重組人白介素15長肽段及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組人白介素15長肽段及其生產(chǎn)方法，所述生產(chǎn)方法為：獲得人IL-15長肽段基因；構(gòu)建真核表達載體并將其轉(zhuǎn)化到畢氏酵母X-33中；抗性篩選高水平分泌表達的酵母轉(zhuǎn)化子；誘導表達，并將上清液經(jīng)鎳柱及離子交換柱純化，得rhIL-15L。本發(fā)明所述生產(chǎn)方法將載體pPICZaA上Kex2Pl’位點氨基酸殘基Ala突變?yōu)镻ro，并以畢氏酵母X-33為宿主菌，實現(xiàn)了rhIL-15L的大量高效穩(wěn)定表達；該方法制得的重組蛋白rhIL-15L帶有HIS及OMYC標簽，易于蛋白純化和檢測，且其是經(jīng)一定程度糖基化修飾的糖蛋白，具有良好的生物活性，可有效維持體外和小鼠體內(nèi)人源NK細胞的增殖及生物活性。
【專利說明】重組人白介素15長肽段及其生產(chǎn)方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及應用重組DNA技術生產(chǎn)基因工程蛋白藥物【技術領域】，特別是涉及一種 高效重組人白介素15長肽段（rhIL-15L)及其生產(chǎn)方法。

【背景技術】
[0002] 白介素15 (又稱IL-15)，作為一種T細胞生長因子最早于1994年被發(fā)現(xiàn)。與白介 素2、白介素4、白介素7、白介素9、粒細胞集落刺激因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 類似同屬于4a螺旋細胞因子家族。白介素15組成型表達于包括單核細胞、巨噬細胞、樹突 狀細胞、成纖維細胞、神經(jīng)細胞等在內(nèi)的多種類型細胞。人源IL-15基因由9個外顯子和8 個內(nèi)含子組成，5到8號外顯子編碼長度為162個氨基酸的成熟白介素15,白介素15的受 體是由a、β、Yc組成的異源三聚體，其氨基酸一級結(jié)構(gòu)參見圖la。作為一種多效細胞因 子其在先天性免疫和獲得性免疫反應中起著重要的作用，IL-15的主要功能是調(diào)節(jié)T細胞 和NK細胞的活化與增殖，其次IL-15也參與NK細胞的發(fā)育與成熟。
[0003] 炎癥與腫瘤的發(fā)生密切相連已成為一種共識，由于IL-15可促進NK細胞、B淋巴細 胞及T淋巴細胞的增殖并可維持這些免疫細胞功能，因此IL-15對于治療一些惡性腫瘤存 在一定療效。在很多腫瘤老鼠模型的臨床研究中研究者發(fā)現(xiàn)IL-15具有抗腫瘤的作用，一 項最新的研究結(jié)果表明，IL-15可延長代謝性CT26結(jié)腸癌小鼠的壽命。非血液性腫瘤中， IL-15幾乎不直接參與實體瘤的形成，但一定程度上IL-15通過免疫監(jiān)視可間接抑制腫瘤 的形成。一項研究發(fā)現(xiàn)在40位不同實體瘤患者血清中IL-15的水平并無顯著性差異且均 呈正常水平。事實上，IL-15可能通過某種保護作用抑制腫瘤的發(fā)育。眾所周知，隨著年齡 增長癌癥發(fā)病率隨之上升，在一項老鼠的研究中發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長血清中的IL-15呈下 降趨勢。IL-15可增強隨年齡增大逐漸下降的免疫監(jiān)視能力，通過這種方式可為機體提供一 種保護機制防止腫瘤的發(fā)生。
[0004] 在腫瘤和感染疾病模型的臨床研究中發(fā)現(xiàn)IL-15是一種有效的疫苗佐劑。Steel 和他的同事開發(fā)了一種靶向性治療neu+乳腺癌的DC疫苗，這種DC疫苗可組成型表達 IL-15。同時免疫IL-15表達型DC細胞和Neu的動物比單獨免疫Neu的動物乳腺癌復發(fā)時 間明顯延長。IL-15Ra/IL-15共表達改進型DC疫苗效果比上述效果更為明顯。這項研究同 時表明IL-15可克服CD4輔助細胞缺陷增強抗腫瘤抗體的免疫應答。研究表明IL-15通過 抑制TRAIL介導的細胞凋亡能克服CD4輔助細胞缺陷允許CD8+免疫應答。研究人員現(xiàn)正 將IL-15作為一種刺激體內(nèi)免疫細胞活性的免疫佐劑進行評估，現(xiàn)階段已有的臨床結(jié)果表 明培養(yǎng)基中添加 IL-15培養(yǎng)出的NK，⑶8+T細胞，⑶8+記憶T細胞及樹突狀細胞轉(zhuǎn)移至動 物體內(nèi)后生物活性顯著提高。
[0005] 隨著對IL-15作用機制及臨床應用研究的不斷深入，IL-15作為藥物及免疫佐劑 其需求量也大大增加。目前，市場上主要利用原核表達系統(tǒng)（主要是大腸桿菌）對其進行 表達，目前還沒有利用畢氏酵母成功表達并純化到IL-15的報道。大腸桿菌的表達產(chǎn)物通 常以包涵體形式存在，需通過變性復性等一系列復雜操作才能得到活性形式的IL-15,此方 法極大的限制了活性蛋白的產(chǎn)率；此外，原核宿主表達尤其是在大腸桿菌中表達，因為LPS 的存在而產(chǎn)生毒素性，往往需要對表達純化產(chǎn)物的毒性進行分析測定；最后，要得到高純度 的蛋白往往需要經(jīng)過多步純化操作處理，在此過程中蛋白的產(chǎn)率下降，生物活性也會隨之 降低。雖然昆蟲細胞表達系統(tǒng)及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)也能表達人重組白介素15,但其生 產(chǎn)成本高昂且產(chǎn)率很低。因此，目前市場上的rhIL-15價格異常昂貴。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效穩(wěn)定生產(chǎn)重組人白介素 15長肽段的方 法，根據(jù)該方法可穩(wěn)定高水平分泌表達rhIL-15L，且其是經(jīng)不同糖基化修飾的rhIL-15L糖 蛋白，還具有很好的生物學活性。
[0007] 解決上述技術問題的具體技術方案如下：
[0008] -種重組人白介素 15長肽段的表達純化方法，包括如下步驟：
[0009] (1)獲得堿基序列如SEQ ID NO. 1所述的人IL-15L基因，連接到pMD-20T載體，得 質(zhì)粒rhIL-15L/pMD-20T，經(jīng)測序確定為正確的表達序列；
[0010] (2)構(gòu)建并篩選真核表達載體：將pPICZ a A原始載體和質(zhì)粒rhIL-15L/pMD-20T 分別進行EcoR I和Not I雙酶切純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組表達載體 pPICZ a A/Ala/rhIL-15L，將所述重組表達載體 pPICZ a A/Ala/rhIL-15L 的 Kex2P' 1 位點 Ala突變?yōu)镻ro,得到重組表達載體pPICZ a A/Pro/rhIL-15L ;
[0011] (3)轉(zhuǎn)化重組載體至真核酵母宿主中：將重組載體pPICZ a A/Pro/rhIL-15L用Sac I單酶切線性化，再轉(zhuǎn)入畢氏酵母X-33宿主中；經(jīng)過zeocin篩選得到陽性克隆；
[0012] (4)高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子的篩選：將陽性克隆轉(zhuǎn)接至含zeocin的YPDZ平 板中，利用zeocin濃度梯度篩選得到高抗性轉(zhuǎn)化子，再用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，甲醇誘導，得高 水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子；
[0013] (5)純化：用鎳親和層析柱和DEAE柱對rhIL-15L進行純化，得重組蛋白 rhIL-15L。
[0014] 在其中一些實施例中，步驟（4)所述高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子的篩選的具體方 法為：將陽性克隆轉(zhuǎn)接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin濃度梯度篩選得到高抗性 轉(zhuǎn)化子，再用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心收集細胞，BMMY培養(yǎng)基重懸細胞，得細胞液，并調(diào)節(jié)細 胞液中甲醇的濃度為〇. 95-1. 05%，誘導70-74h，得高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子。
[0015] 在其中一些實施例中，步驟（4)所述的zeocin濃度梯度篩選的具體方法為：將陽 性克隆轉(zhuǎn)接至含有500 μ g/ml zeocin的YPDZ平板中，篩選到500 μ g/ml濃度zeocin抗 性的轉(zhuǎn)化子，再將所述轉(zhuǎn)化子用新鮮的YH)液體培養(yǎng)基洗下，經(jīng)稀釋后涂布到1500 μ g/ml zeocin的YPDZ平板，以此類推直至篩選到3000 μ g/ml zeocin濃度的高抗性轉(zhuǎn)化子。
[0016] 在其中一些實施例中，步驟（4)所述的誘導的時間為72h。
[0017] 在其中一些實施例中，步驟（5)所述的純化的具體方法為：將高水平分泌表達酵 母轉(zhuǎn)化子進行擴大培養(yǎng)，將上清液經(jīng)緩沖液A透析，再利用鎳親和層析柱于AKTA-HPLC系 統(tǒng)中純化，再用緩沖液A漂洗后，利用緩沖液B梯度洗脫收集mAu>100的洗脫液，將所述洗 脫液利用緩沖液C透析，再利用DEAE柱于AKTA系統(tǒng)中純化，0-1M NaCl、20mM Tris pH8. 0 線性洗脫，收集mAu>50的洗脫液，即可；所述緩沖液A為：0. 2M、50mM咪唑，20mM Tris-HCl PH8. 0,所述緩沖液B為：0. 2M、0. 5M咪唑，20mM Tris-HCl PH8. 0,所述緩沖液C為：20mM Tris、PH8. 0。
[0018] 在其中一些實施例中，步驟（1)為：獲得堿基序列如SEQ ID NO. 1所述的人IL-15L 基因，以所述基因為模板，用特異引物擴增hIL-15L基因片段，回收PCR產(chǎn)物連接到pMD-20T 載體，得質(zhì)粒rhIL-15L/pMD-20T，經(jīng)測序確定為正確的表達序列。
[0019] 在其中一些實施例中，步驟（1)所述的特異引物為：
[0020] IL-15Lfor :5' -GAATTCGGCATTCATGTCTTCATTTTGG-3，，
[0021] IL-15Lfor :5' -GCGGCCGC AGAAGTGTTG ATGAACATTTGG-3'。
[0022] 在其中一些實施例中，步驟（3)所述的YPDZ平板中zeocin的濃度為100 μ g/ml。
[0023] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種采用上述生產(chǎn)方法制得的重組人白介素 15長肽 段。
[0024] 本發(fā)明所述一種重組人白介素 15長肽段及其生產(chǎn)方法具有以下優(yōu)點和有益效 果：
[0025] (1)本發(fā)明所述方法經(jīng)發(fā)明人大量的實驗和研究，得出：以如SEQ ID NO. 1所示的 人IL-15L基因為外源基因，并通過對pPICZ a A載體上Kex2Pl'位點進行改造，首次利用畢 氏酵母X-33成功實現(xiàn)了 rhIL-15L的大量穩(wěn)定高效表達，具體為：將原始載體pPICZ a A上 Kex2Pl'位點氨基酸殘基Ala突變?yōu)镻ro,并以畢氏酵母Χ-33為宿主菌，實現(xiàn)了 rhIL-15L的 大量高效穩(wěn)定表達；該方法既能夠防止宿主菌對表達產(chǎn)物的降解、減輕宿主細胞代謝負荷 以及表達產(chǎn)物對宿主的毒性作用，還可促進分泌蛋白按適當?shù)姆绞秸郫B、恢復其天然構(gòu)象。
[0026] (2)采用本發(fā)明所述生產(chǎn)方法制得的表達產(chǎn)物帶有HIS及C-MYC標簽，易于純化 和檢測表達產(chǎn)物，且經(jīng)質(zhì)譜分析表明，所獲得的rhIL-15L是經(jīng)一定程度糖基化修飾的糖蛋 白，其具有良好的生物活性，可有效維持體外和小鼠體內(nèi)人源NK細胞的增殖及生物活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖Ia為hIL-15氨基酸結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028] 圖Ib為真核表達載體pPICZ a A/Pro/rhIL-15構(gòu)建示意圖；
[0029] 圖2為IL-15表達載體篩選結(jié)果western blot不意圖；其中，1為 pPICZaA-IL-15S-Tag，2 為 pPICZaA-Pr〇-IL-15S-Tag，3 為 pPICZaA-IL-15L-Tag，4-為 pPICZaA-Pr〇-IL-15L-Tag，1# 為 pPICZ α A，2# 為 DPTOh，3# 為 DPT72h。
[0030] 圖3為畢氏酵母轉(zhuǎn)化子PCR驗證電泳分析示意圖，其中，1、2、3為pPICZ aA/ rhIL-15畢氏酵母轉(zhuǎn)化子，1#為X-33空菌株；
[0031] 圖4為高水平酵母表達中的篩選及搖瓶條件下rhIL-15L不同誘導時間的 SDS-PAGE分析示意圖；
[0032] 圖5為高水平酵母轉(zhuǎn)化子搖瓶條件下rhIL_15L不同誘導時間的western blot分 析示意圖；
[0033] 圖6a為rhIL-15L的鎳親和層析柱純化的蛋白SDS-PAGE分析示意圖，其中，1#為 甲醇誘導72h樣，2#為流穿液，A為純化到的rhIL-15L ;
[0034] 圖6b為rhIL-15L的DEAEFF柱純化的蛋白SDS-PAGE分析示意圖，1#為鎳柱純化 樣，2#為離子柱純化樣；
[0035] 圖7為鎳親和層析純化得到的IL-15L去糖基化結(jié)果SDS-PAGE分析示意圖；
[0036] 圖8a為rhIL_15L質(zhì)譜分析條帶示意圖；
[0037] 圖8b為圖8a所示的rhIL_15L去糖基化Bandl質(zhì)譜分析結(jié)果示意圖；
[0038] 圖8c為圖8a所示的rhIL_15L去糖基化Band2質(zhì)譜分析結(jié)果示意圖；
[0039] 圖9a為rhIL_15L對促進人NK細胞體外存活及增殖的影響圖；
[0040] 圖9b為rhIL-15L對促進人NK細胞在小鼠外周血內(nèi)存活及增殖的影響圖；
[0041] 圖9c為rhIL-15L對促進人NK細胞在小鼠脾臟內(nèi)存活及增殖的影響圖；
[0042] 圖9d為rhIL_15L對促進人NK細胞在小鼠骨髓內(nèi)存活及增殖的影響圖。

【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明選用畢氏酵母X-33菌株，整合性表達質(zhì)粒pPICZ a A載體均由購自美國 Invitrogen 公司。
[0044] 本發(fā)明所述的人工合成人白介素15長肽段cDNA(定義為rhIL_15L)，購自南京金 斯瑞公司；所述rhIL-15L合成時，在rIL-15L5'端引入EcoRl酶切位點3'端引入Notl酶 切位點，序列如SEQIDN0. 1所示；
[0045] SEQ ID NO. 1 ：
[0046] GAATTCGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGG GTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGA AAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGT CCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAAT GTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACA TATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTGCGGCCGC
[0047] 本發(fā)明所用培養(yǎng)基配方如下：
[0048] 1)酵母生長培養(yǎng)基（BMGY):
[0049] 完全溶解IOg酵母提取物，20g蛋白胨，定容至700ml。121 °C蒸汽高壓滅 菌 15-20min，冷卻至室溫，加入 IOOmllM 磷酸鉀溶液，100ml YNB，2ml500*Biotin， 100ml10*GY ；
[0050] 2)酵母誘導培養(yǎng)基（BMMY):
[0051] 完全溶解IOg酵母提取物，20g蛋白胨，定容至700ml。121 °C蒸汽高壓滅菌 15-20min，冷卻至室溫，加入 100ml IM 磷酸鉀溶液，100ml YNB，2ml500*Biotin，100ml 10*M ;
[0052] 3) Yro液體培養(yǎng)基：
[0053] 完全溶解IOg酵母提取物，20g蛋白胨，IOg葡糖糖，定容到1000ml，121°C蒸汽高壓 滅菌15-20min。（YPD固體培養(yǎng)基：向YPD液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂即可）。
[0054] 以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0055] 實施例1
[0056] 本實施例一種高效rhIL_15L的表達純化方法，主要包括以下步驟：
[0057] 1、克隆 rhIL_15L 全基因 ：
[0058] 設計一對引物，以人工合成的IL-15L cDNA為模板特異性擴增出完整人重組 IL-15L基因片段，所述IL-15L5'端引入EcoRl酶切位點3'端引入Notl酶切位點（引入 酶切位點的IL-15L的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示）以便后續(xù)IL-15片段插入表達載體； PCR條件為：95°C預變性，5min，一個熱循環(huán)；95°C熱變性30s，55°C退火30s，72°C延伸45s， 30個熱循環(huán)；72°C復性lOmin。瓊脂糖電泳回收擴增片段連接到pMD-20T載體（購自廣州 TAKARA公司），得質(zhì)粒rhIL-15L/pMD-20T，酶切和核酸測序鑒定，測定序列與genebank公布 的IL-15L序列一致。IL-15L氨基酸一級結(jié)構(gòu)如圖la。
[0059] 所述IL-15L特性擴增引物：
[0060] IL-15Lfor :5' -GAATTCGGCATTCATGTCTTCATTTTGG-3'（SEQ ID NO. 2);
[0061] IL-15Lfor :5' -GCGGCCGCAGAAGTGTTGATGAACATTTGG-3,（SEQ ID NO. 3)。
[0062] 2、構(gòu)建畢氏酵母分泌型表達載體pPICZ a A/Pro/rhIL_15L :
[0063] 1)用EcoR I和Not I雙酶切重組質(zhì)粒pMD-20T/rhIL-15L，獲得目的片段 rhIL-15L，反應體系如下（所用內(nèi)切酶及緩沖液均購于Thermo公司）：

【權利要求】
1. 一種重組人白介素15長肽段的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟： (1)獲得堿基序列如SEQ ID NO. 1所示的人IL-15L基因，連接到pMD-20T載體，得質(zhì)粒 rhIL-15L/pMD-20T ； ⑵構(gòu)建并篩選真核表達載體：將PPICZaA原始載體和質(zhì)粒rhIL-15L/pMD-20T分 別進行EcoR I和Not I雙酶切純化回收，并用T4DNA連接酶連接，得重組表達載體 pPICZ a A/Ala/rhIL-15L，將所述重組表達載體 pPICZ a A/Ala/rhIL-15L 上 Kex2P' 1 位點 Ala突變?yōu)镻ro,得到重組表達載體pPICZ a A/Pro/rhIL-15L ; (3) 轉(zhuǎn)化重組載體至真核酵母宿主中：將重組載體pPICZ a A/Pro/rhIL-15L用Sac I 單酶切線性化，再轉(zhuǎn)入畢氏酵母X-33宿主中；經(jīng)過含zeocin的YPDZ平板篩選得到陽性克 ??； (4) 高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子的篩選：將陽性克隆轉(zhuǎn)接至含zeocin的YPDZ平板中， 利用zeocin濃度梯度篩選得到高抗性轉(zhuǎn)化子，再用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，甲醇誘導，得高水平 分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子； (5) 純化：用鎳親和層析柱和DEAE柱對rhIL-15L進行純化，得重組蛋白rhIL-15L。
2. 根據(jù)權利要求1所述的重組人白介素15長肽段的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（4) 所述高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子的篩選的具體方法為：將陽性克隆轉(zhuǎn)接至含zeocin的 YPDZ平板中，利用zeocin濃度梯度篩選得到高抗性轉(zhuǎn)化子，再用BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心收 集細胞，BMMY培養(yǎng)基重懸細胞，得細胞液，并調(diào)節(jié)細胞液中甲醇終濃度為0. 95-1. 05%，誘 導70-74h，得高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子。
3. 根據(jù)權利要求2所述的重組人白介素15長肽段的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（4) 所述的zeocin濃度梯度篩選的具體方法為：將陽性克隆轉(zhuǎn)接至含有500 μ g/ml zeocin 的YPDZ平板中，篩選到500 μ g/ml濃度zeocin抗性的轉(zhuǎn)化子，再將所述轉(zhuǎn)化子用新鮮的 YH)液體培養(yǎng)基洗下，經(jīng)稀釋后涂布到1500 μ g/ml zeocin的YPDZ平板，再將1500 μ g/mL Zeocin的YPD平板生長的轉(zhuǎn)化子經(jīng)稀釋后涂布到3000 μ g/mL Zeocin的YPD平板，篩選到 3000 μ g/ml zeocin濃度的高抗性轉(zhuǎn)化子。
4. 根據(jù)權利要求2所述的重組人白介素15長肽段的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（4) 所述的誘導的時間為72h。
5. 根據(jù)權利要求1-4任一項所述的重組人白介素15長肽段的生產(chǎn)方法，其特征在于， 步驟（5)所述的純化的具體方法為：將高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子進行擴大培養(yǎng)，將上清 液經(jīng)緩沖液A透析，再利用鎳親和層析柱于AKTA-HPLC系統(tǒng)中純化，后用緩沖液A漂洗，再 利用緩沖液B梯度洗脫收集mAu大于100的洗脫液，將所述洗脫液利用緩沖液C透析，再利 用DEAE柱于AKTA系統(tǒng)中純化，0-1M NaCl、20mM Tris pH8. 0線性洗脫，收集mAu>50的洗脫 液，即可；所述緩沖液A為：0.2M NaCl、50mM咪唑，20mM Tris-HCl pH8.0,所述緩沖液B為： 0· 2M NaCl、0. 5M 咪唑，20mM Tris-HCl ρΗ8· 0,所述緩沖液 C 為：20mM Tris ρΗ8· 0。
6. 根據(jù)權利要求1-4任一項所述的重組人白介素15長肽段的生產(chǎn)方法，其特征在于， 步驟⑶所述的YPDZ平板中zeocin的濃度為100 μ g/ml。
7. -種如權利要求1-6任一項所述的生產(chǎn)方法制得的重組人白介素15長肽段。
【文檔編號】C12N15/81GK104212808SQ201410452798
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權日:2014年9月5日
【發(fā)明者】吳東海, 孫偉, 賴允鑫, 李洪波, 唐小鳳, 李鵬, 劉鵬濤 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院