柑桔黃脈病毒的巢式rt-pcr引物組、檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR引物組、檢測(cè)方法及試劑盒,屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供了柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR外巢引物對(duì)CYVCV-1f、CYVCV-1r和內(nèi)巢引物對(duì)CYVCV-2f、CYVCV-2r，利用外巢引物對(duì)進(jìn)行第一輪RT-PCR擴(kuò)增，再以第一輪RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板用內(nèi)巢引物對(duì)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，檢測(cè)第二輪PCR產(chǎn)物，獲得469bp的PCR產(chǎn)物的待測(cè)樣品即為受到柑桔黃脈病毒侵染的樣品。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，其靈敏度是常規(guī)RT-PCR的100倍，對(duì)處于潛伏期的病毒也能及時(shí)檢測(cè)到。
【專利說明】柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR引物組、檢測(cè)方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物流行病害監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR 引物組、檢測(cè)方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔黃脈病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引起的柑桔黃脈病 是一種嚴(yán)重威脅柑桔生產(chǎn)的重要病害，主要分布于印度、巴基斯坦、土耳其等國(guó)，對(duì)檸檬等 柑桔品種造成了極其嚴(yán)重的損失。我國(guó)近年來在云南、四川等檸檬主產(chǎn)區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)了該 病，其發(fā)生呈不斷擴(kuò)大、加重的趨勢(shì)。由于目前尚無藥劑可有效防治柑桔黃脈病，因此使用 無病毒苗木、以及鏟除田間病樹是重要的防治手段。為此需要建立一種CYVCV的快速、準(zhǔn) 確、靈敏的檢測(cè)技術(shù)方法以滿足我國(guó)柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要。
[0003] CYVCV為柑桔病毒屬（Mandarivirus)成員，病毒粒子呈彎曲線狀，大小約為 670-700nmX 13-14nm。CYVCV基因組含有7529個(gè)核苷酸，可能包含有6個(gè)開放讀碼框 (0RF)。目前在檢測(cè)CYVCV時(shí)主要采用以酸橙等作為指示植物進(jìn)行鑒定，但檢測(cè)周期長(zhǎng)。雖 然目前常規(guī)RT-PCR已開始運(yùn)用于CYVCV檢測(cè)，但其對(duì)田間早期病樹的檢測(cè)效果不夠理想， 靈敏度還有待提高。巢式RT-PCR的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)RT-PCR，但目前尚未將該技術(shù)運(yùn) 用于CYVCV的檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高的柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR引 物組。
[0005] -種柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR引物組，由外巢引物對(duì)和內(nèi)巢引物對(duì)組成：
[0006] 外巢引物對(duì)：CYVCV-lf :ATCATGAGGTTCCATACCACTCGAG ;
[0007] CYVCV-lr ：CTCGAGTGGTATGGAACCTCATGA ；
[0008] 內(nèi)巢引物對(duì)：CYVCV-2f :AAACCTAATCGGTCCTGTG ;
[0009] CYVCV-2r :GAGACACCCTACTTCAGCG。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的柑桔黃脈病毒 的巢式RT-PCR檢測(cè)方法。
[0011] 本發(fā)明的柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR檢測(cè)方法，是以待測(cè)樣品總RNA為模板，應(yīng) 用權(quán)利要求1所述的外巢引物對(duì)進(jìn)行第一輪RT-PCR擴(kuò)增，再以第一輪RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 為模板用權(quán)利要求1所述的內(nèi)巢引物對(duì)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，檢測(cè)第二輪PCR產(chǎn)物，獲得 469bp的PCR產(chǎn)物的待測(cè)樣品為受到柑桔黃脈病毒侵染的樣品。
[0012] 所述第一輪RT-PCR反應(yīng)體系為：濃度為20?50ng/ μ L的解鏈后的模板RNA溶 液 1. 0 μ L，10mM 的外巢引物 CYVCV-lf 和 CYVCV-lr 各 0· 1 μ L，5 μ L 2Χ 1st印 buffer， 0· 4 μ L PrimScript IStep Enzyme Mix，3· 4 μ L DEPC 水；所述第一輪 RT-PCR 反應(yīng)條件為： 50°C 30min，94°C 2min ;94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 45sec，循環(huán) 20 次；所述第二輪 PCR 反應(yīng)體系為：第一輪RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ L，1 OmM的內(nèi)巢引物CYVCV-2f和CYVCV-2r各 0.2yL，2.5yL 10XPCR緩沖液，0.2yL 濃度為 5U/yL 的 rTaq，16.9yL DEPC水；所述第 二輪 PCR 反應(yīng)條件為：94°C 2min ;94°C 30sec，60°C 30sec，72°C 45sec，循環(huán) 30 次。
[0013] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的柑桔黃脈病毒 巢式RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
[0014] 本發(fā)明的柑桔黃脈病毒巢式RT-PCR檢測(cè)試劑盒，含有上述引物組：外巢引物對(duì) CYVCV-lf、CYVCV-lr 和內(nèi)巢引物對(duì) CYVCV-2f、CYVCV-2r。
[0015] 除了上述特異引物對(duì)外，該試劑盒還含有進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的試劑，該試劑包 括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液等。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，其靈敏度是常規(guī) RT-PCR的100倍，對(duì)處于潛伏期的病毒也能及時(shí)檢測(cè)到。本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確、靈敏地對(duì) CYVCV樣品進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于對(duì)田間柑桔黃脈病病樹的早期監(jiān)控，對(duì)田間柑桔黃脈病預(yù) 防和防治具有重要的有意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為柑桔黃脈病毒巢式RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中1為水對(duì)照，2為負(fù)對(duì)照， 3-5為感病植株樣品，6為5kb+l. 5kb標(biāo)準(zhǔn)分子量。
[0018] 圖2為柑桔黃脈病毒巢式RT-PCR引物組的特異性檢測(cè)圖；其中1為水對(duì)照，2為 負(fù)對(duì)照，3-10依次為柑桔衰退病、柑桔碎葉病、溫州蜜柑萎縮病、裂皮病、鱗皮病、黃龍病、潰 瘍病、柑桔黃脈病植株樣品，11為5kb+l. 5kb標(biāo)準(zhǔn)分子量。
[0019] 圖3為柑桔黃脈病毒巢式RT-PCR檢測(cè)靈敏度測(cè)試圖；其中1和10為5kb+l. 5kb 標(biāo)準(zhǔn)分子量，2-9依次為柑桔黃脈病樣品4稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、10 5倍、106倍、 107倍、108倍后巢式RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，11-18依次為柑桔黃脈病樣品4稀釋10倍、10 2倍、 103倍、104倍、105倍、10 6倍、107倍、108后常規(guī)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0021] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料：
[0022] 本實(shí)驗(yàn)所用分別感染柑桔衰退病、柑桔碎葉病、溫州蜜柑萎縮病、裂皮病、鱗皮病、 柑桔黃脈病、黃龍病、潰瘍病的植株樣品來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所保存毒源。
[0023] 主要試劑：
[0024] RNAiso Plus (TaKaRa 公司，日本），PrimScript IStep Enzyme Mix (TaKaRa，日 本），rTaq(TaKaRa，日本），膠純化試劑盒（Omega公司，美國(guó)），pMD_19T (TaKaRa，日本）， Solution I (TaKaRa，日本），感受態(tài)細(xì)胞 JM109 (TaKaRa，日本）。
[0025] 實(shí)施例1柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR檢測(cè)特異性驗(yàn)證
[0026] 1用于檢測(cè)柑桔黃脈病毒的引物組
[0027] 根據(jù)GenBank中CYVCV(JX040635. 1)的基因組序列，針對(duì)其3'端的保守區(qū)域設(shè)計(jì) 了 CYVCV巢式RT-PCR檢測(cè)方法所需的外巢引物對(duì)（CYVCV-lf和CYVCV-lr)，以及內(nèi)巢引物 對(duì)（CYVCV-2f和CYVCV-2r)。并在GenBank中通過Blast比對(duì)，保證了引物的特異性。引物 序列見表1。
[0028] 表1巢式RT-PCR檢測(cè)CYVCV所用引物序列
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR引物組，其特征在于：由外巢引物對(duì)和內(nèi)巢引物對(duì) 組成： 外巢引物對(duì)：CYVCV-lf :ATCATGAGGTTCCATACCACTCGAG ; CYVCV-lr ：CTCGAGTGGTATGGAACCTCATGA ； 內(nèi)巢引物對(duì)：CYVCV-2f :AAACCTAATCGGTCCTGTG ; CYVCV-2r :GAGACACCCTACTTCAGCG。
2. -種柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于：是以待測(cè)樣品總RNA為模 板，應(yīng)用權(quán)利要求1所述的外巢引物對(duì)進(jìn)行第一輪RT-PCR擴(kuò)增，再以第一輪RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物為模板用權(quán)利要求1所述的內(nèi)巢引物對(duì)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，檢測(cè)第二輪PCR產(chǎn)物，獲得 469bp的PCR產(chǎn)物的待測(cè)樣品為受到柑桔黃脈病毒侵染的樣品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的柑桔黃脈病毒的巢式RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于：所述第 一輪RT-PCR反應(yīng)體系為：濃度為20?50ng/ μ L的解鏈后的模板RNA溶液1. Ο μ L，10mM ISt印 Enzyme Mix，3. 4 μ L DEPC 水；所述第一輪 RT-PCR 反應(yīng)條件為：50 °C 30min， 94°C 2min ;94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 45sec，循環(huán) 20 次；所述第二輪 PCR 反應(yīng)體系為： 第一輪 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 10 μ L，10mM 的內(nèi)巢引物 CYVCV-2f 和 CYVCV-2r 各 0. 2 μ L，2. 5 μ L 10 X PCR緩沖液，0· 2 μ L濃度為5U/ μ L的rTaq，16. 9 μ L DEPC水；所述第二輪PCR反應(yīng)條 件為：94°C 2min ;94°C 30sec，6(TC 30sec，72°C 45sec，循環(huán) 30 次。
4. 含有權(quán)利要求1所述引物組的柑桔黃脈病毒巢式RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的柑桔黃脈病毒巢式RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：還含有 進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP和/或PCR緩沖液試劑。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104152588SQ201410451332
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】周彥, 陳洪明, 王雪峰, 李中安, 周常勇 申請(qǐng)人:西南大學(xué)柑桔研究所