩個50 mL的離心管，稱取造紙廢水沉積物樣品，每管6 g，各加 DNA extraction buffer 13.5 mL (含有 100 mM EDTA、100 mM 磷酸鈉、1.5 M NaCl、l%CTAB 和 100 mM Tris-HcUpH 8.0)，渦旋震蕩混勻，放搖床220 rpm，37°C活化30 min，再向各管加1.5 mL 20%的SDS，使其終濃度達到2% (w/v)。接著在65°C水浴鍋中水浴2 h，每隔15 min上下 輕輕顛倒幾次混勻。室溫6, 000 g離心10 min，收集上清后，轉(zhuǎn)移至干凈離心管，加入等體 積的氯仿：異戊醇（24:1，V/V)，上下輕輕顛倒混勻。接著室溫11，000 g離心25 min收集 上清，加入0. 6倍體積的異丙醇上下顛倒混勻，室溫靜置3. 5 h后，室溫11，OOO g離心25 min，收集沉淀，用4°C預冷的75%乙醇洗滌1次，重懸于65°C預熱的CldH2O，并65°C溫浴5 min，得到終體積為400 μ L的造紙廢水沉積物宏基因組DNA。
[0034] 實施例2造紙廢水沉積物宏基因組文庫的構建和DNA序列的獲得 1、造紙廢水沉積物宏基因組文庫的構建 用feoRI酶部分酶切實施例1所提取的造紙廢水沉積物宏基因組DNA，并電泳回收 2. 5?7. 5 kb的酶切片段。將回收到的DNA片段與經(jīng)feoRI酶切和去磷酸化處理的pUC118 載體（Takara公司）連接，電擊轉(zhuǎn)化凡co/i DH5 α感受態(tài)細胞，并涂布含有100 μ g/mL氨 芐青霉素（Amp)、40 yg/mL X-gal和0. 5 mM IPTG的LB固體平板，由此構建了一個庫容 量達IO7個轉(zhuǎn)化子、多樣性好的宏基因文庫。
[0035] 2、目的基因的篩選和序列分析 隨機挑取平板上的克隆并分別平行轉(zhuǎn)接到含100 μ g/mL Amp和10 yg/mL IPTG的 CMC平板上，37°C培養(yǎng)2?3天后，用剛果紅染色30 min，再用IM NaCl脫色，觀察菌落周圍 是否有水解圈。最終得到陽性克隆子，送交測序。
[0036] 測序結果顯示該陽性克隆子含有長度為1696 bp的插入片段，使用NCBI網(wǎng)站上 Sequence Analysis中的ORF Finder發(fā)現(xiàn)一個纖維素酶基因的ORF序列（384 bp)，其核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示，即本發(fā)明所述的堿性纖維素酶基因；該基因編碼127個氨基 酸，命名為Endol8,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0037] 實施例3 DNA序列表達的重組蛋白的獲得 1、將實施例2得到的陽性克隆子接種于5 mL LB培養(yǎng)基（100 μ g/mL Amp)，37 °C 220 rpm搖床培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒。
[0038] 2、設計引物Pl和P2,引物兩端分別引入能插入釀酒酵母表達載體pyeS2的feoR I和沿ο I酶切位點。
[0039] 引物Pl (上游引物）的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示： 引物P2 (下游引物）的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示： 3、以提取的質(zhì)粒為模板，采用引物Pl和P2進行PCR擴增。
[0040] PCR 體系總體積 50 μ L，含 Prime STAR?Max Premix 25 μ? (2. 5 U)、兩種引物各 2 4 1^(10以1{)、滅菌蒸饋水2〇4 1^和模板0嫩14 1^(1叩）。
[0041] PCR 擴增條件：98°C 預變性 I min ;98°C 5 sec，55 °C 5 sec，72°C 5 sec，反應 30個循環(huán)。
[0042] 4、所得PCR產(chǎn)物長度為380 bp左右，采用常規(guī)方法回收目的片段，feoR I和通ο I雙酶切后連接入pyes2質(zhì)粒中，繼而轉(zhuǎn)化宿主菌釀酒酵母INVScl，轉(zhuǎn)化液涂布SC培養(yǎng)基 平板，該培養(yǎng)基含2%葡糖糖、0. 67%YNB和2%氨基酸混合液(尿嘧啶缺陷型)，30°C培養(yǎng)48 h，提取陽性菌落質(zhì)粒，利用引物Pl和P2進行PCR鑒定。
[0043] 5、對鑒定過的、含有SEQ ID NO: 1所示DNA序列的重組菌進行誘導表達研究。將 該重組菌種接種到150 mL三角瓶中，瓶中含有30 mL SC液體培養(yǎng)基（用2%半乳糖替代2% 葡萄糖)，30°C 200 rpm發(fā)酵72 h，誘導靶蛋白表達。4°C下5000 g離心10 min收獲細胞。
[0044] 細胞沉淀根據(jù)pyes2 (Invitrogen公司）說明書用breaking buffer洗漆，裂解 菌體，得到粗酶液，然后根據(jù)His-Bind Purification Kit (Novagen公司）說明書進行純化 操作，得到純化后的重組蛋白，即為SEQ ID N0:1所示DNA序列表達的重組蛋白。
[0045] 將純化操作中的粗酶液和純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果如附圖1所 示。從附圖1可以看出，在對應靶蛋白位置處均有一條較明顯的目的蛋白條帶。由此可見 該重組蛋白在釀酒酵母INVScl中得到了高效表達。
[0046] 6、另外，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對純化后的重組蛋白進行了分子量的研 究。
[0047] SDS-PAGE電泳結果顯示該重組蛋白的分子量約為30 KDa，考慮到該重組蛋白帶 有約17 KDa的氨基酸組成的融合片段(對應于pyes2載體上的N-His，N-Xpress，C-His, C-V5)，因此根據(jù)SDS-PAGE電泳結果，推斷該重組蛋白不帶融合片段的分子量應該為13 KDa，這與我們根據(jù)靶蛋白的氨基酸序列計算的理論分子量13.4 KDa是一致的。
[0048] 實施例4用CMC平板驗證純化后的重組蛋白分解底物的活性 在只含有?ο μ g/mL CMC和10 ug/ml Agar的平板上分別接10 μ L無菌水，10 μ L 纖維素酶液（lU/mL)，10 yLpyes2載體蛋白溶液，和10 yLEndol8酶液（即重組蛋白酶 液，18. 2 U/mL)，37°C孵育24 h后，用0. 2%的剛果紅溶液染色30 min，再用I M的NaCl溶 液脫色，結果如附圖2所示。
[0049] 研究結果表明，該重組蛋白能分解CMC產(chǎn)生明顯的透明圈。
[0050] 實施例OTNA序列所表達的重組蛋白的性質(zhì)研究 本實施例選擇了三種多糖底物（CMC、淀粉和瓊脂）和三種寡糖底物(蔗糖、麥芽糖和纖 維二塘)，對實施例3所得的重組蛋白進行了相關的酶學性質(zhì)研究。
[0051] 本實施例選擇CMCA-DNS法測定重組蛋白的酶活，定義1個活力單位（U/mL)為在 50°C，pH 7.4時，I mL酶液每分鐘水解底物產(chǎn)生相當于1 μ g葡萄糖的還原糖量，以CMC為 底物的酶學活性作為100%，測得的各底物酶活結果如附圖3所示。
[0052] 研究結果表明，重組蛋白對多糖底物有明顯的偏好性，以淀粉和瓊脂為底物的相 對酶活為86%和54%，而重組蛋白對寡糖的降解活力很低，以麥芽糖，蔗糖和纖維二糖為底 物的相對酶活均低于30%，這樣的結果與普遍的內(nèi)切葡聚糖酶的作用機理是一致的，即該酶 作為分解纖維素大分子的第一個酶而起作用。
[0053] 實施例6溫度和pH值對重組蛋白活性及穩(wěn)定性的影響 1、內(nèi)切葡聚糖酶底物采用羧甲基纖維素鈉（CMC)。
[0054] 2、在重組蛋白的最適pH和pH穩(wěn)定性研究中，用PBS緩沖液配置反應體系，在pH 5.0?12.0范圍內(nèi)，pH值每增加1為一個梯度，測定重組蛋白在這些pH下的相對活性，檢 測結果如附圖4和附圖5所示。
[0055] 研究結果表明，該重組蛋白降解CMC的最適pH為9. 0。為進一步確定該蛋白的具 體最適pH，在pH 8. 6?9. 4范圍內(nèi)，pH每增加0. 2為一個梯度，測定相對酶活，研究結果 表明，該重組蛋白降解CMC的最適pH為9. 2 (附圖4);關于重組蛋白的pH穩(wěn)定性研究結果 表明，在pH 6.0時重組蛋白有93%的相對酶活，而在pH 10. 0?12. 0仍保留60%以上的酶 活，且在pH 9. 0,10. 0和11. 0處理6 h后仍分別保留89%，73%，64%的相對酶活（附圖5)。
[0056] 以上研究結果表明該重組蛋白具有酸堿適應性，且特別適于在堿性環(huán)境下對纖維 素底物進行高效降解。
[0057] 3、在重組蛋白的最適溫度和溫度穩(wěn)定性研究中，用pH 7. 4的PBS緩沖液配置反應 體系，在溫度4?70°C范圍內(nèi)，測定重組蛋白在這些溫度下的相對活性。檢測結果如附圖6 和附圖7所示。
[0058] 為了確定重組蛋白的最適溫度，在得到最大酶活對應的溫度之后，在該溫度前后 每2°C為一個梯度，從而得出該重組蛋白降解CMC的最適溫度為50°C。關于重組蛋白的溫度 穩(wěn)定性研究結果表明，重組蛋白在70°C處理6 h后仍保留51%的相對酶活，其在50°C、60°C 和70°C的半衰期分別為12. 6、7. 6和6. I h。
[0059] 實施例7部分金屬離子對重組蛋白降解CMC活性的影響 在本實施例中，重組蛋白對CMC的降解活性測定方法為： 使用添加了 〇. l%(w/v)CMC底物的50 mM PBS緩沖液（pH 9. 2)，反應起始于添加18. 2 U/mL的重組蛋白溶液，在50°C反應15 min后，用兩倍體積的DNS溶液終止，煮沸5 min后， 取200 μ L體積的混合液，測OD54tl，金屬離子對重組蛋白降解CMC活性的影響如表1所示。
[0060] 表 1

【權利要求】
1. 一種堿性纖維素酶基因，其特征在于，與SEQ ID NO: 1所示序列雜交或與SEQ ID NO: 1所示序列具有90%以上同源性，且編碼與纖維素降解相關蛋白的DNA分子。
2. 權利要求1所述的堿性纖維素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ ID N0:1所 /_J、1 ο
3. -種根據(jù)權利要求1所述的堿性纖維素酶基因編碼所獲得的多肽。
4. 一種具有耐堿內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
5. -種重組表達載體，其特征在于，由出發(fā)載體的多克隆位點插入權利要求1所述SEQ ID NO: 1所示序列構建而成。
6. -種轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于，含有權利要求1或2所述堿性纖維素酶基因。
7. -種重組菌，其特征在于，含有權利要求1或2所述堿性纖維素酶基因。
8. -種堿性纖維素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
51. 獲得權利要求1或2所述堿性纖維素酶基因的序列；
52. 將S1所述的序列克隆到表達載體；
53. 將S2構建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，得到可生產(chǎn)堿性纖維素酶的基因工程菌；
54. 培養(yǎng)基因工程菌，得到堿性纖維素酶。
9. 權利要求3或4所述多肽在纖維素分解方面的應用。
10. 權利要求3或4所述多肽在紡織或洗滌劑領域的應用。
【文檔編號】C12N9/42GK104278045SQ201410451018
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權日:2014年9月5日
【發(fā)明者】李剛, 肖月 申請人:中山大學