一種制備葡萄糖氧化酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵制備胞外葡萄糖氧化酶的方法，采用橘青霉CICC40277固體發(fā)酵得到發(fā)酵液，然后經(jīng)離心、超濾，二次沉淀，過濾，凍干，即得到葡萄糖氧化酶制品。本方法得到的葡萄糖氧化酶酶活高，收率高，本方法簡單易操作，生產(chǎn)效率高，易于控制，為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶提供參考。
【專利說明】一種制備葡萄糖氧化酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用橘青霉固體發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖氧化酶(β -D-葡萄糖；EC1.1.2.3.4)能催化β -D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸，利用分子氧作為過氧化氫的電子受體。葡萄糖氧化酶用途較廣，它在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)多是利用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，但從黑曲霉中提取的葡萄糖氧化酶為胞內(nèi)酶，需要進行破壁處理，造成了酶活力的損失、純化過程復(fù)雜等缺點。為了克服上述問題，本發(fā)明采用橘青霉固體發(fā)酵制備胞外葡萄糖氧化酶，工藝簡單、易操作、收率高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種利用橘青霉(Penicillium citrinum Thom.)固態(tài)發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶的方法，該方法可以快速分離得到大量高活力的胞外葡萄糖氧化酶，為葡萄糖氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。
[0004]本發(fā)明技術(shù)方案和實施例中所用橘青霉CICC40277由 申請人:自中國工業(yè)菌種微生物保藏中心購買。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是:
[0005]一種制備葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟:
[0006](I)以橘青霉CICC40277為出發(fā)菌株，用無菌水洗脫，稀釋得到橘青霉孢子懸液；
[0007](2)挑取步驟⑴獲得的橘青霉孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，置于恒溫箱中放大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:28~32°C，2~5天；
[0008](3)將步驟⑵培養(yǎng)得到菌種用無菌水進行洗脫，得到孢子懸浮液；
[0009](4)挑取步驟(2)獲得孢子懸浮液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%~20%(v/v)，將固體發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖床中震蕩培養(yǎng)，得到葡萄糖氧化酶發(fā)酵液；
[0010](5)將發(fā)酵液先進行離心、超濾濃縮除鹽，得到葡萄糖氧化酶粗酶液；
[0011](6)將步驟(5)所得粗酶液經(jīng)甲醇、丙酮相結(jié)合二次沉淀，過濾，濾餅凍干，即得到葡萄糖氧化酶制品。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(2)所述斜面培養(yǎng)基成分為:蔗糖30g/L，硝酸鈉3g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，四水合硫酸亞鐵0.01g/L,磷酸氫二鉀lg/L，瓊脂15g/L，余量為蒸懼水，PH6.5。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘蔗渣5~10g/L，酵母粉2~4g/L,硫酸鎂0.3~lg/L，磷酸二氫鈉2~4g/L，氯化鉀0.2~0.5g/L，碳酸鈣25~35g/L0
[0014]作為最佳優(yōu)選，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘蔗渣5g/L，酵母粉2g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鈉2g/L，氯化鉀0.3g/L，碳酸鈣30g/L。
[0015]作為最佳優(yōu)選，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘蔗渣10g/L，酵母粉2g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鈉2g/L，氯化鉀0.2g/L，碳酸鈣30g/L。
[0016]作為優(yōu)選，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在28~35°C，轉(zhuǎn)速在180~220rpm。
[0017]作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在35°C，轉(zhuǎn)速在200rpm。
[0018]作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在28°C，轉(zhuǎn)速在200rpm。
[0019]作為優(yōu)選，步驟(4)搖床震蕩時間為2~5天。
[0020]作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床震蕩時間為2天。
[0021]作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床震蕩時間為3天。
[0022]作為最佳優(yōu)選，步驟(5)離心的工作參數(shù)為8000rpm，20min。
[0023]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其進步和創(chuàng)新之處在于:
[0024](I)本發(fā)明研究了固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶的性質(zhì)，為胞外葡萄糖氧化酶的生廣提供參考。
[0025](2)在提取葡萄糖氧化酶過程中對酶的提取、純化工藝進行了改進，既提高了酶的比活力，又降低了提取過程中酶活的損失。
[0026](3)本發(fā)明采用甘蔗渣作為發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，既充分利用資源，變廢為寶，又節(jié)省成本，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。

【具體實施方式】
[0027]結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步的闡述。下列兩個實施例中所用橘青霉CICC40277由 申請人:自中國工業(yè)菌種微生物保藏中心購買。
[0028]實施例1
[0029]將橘青霉CICC40277菌株用無菌水洗脫，稀釋成16個/mL的孢子懸液，挑取0.1mL的橘青霉孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，將斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)(28°C培養(yǎng)3天)得到的菌體經(jīng)無菌水洗脫16個/mL孢子懸浮液接種于滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基(121°C滅菌，20mim)，接種量為10% (v/v) 0將固體發(fā)酵培養(yǎng)基置于振蕩搖床(工作參數(shù):培養(yǎng)溫度為35°C，轉(zhuǎn)速為200rpm)中培養(yǎng)3天，即得到葡萄糖氧化酶發(fā)酵液。
[0030]葡萄糖氧化酶發(fā)酵液經(jīng)離心(SOOOrpm，20min)、超濾管(超濾管的膜直徑為30ku)超濾、濃縮除鹽和除去小分子雜蛋白。超濾濃縮后得到酶活力83U/mL的葡萄糖氧化酶粗酶液。所得粗酶液用66%甲醇水溶液(m/m)沉淀葡萄糖氧化酶，然后用50%丙酮水溶液(m/m) 二次沉淀，經(jīng)壓濾機過濾廢液，濾餅凍干，得到葡萄糖氧化酶制品。
[0031]所述再生培養(yǎng)基成分為:添加有1.5g/L的2-脫氧-D-葡萄糖的麥芽汁瓊脂。
[0032]所述斜面培養(yǎng)基成分為:蔗糖30g/L，硝酸鈉3g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀
0.5g/L，四水合硫酸亞鐵0.01g/L,磷酸氫二鉀lg/L，瓊脂15g/L，余量為蒸餾水，PH6.5。
[0033]所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘蔗渣5g/L，酵母粉2g/L，硫酸鎂0.5g/L,磷酸二氫鈉2g/L,氯化鉀0.3g/L,碳酸鈣30g/L。
[0034]實施例2
[0035]將橘青霉CICC40277菌株用無菌水洗脫，稀釋成16個/mL的孢子懸液，然后吸取0.1mL的橘青霉孢子懸浮落接種于斜面培養(yǎng)基，將斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)(28°C培養(yǎng)3天)得到的菌體經(jīng)無菌水洗脫16個/mL孢子懸浮液接種于滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基(121°C滅菌，20mim)，接種量為15% (v/v)。將固體發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖床(工作參數(shù):培養(yǎng)溫度為35°C，轉(zhuǎn)速為200rpm)中震蕩培養(yǎng)2天，即得到葡萄糖氧化酶發(fā)酵液。
[0036]葡萄糖氧化酶發(fā)酵液經(jīng)離心(8000rpm，20min)、超濾管超濾(超濾管的膜直徑為30ku)、濃縮除鹽，得到酶活力120U/mL的葡萄糖氧化酶粗酶液。所得粗酶液用66%甲醇水溶液(m/m)沉淀、50%丙酮水溶液(m/m) 二次沉淀，經(jīng)壓濾機過濾廢液，濾餅凍干，得到葡萄糖氧化酶制品。
[0037]所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘蔗渣10g/L，酵母粉2g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鈉2g/L,氯化鉀0.2g/L,碳酸鈣30g/L。
[0038]所述再生培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基同實例I。
[0039]前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。 本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。
【權(quán)利要求】
1.一種制備葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)以橘青霉(Penicilliumcitrinum Thom.)為出發(fā)菌株,用無菌水進行洗脫,稀釋得到橘青霉孢子懸液； (2)挑取步驟(1)獲得的橘青霉孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，置于恒溫箱中放大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:28~32°C，2~5天； (3)將步驟(2)培養(yǎng)得到菌種用無菌水進行洗脫，得到孢子懸浮液； (4)挑取步驟(3)獲得孢子懸浮液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%~20%(v/V)，將固體發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖床中震蕩培養(yǎng)，可得到葡萄糖氧化酶發(fā)酵液。 (5)將發(fā)酵液進行離心、超濾濃縮除鹽，得到葡萄糖氧化酶粗酶液； (6)將步驟(5)所得粗酶液經(jīng)甲醇、丙酮相結(jié)合二次沉淀，過濾，濾餅凍干，即得到葡萄糖氧化酶制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述斜面培養(yǎng)基成分為:蔗糖30g/L，硝酸鈉3g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，四水合硫酸亞鐵0.01g/L，磷酸氫二鉀lg/L，瓊脂15g/L，余量為蒸餾水，PH6.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘鹿洛5~10g/L,酵母粉2~4g/L,硫酸鎂0.3~lg/L,磷酸二氫鈉2~4g/L,氯化鉀0.2~0.5g/L，碳酸鈣25~35g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘蔗渣5g/L，酵母粉2g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鈉2g/L，氯化鉀0.3g/L,碳酸?丐 30g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:甘蔗渣10g/L，酵母粉2g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鈉2g/L，氯化鉀 0.2g/L，碳酸鈣 30g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在28~35°C，轉(zhuǎn)速在180~220rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在28°C，轉(zhuǎn)速在200rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)搖床震蕩時間為2~5天。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)搖床震蕩時間為3天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備葡萄糖氧化酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)離心的工作參數(shù)為8000rpm，20min。
【文檔編號】C12N9/04GK104164411SQ201410452283
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】楊洋, 趙芬芬, 葉琴, 胡振興, 馬萬良 申請人:廣西大學(xué)