一種檢測融合基因AML1-ETO mRNA表達(dá)的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種檢測融合基因AML1-ETO?mRNA表達(dá)的試劑盒，采用TaqMan熒光探針技術(shù)，選取融合基因AML1-ETO及內(nèi)參基因ABL為靶區(qū)域，分別設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，其中熒光探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，利用熒光PCR檢測儀可在FAM通道檢測熒光信號，由于內(nèi)參基因ABL在細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在本試劑盒中可作為內(nèi)參對起始細(xì)胞量進(jìn)行校正，用于整個(gè)核酸提取和反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。本發(fā)明還提出了上述檢測融合基因AML1-ETO?mRNA表達(dá)的試劑盒的檢測方法。本發(fā)明具有很高的靈敏度和特異性，有利于診斷、評價(jià)患者療效、預(yù)后及對微小殘留病變復(fù)發(fā)的監(jiān)測。
【專利說明】-種檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒及其檢測 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒，特別是涉及以一步 法Real-Time qPCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)快速、定量檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA的試劑盒，本發(fā)明還提出了上述檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒 的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] AML1-ET0基因融合是由t(8 ;21) (q22 ;q22)染色體易位而形成的，其編碼的蛋白 產(chǎn)物為一種多功能蛋白質(zhì)，可通過影響細(xì)胞內(nèi)許多信號傳導(dǎo)系統(tǒng)和靶分子而參與細(xì)胞的分 化與增值、細(xì)胞凋亡以及自我更新等過程，在t(8 ;21) (q22 ;q22)染色體易位陽性的急性 髓系白血?。ˋML)特別是AML-M2型白血病的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。（t(8;21) (922;922)易位）占41^的20%-40%，特別是在兒童？48-]?2中多見。以8 ;21)(922;922) 易位引起AML1 基因 （acute myeloblastic leukemia one gene)和ΕΤ0基因 （eight twenty one gene，也稱為MTG8基因）的融合。AML1基因斷裂點(diǎn)在第5、6外顯子之間，ETO斷裂點(diǎn)在 第2外顯子的上游，AML1第5外顯子和ΕΤ0第2外顯子融合形成AML1/ET0基因，目前尚未 發(fā)現(xiàn)AML1/ET0其他斷裂點(diǎn)引起的轉(zhuǎn)錄本。t(8 ;21) (q22 ;q22)陽性是預(yù)后好的標(biāo)志，其完全 緩解（CR)率可達(dá)90 %，5年長期無病生存率（event-free survival, EFS)可達(dá)50 % -70 %。 目前常用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要包括染色體核型分析、FISH、PCR檢測等。
[0003] Real-TimePCR技術(shù)是今年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有核 電偶聯(lián)裝置（CCD)的PCR擴(kuò)增儀，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實(shí)時(shí)反映 PCR的每個(gè)循 環(huán)的擴(kuò)增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒 光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴(kuò)增曲線。一步法Real-Time RT-PCR技術(shù) 是 Real-Time PCR 的一種（Yuqi Z，Min Y，Johann WM，et al. 2002. Quantification of human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology. J Cli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C, Seifried E, Roth WK, et al. 2001. TaqMan 5-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. J Clin Microbiol,39:4302-4308 ；Schuurman R, Descamps D,Weverling GJ, et al. Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol. 1996 Dec ； 34(12):3016-22 ；Christopherson C,Kidane Y, Conway B, et al. PCR-Based assay to quantify human immunodeficiency virus type 1 DNA in peripheral blood mononuclear cells. J Clin Microbiol. 2000 Feb ;38(2) :630-4.)，它是一種直接快速檢測 RNA 的方法， 與檢測DNA的Real-Time PCR相比，不同之處在于前者在反應(yīng)體系中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時(shí) 多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟；相同之處在于兩者在反應(yīng)體系中均有一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào) 告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針，探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基 團(tuán)，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴(kuò)增過程中有靶序列的存在，擴(kuò)增的過程中探針分子逐漸被水解切 斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基 團(tuán)發(fā)出熒光信號。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提出一種檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒， 本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對外周血或骨髓樣本中融 合基因 AML1-ET0 mRNA進(jìn)行定量檢測，檢測急性髓系白血?。ˋML)等血液系統(tǒng)腫瘤中融合 基因 AML1-ET0 mRNA的表達(dá)水平，以有利于評價(jià)患者化療效果、預(yù)后及對微小殘留病變復(fù)發(fā) 的監(jiān)測。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提出上述檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒的 檢測方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0007] 一種檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒，包括：（a) RNA提取試劑、 AML1-ET0反應(yīng)液、ABL反應(yīng)液、一步法PCR酶系、AML1-ET0陽性定量參考品1-5、ABL陽性定 量參考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包裝上述試劑的試劑管的包裝盒；
[0008] 所述的RNA提取試劑包括5 X的紅細(xì)胞裂解液、RNA提取液-Trizol試劑、氯仿、 異丙醇和DEPC乙醇；
[0009] 所述的AML1-ET0反應(yīng)液包括正向引物、反向引物、AML1-ET0的寡核苷酸探針、PCR 反應(yīng)緩沖液，其中AML1-ET0反應(yīng)液中正向和反向引物分別是：
[0010] 5, -GGATGGGCCCCGAGAAC-3，（SEQ ID N0:1);
[0011] 5' -GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3'（SEQ ID N0:2);
[0012] AML1-ET0 的寡核苷酸探針是：5'-X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3'（SEQ ID NO:3)，其中X表示的是熒光報(bào)告基團(tuán)，Y表示的是熒光淬滅基團(tuán)；
[0013] 所述的ABL反應(yīng)液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探針、PCR反應(yīng)緩沖 液，其中ABL反應(yīng)液中正向和反向引物分別是：
[0014] 5'-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3'（SEQ ID N0:4)
[0015] 5'-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3'（SEQ ID N0:5)
[0016] ABL 的寡核苷酸探針是：5'-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3'（SEQ ID N0:6)， 其中X表不的是突光報(bào)告基團(tuán)，Y表不的是突光淬滅基團(tuán)；
[0017] 所述的AML1-ET0陽性定量參考品1-5為均含有濃度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 107 拷貝/5 μ L的AML1-ET0目的片段的重組質(zhì)粒；所述的ABL陽性定量參考品1-4為均含有濃 度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 106拷貝/5 μ L的ABL目的片段的重組質(zhì)粒。
[0018] 本發(fā)明是使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物和探針，用分子篩和快速蛋 白質(zhì)液相層析法（FPLC)純化后進(jìn)行氨解處理；同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別 在其5'端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)（報(bào)告基團(tuán)）的6-FAM amidite，并在其3'端標(biāo)記借助活 性連接臂偶聯(lián)上作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的BHQ1，以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針，然 后，使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠（20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引 物和探針。
[0019] 本試劑盒采用TaqMan熒光探針技術(shù)，選取融合基因 AML1-ET0及內(nèi)參基因 ABL為 靶區(qū)域，分別設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，其中熒光探針5'端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3'端 標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，利用熒光PCR檢測儀可在FAM通道檢測熒光信號。由于內(nèi)參基因 ABL在細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在本試劑盒中可作為內(nèi)參對起始細(xì)胞量進(jìn)行校正，用于整個(gè) 核酸提取和反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。通過簡單易操作的核酸提取系統(tǒng)，結(jié)合Real-Time PCR 檢測系統(tǒng)運(yùn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增程序，本試劑盒實(shí)現(xiàn)了檢測的高特異、高靈敏和高效率。
[0020] 進(jìn)一步地，所述的AML1-ET0反應(yīng)液和ABL反應(yīng)液中的PCR緩沖液包含10mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液、50mmol/L 的 KC1 溶液和 3. Ommol/L 的 MgCl2 溶液。
[0021] 進(jìn)一步地，所述一步法PCR酶系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動Taq酶、RNA酶抑制劑、dNTPs 以及酶稀釋液，其中逆轉(zhuǎn)錄酶的用量為1. 5?3. 5U/人份、熱啟動Taq酶的用量為3?7U/ 人份、RNA酶抑制劑的用量為15?25U/人份、dNTPs濃度為0. 20mmol/L、酶稀釋液為一般 市售的酶稀釋液。
[0022] 進(jìn)一步地，應(yīng)用于靶多核苷酸擴(kuò)增的所述的AML1-ET0反應(yīng)液中引物和探針?biāo)?的濃度均為2?lOpmol/人份，優(yōu)選引物濃度為5pmol/人份、探針濃度為3pmol/人份。
[0023] 進(jìn)一步地，所述的ABL反應(yīng)液中引物和探針?biāo)玫臐舛染鶠??lOpmol/人份，優(yōu) 選引物濃度為5pmol/人份、探針濃度為3pmol/人份。
[0024] 進(jìn)一步地，所述試劑盒的待檢樣本是外周血或骨髓。
[0025] 本發(fā)明提供的一步法Real-Time qPCR試劑盒可以檢測出融合基因 AML1-ET0的靈 敏度為250拷貝/5uL，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。
[0026] 本發(fā)明針對融合基因 AML1-ET0基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，檢測的線性范圍為 5X 108 拷貝 /5uL ?5X 102 拷貝 /5uL。
[0027] 本發(fā)明的第二個(gè)目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0028] -種檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：
[0029] (1)標(biāo)本采集
[0030] 標(biāo)本采集：抽取受檢者靜脈血或骨髓3?5ml，注入含乙二胺四乙酸二鈉或枸櫞酸 鈉抗凝劑的采血管，立即輕緩顛倒采血管混合5?10次，使抗凝劑與靜脈血或骨髓充分混 勻，密閉待用；
[0031] ⑵核酸提取
[0032] (a)先將5X的紅細(xì)胞裂解液用無菌純化水稀釋得到IX的紅細(xì)胞裂解液；(b) 取5mL潔凈離心管加入抗凝血2mL ; (c)向離心管中加入2mL 1 X的紅細(xì)胞裂解液，蓋緊管 蓋，漩潤振蕩15s以充分混勻，室溫放置3min ; (d)室溫下6000rpm離心5min，去上清，保留 沉淀；(e)重復(fù)步驟（c)和（d)，盡可能吸除殘存液體；（f)向離心管中加入lmL RNA提取 液-Trizol試劑，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，再將其轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管并靜置 5min ; (g)繼續(xù)向離心管中加入200 μ L氯仿，蓋緊管蓋，用力上下振搖15s，15?30°C靜置 3min，4°C條件下12000rpm離心15min，離心后得到酚-氯仿下層、中間層及無色水相上層； (h)小心吸取400 μ L上層水相轉(zhuǎn)移到另一潔凈離心管中，加入500 μ L異丙醇，蓋緊管蓋， 上下顛倒3次，15-30°C條件下靜置10min，然后4°C條件下12000rpm離心10min離心后可 見白色膠狀RNA沉淀，去上清；（i)加入向離心管中加入lmL 75%的DEPC乙醇洗滌RNA沉 淀，混勻，4°C條件下12000rpm離心5min，小心吸去大部分DEPC乙醇，短暫離心，再吸去剩余 DEPC乙醇，打開離心管蓋將沉淀在室溫空氣中干燥5min以使痕量乙醇揮發(fā)；（j)用50 μ L DEPC水溶解沉淀，室溫靜置2min，RNA溶液可立即進(jìn)行PCR或存于-70± 10°C備用；
[0033] (3) PCR 檢測
[0034] (a)配置體系
[0035] AML1-ET0反應(yīng)體系：將3 μ L反應(yīng)酶系和17 μ L AML1-ET0反應(yīng)液充分混合，然后 分裝20 μ L至若干PCR反應(yīng)管；
[0036] ABL反應(yīng)體系：將3 μ L反應(yīng)酶系和17 μ L ABL反應(yīng)液充分混合，然后分裝20 μ L至 若干PCR反應(yīng)管；
[0037] (b)加樣、擴(kuò)增
[0038] 往上述裝有AML1-ET0反應(yīng)體系的不同的反應(yīng)管中分別加入提取后的待測核酸 5 μ L、陰性對照品-DEPC水5 μ L和AML1-ET0陽性定量參考品5 μ L，往上述裝有ABL反應(yīng)體 系的不同的反應(yīng)管中分別加入提取后的待測核酸5 μ L、陰性對照品-DEPC水5 μ L和ABL陽 性定量參考品5 μ L，各自蓋緊反應(yīng)管蓋，SOOOrpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增完成后收集熒光信號，并保存檢測數(shù)據(jù)文件；
[0039] 擴(kuò)增時(shí)ABI7300/7500熒光PCR擴(kuò)增儀參數(shù)設(shè)置如下：
[0040] Reporter Dyel ：FAM
[0041] Quencher Dye ：none
[0042] Passive Reference ：none
[0043] LightCycler480熒光PCR擴(kuò)增儀的參數(shù)設(shè)置如下：
[0044] "Customizes"模塊中選擇 FAM(483-533)濾片；
[0045] 擴(kuò)增的溫度參數(shù)統(tǒng)一設(shè)置如下：擴(kuò)增的反應(yīng)溫度和時(shí)間為：50°C 15min，1個(gè)循環(huán)； 95°C 15min，1 個(gè)循環(huán)；之后 94°C 15s，55°C 45s，40 ?50 個(gè)循環(huán)；
[0046] (c)結(jié)果分析
[0047] 按對應(yīng)順序設(shè)置AML1-ET0的5個(gè)陽性定量參考品，Task中設(shè)為Standard， Quantity中設(shè)為對應(yīng)的拷貝數(shù)，然后根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以 及Threshold值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，start值可以在1?10、stop值可以在 5?20、Threshold值可以在5K?50K范圍選擇），使"Standard curve"窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖達(dá)到最佳，即R2值（correlation數(shù)值）彡0· 97,最后到"Report"窗口下記錄儀器自 動分析計(jì)算出的AML1-ET0未知標(biāo)本的拷貝數(shù)（AML1-ET0-Qty)，將該結(jié)果導(dǎo)出，然后重新按 對應(yīng)順序設(shè)置ABL的4個(gè)陽性定量參考品，步驟同前，將ABL未知標(biāo)本的拷貝數(shù)（ABL-Qty) 導(dǎo)出；
[0048] ⑷結(jié)果判定
[0049] 如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則判所檢測的基因表達(dá)量小于檢測限 度；
[0050] 如果增長曲線呈S型曲線且ABL的Ct值< 35,則樣品的AML1-ET0/ABL表達(dá)量為 AML1-ΕΤΟ-Qty/ABL-Qty 〇
[0051] 進(jìn)一步地，所述的AML1-ET0陽性定量參考品1-5為均含有濃度為1X103拷貝 /5 μ L?1 X 107拷貝/5 μ L的AML1-ET0目的片段的重組質(zhì)粒；所述的ABL陽性定量參考品 1-4為均含有濃度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 106拷貝/5 μ L的ABL目的片段的重組質(zhì)粒。
[0052] 進(jìn)一步地，所述標(biāo)本在2?8 °C條件下保存不應(yīng)超過48小時(shí)；或者保存 在-20±5°C待測，保存期為1個(gè)月；或者使用紅細(xì)胞裂解液處理全血或骨髓，獲得有核細(xì)胞 沉淀后加入lml RNA提取液，振蕩混勻，于-70±10°C保存1個(gè)月；避免反復(fù)凍融；標(biāo)本的運(yùn) 輸條件為〇°C左右。
[0053] 進(jìn)一步地，擴(kuò)增的反應(yīng)溫度和時(shí)間為：50°C 15min-個(gè)循環(huán)，95°C 15min-個(gè)循環(huán)； 94°C 15s，55°C 45s 40個(gè)循環(huán)，熒光檢測選擇在55°C 45s這一環(huán)節(jié)。
[0054] 特別值得說明的是，為了確保本發(fā)明的基因 mRNA檢測方法的準(zhǔn)確性，另外使用攜 帶有AML1-ET0基因（cDNA)序列的重組質(zhì)粒作為DNA陽性定量參考品。借助這些額外標(biāo)準(zhǔn) 品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行平行檢測并制作所謂的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以 進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的檢測精密度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒附加的質(zhì)量控 制標(biāo)準(zhǔn)。
[0055] 與基于擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行單一終點(diǎn)檢測的傳統(tǒng)PCR試劑盒不同，Real-Time qPCR試劑盒可以在擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程中隨時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而大大提高了定量檢測 的準(zhǔn)確性和精密度。眾所周知，Real-Time qPCR是在PCR擴(kuò)增體系中，同時(shí)加入引物和5'、 3'末端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)（例如6-FAM amidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(tuán) (例如6-羧基四甲基若丹明）的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補(bǔ)結(jié)合， 其序列保持完整，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號將被淬滅基團(tuán)吸收，所以沒有熒光信號產(chǎn)生；而 當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，DNA聚合酶的5' -3'外切酶活性將降解熒光探針，導(dǎo)致熒光報(bào)告基 團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，因而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收并記錄到熒光信號。每擴(kuò)增一條DNA鏈 即有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，實(shí)時(shí)地監(jiān)測 整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知靶多核苷酸（模板）進(jìn)行定量分析。
[0056] 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數(shù)的對 數(shù)為橫坐標(biāo)，并以如上測得的Ct值為縱坐標(biāo)。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可從 基于平行實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知其起始拷貝數(shù)的對數(shù)，然后計(jì)算出該靶多 核苷酸的起始拷貝數(shù)（當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)達(dá)到Ct值即初始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，Ct值得重現(xiàn)性極 好，即同一靶多核苷酸在不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間在不同管內(nèi)擴(kuò)增所得到的Ct值總是恒 定的）。也就是說，基于上述的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果推算出靶多核苷酸的量（起始拷貝數(shù)）。具體 實(shí)現(xiàn)包括：（1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值 時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；（2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知 量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，從而計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。
[0057] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為：
[0058] 1)本發(fā)明使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖謩e對已知的融合基因 AML1-ET0基因的核苷 酸序列進(jìn)行同源性比較，在找到同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件選擇 并設(shè)計(jì)寡核苷酸引物和探針，由于所設(shè)計(jì)的引物和探針均具有互補(bǔ)于AML1-ET0基因的序 列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶的酶切 位點(diǎn)，所以避免了融合基因 AML1-ET0檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準(zhǔn)確 度，同時(shí)設(shè)置了內(nèi)參ABL基因作為相對定量標(biāo)準(zhǔn)，用于整個(gè)反應(yīng)體系的質(zhì)量控制，在本試劑 盒中可作為內(nèi)參對起始細(xì)胞量進(jìn)行校正；
[0059] 2)適宜于一步法Real-Time qPCR擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動Taq酶、2' -脫氧核苷 三磷酸、RNA酶抑制劑（RNasin)、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能 夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端 分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、能夠與內(nèi)標(biāo)核苷酸結(jié)合并且兩 末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的檢測內(nèi)標(biāo)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖 液；
[0060] 3)通過檢測急性髓系白血病（AML)等血液系統(tǒng)腫瘤中融合基因 AML1-ET0的mRNA 表達(dá)水平，有利于評價(jià)患者化療效果、預(yù)后及對微小殘留病變復(fù)發(fā)的監(jiān)測；
[0061] 4)全封閉反應(yīng)，提取RNA以后，直接用于Real-Time qPCR檢測，避免了污染發(fā)生；
[0062] 5)由于內(nèi)參基因 ABL在細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，因此，本試劑盒中選擇ABL作為內(nèi) 參對起始細(xì)胞量進(jìn)行校正，用于整個(gè)核酸提取和反應(yīng)體系的質(zhì)量控制；
[0063] 6)同時(shí)使用攜帶有AML1-ET0基因和內(nèi)參ABL基因序列的重組質(zhì)粒作為陽性定量 參考品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行相對定量的平行檢測，從而可確保檢測結(jié) 果的可靠性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0064] 圖1為AML1-ET0陽性定量參考品1-5、陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果；
[0065] 圖2為ABL陽性定量參考品1-4、陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果；
[0066] 圖3為AML1-ET0基因的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0067] 圖4為8份白血病患者的樣本的檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0068] 為讓本領(lǐng)域的技術(shù)人員更加清晰直觀的了解本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明 作進(jìn)一步的說明。
[0069] 實(shí)施例1
[0070] 一種Real-Time qPCR檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒，包括：（a) RNA 提取試劑、AML1-ET0反應(yīng)液、ABL反應(yīng)液、一步法PCR酶系、AML1-ET0陽性定量參考品1-5、 ABL陽性定量參考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包裝上述試劑的試劑管的包裝盒；
[0071] 所述的RNA提取試劑包括5X的紅細(xì)胞裂解液、RNA提取液-Trizol試劑、氯仿、 異丙醇和DEPC乙醇；
[0072] 所述的AML1-ET0反應(yīng)液包括正向引物、反向引物、AML1-ET0的寡核苷酸探針、PCR 反應(yīng)緩沖液，其中AML1-ET0反應(yīng)液中正向和反向引物分別是：
[0073] 5, -GGATGGGCCCCGAGAAC-3，（SEQ ID N0:1);
[0074] 5' -GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3'（SEQ ID N0:2);
[0075] AML1-ET0 的寡核苷酸探針是：5'-X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3'（SEQ ID NO:3)，其中X表示的是熒光報(bào)告基團(tuán)，Y表示的是熒光淬滅基團(tuán)；
[0076] 所述的ABL反應(yīng)液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探針、PCR反應(yīng)緩沖 液，其中ABL反應(yīng)液中正向和反向引物分別是：
[0077] 5'-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3'（SEQ ID N0:4)
[0078] 5,-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3，（SEQ ID N0:5)
[0079] ABL 的寡核苷酸探針是：5'-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3'（SEQ ID N0:6)， 其中X表不的是突光報(bào)告基團(tuán)，Y表不的是突光淬滅基團(tuán)；
[0080] 所述的AML1-ET0陽性定量參考品1-5為均含有濃度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 107 拷貝/5 μ L的AML1-ET0目的片段的重組質(zhì)粒；所述的ABL陽性定量參考品1-4為均含有濃 度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 106拷貝/5 μ L的ABL目的片段的重組質(zhì)粒。
[0081] 所述的AML1-ET0反應(yīng)液和ABL反應(yīng)液中的PCR緩沖液包含10mmol/L的Tris-HCl 緩沖液、50mmol/L的KC1溶液和3. Ommol/L的MgCl2溶液。
[0082] 一步法PCR酶系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動Taq酶、RNA酶抑制劑、dNTPs以及酶稀釋 液，逆轉(zhuǎn)錄酶的用量為1. 5?3. 5U/人份、熱啟動Taq酶的用量為3?7U/人份、RNA酶抑制 劑的用量為15?25U/人份、dNTPs濃度為0. 20mmol/L、酶稀釋液為一般市售的酶稀釋液。
[0083] 所述的AML1-ET0反應(yīng)液中引物和探針?biāo)玫臐舛染鶠??lOpmol/人份，優(yōu)選引 物濃度為5pmol/人份、探針濃度為3pmol/人份。
[0084] 所述的ABL反應(yīng)液中引物和探針?biāo)玫臐舛染鶠??lOpmol/人份，優(yōu)選引物濃 度為5pmol/人份、探針濃度為3pmol/人份；所述試劑盒的待檢樣本是外周血或骨髓。
[0085] 實(shí)施例2
[0086] 一種檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：
[0087] (1)標(biāo)本采集
[0088] 標(biāo)本采集：抽取受檢者靜脈血或骨髓3?5ml，注入含乙二胺四乙酸二鈉或枸櫞酸 鈉抗凝劑的采血管，立即輕緩顛倒采血管混合5?10次，使抗凝劑與靜脈血或骨髓充分混 勻，密閉待用；標(biāo)本立即用于測試，如不能立即進(jìn)行測試，標(biāo)本在2?8°C條件下保存不應(yīng)超 過48小時(shí)；或者保存在-20±5°C待測，保存期為1個(gè)月；或者使用紅細(xì)胞裂解液處理全血 或骨髓，獲得有核細(xì)胞沉淀后加入lml RNA提取液，振蕩混勻，于-70±10°C保存1個(gè)月；避 免反復(fù)凍融；標(biāo)本的運(yùn)輸條件為〇°C左右；
[0089] (2)核酸提取
[0090] (a)將5 X濃度的紅細(xì)胞裂解液稀釋得到1 X的紅細(xì)胞裂解液待用；(b)取5mL潔 凈離心管加入抗凝血2mL;(c)向離心管中加入2mL IX的紅細(xì)胞裂解液，蓋緊管蓋，漩渦振 蕩15s以充分混勻，室溫放置3min ; (d)室溫下6000rpm離心5min，去上清，保留沉淀；（e) 重復(fù)步驟（c)和（d)，盡可能吸除殘存液體；（f)向離心管中加入lmL RNA提取液，蓋緊管 蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，再將其轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管并靜置5min ; (g)繼續(xù)向離心管 中加入200 μ L氯仿，蓋緊管蓋，用力上下振搖15s (小心液體泄漏，有腐蝕性），15?30°C 靜置3min，4°C條件下12000rpm離心15min，離心后得到酚-氯仿下層、中間層及無色水相 上層；(h)小心吸取400 μ L上層水相轉(zhuǎn)移到另一潔凈離心管中，加入500 μ L異丙醇，蓋緊 管蓋，上下顛倒3次，15-30°C條件下靜置10min，然后4°C條件下12000rpm離心10min (注 意固定離心管方向），離心前通?？床灰奟NA沉淀，離心后可見白色膠狀RNA沉淀，去上清； (i)加入向離心管中加入lmL 75%的DEPC乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，4°C條件下12000rpm 離心5min (注意固定離心管方向），小心吸去大部分DEPC乙醇，短暫離心，再吸去剩余DEPC 乙醇，打開離心管蓋將沉淀在室溫空氣中干燥5min以使痕量乙醇揮發(fā)；（j)用50 μ L DEPC 水溶解沉淀，室溫靜置2min，RNA溶液可立即進(jìn)行PCR或存于-70± 10°C備用；
[0091] (3)PCR 檢測
[0092] (a)配置體系
[0093] AML1-ET0反應(yīng)體系：將3 μ L反應(yīng)酶系和17 μ L AML1-ET0反應(yīng)液充分混合，然后 分裝20 μ L至若干PCR反應(yīng)管；
[0094] ABL反應(yīng)體系：將3 μ L反應(yīng)酶系和17 μ L ABL反應(yīng)液充分混合，然后分裝20 μ L至 若干PCR反應(yīng)管；
[0095] (b)加樣、擴(kuò)增
[0096] 往上述裝有AML1-ET0反應(yīng)體系的不同的反應(yīng)管中分別加入提取后的待測核酸 5 μ L、陰性對照品-DEPC水5 μ L和AML1-ET0陽性定量參考品5 μ L，往上述裝有ABL反應(yīng)體 系的不同的反應(yīng)管中分別加入提取后的待測核酸5 μ L、陰性對照品-DEPC水5 μ L和ABL陽 性定量參考品5 μ L，各自蓋緊反應(yīng)管蓋，SOOOrpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增完成后收集熒光信號，并保存檢測數(shù)據(jù)文件；
[0097] 擴(kuò)增時(shí)ABI7300/7500熒光PCR擴(kuò)增儀參數(shù)設(shè)置如下：
[0098] Reporter Dyel ：FAM
[0099] Quencher Dye ：none
[0100] Passive Reference ：none
[0101] LightCycler480熒光PCR擴(kuò)增儀的參數(shù)設(shè)置如下：
[0102] "Customizes"模塊中選擇 FAM(483-533)濾片；
[0103] 擴(kuò)增的溫度參數(shù)統(tǒng)一設(shè)置如下：擴(kuò)增的反應(yīng)溫度和時(shí)間為：50°C 15min -個(gè)循環(huán)， 95°C 15min -個(gè)循環(huán)；94°C 15s，55°C 45s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熒光檢測選擇在55°C 45s這一環(huán) 節(jié)。
[0104] (C)結(jié)果分析
[0105] 按對應(yīng)順序設(shè)置AML1-ET0的5個(gè)陽性定量參考品，Task中設(shè)為Standard， Quantity中設(shè)為對應(yīng)的拷貝數(shù)，然后根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以 及Threshold值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，start值可以在1?10、stop值可以在 5?20、Threshold值可以在5K?50K范圍選擇），使"Standard curve"窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖達(dá)到最佳，即R2值（correlation數(shù)值）彡0· 97,最后到"Report"窗口下記錄儀器自 動分析計(jì)算出的AML1-ET0未知標(biāo)本的拷貝數(shù)（AML1-ET0-Qty)，將該結(jié)果導(dǎo)出，然后重新按 對應(yīng)順序設(shè)置ABL的4個(gè)陽性定量參考品，步驟同前，將ABL未知標(biāo)本的拷貝數(shù)（ABL-Qty) 導(dǎo)出；
[0106] (4)結(jié)果判定
[0107] 如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則判所檢測的基因表達(dá)量小于檢測限 度；
[0108] 如果增長曲線呈S型曲線且ABL的Ct值< 35,則樣品的AML1-ET0/ABL表達(dá)量為 AML1-ΕΤΟ-Qty/ABL-Qty 〇
[0109] 融合基因 AML1-ET0試劑盒中陽性定量參考品及陰性質(zhì)控品包括AML1-ET0陽性定 量參考品1-5, ABL陽性定量參考品1-4和陰性質(zhì)控品，用于質(zhì)量控制。
[0110] 以下要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行：
[0111] 陰性質(zhì)控品：AML1-ET0及ABL無熒光信號增長，無明顯S型擴(kuò)增曲線。
[0112] 陽性定量參考品：AML1-ET0及ABL有熒光信號增長，曲線呈S型曲線，Ct值< 37， 且 R2 >0. 97。
[0113] 未知標(biāo)本的ABL的Ct值必須< 35。
[0114] 檢測結(jié)果：
[0115] 如圖1所示，AML1-ET0陽性定量參考品1-5有熒光信號增長，曲線成S型曲線，Ct 值< 37,且R2彡0. 97 ;可明確判定為陽性，陰性質(zhì)控品的AML1-ET0無熒光信號增長，無明 顯S型擴(kuò)增曲線，可明確判定為陰性，檢測結(jié)果均符合質(zhì)量控制判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0116] 如圖2所示，ABL陽性定量參考品1-4有熒光信號增長，曲線成S型曲線，Ct值 < 37,且R2 > 0. 97 ;可明確判定為陽性，陰性質(zhì)控品的ABL無熒光信號增長，無明顯S型擴(kuò) 增曲線，可明確判定為陰性，檢測結(jié)果均符合質(zhì)量控制判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0117] 即從圖1和圖2可知：陰性質(zhì)控品的AML1-ET0及ABL均無熒光信號增長； AML1-ET0陽性定量參考品1-5 FAM檢測通路有熒光信號增長，曲線呈S型曲線，Ct值< 37， 且R2彡0. 97 ;ABL陽性定量參考品1-4 FAM檢測通路有熒光信號增長，曲線呈S型曲線，Ct 值< 37,且R2 > 0.97 ;結(jié)果顯示均符合試劑盒的質(zhì)控要求，即本發(fā)明的試劑盒對待檢標(biāo)本 的檢測結(jié)果是有效的。
[0118] 另外如圖3所示，為AML1-ET0基因的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；針對8例包括再生障礙性 貧血、巨幼細(xì)胞遺傳性貧血等其他非白血病患者樣品進(jìn)行Real-Time qPCR檢測分析，檢測 結(jié)果顯示熒光擴(kuò)增曲線無明顯指數(shù)增長，均可明確判定為陰性。
[0119] 如圖4所示，為8份白血病患者的樣本的檢測結(jié)果；8個(gè)樣品的Ct值分別是25. 52、 26. 19、26. 60、31. 61、30. 71、30. 19、30. 90、30. 14,結(jié)合擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，均能夠 判定為陽性。
[0120] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測融合基因 AML1-ET0 mRNA表達(dá)的試劑盒，其特征在于包括：(a) RNA提取試 齊[J、AML1-ET0反應(yīng)液、ABL反應(yīng)液、一步法PCR酶系、AML1-ET0陽性定量參考品1-5、ABL陽 性定量參考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包裝上述試劑的試劑管的包裝盒； 所述的RNA提取試劑包括5X的紅細(xì)胞裂解液、RNA提取液-Trizol試劑、氯仿、異丙 醇和DEPC乙醇； 所述的AML1-ET0反應(yīng)液包括正向引物、反向引物、AML1-ET0的寡核苷酸探針、PCR反應(yīng) 緩沖液，其中AML1-ET0反應(yīng)液中正向和反向引物分別是： 5' -GGATGGGCCCCGAGAAC-3'（SEQ ID N0:1); 5' -GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3' （SEQ ID N0:2); AML1-ET0 的寡核苷酸探針是：5' -X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3'（SEQ ID NO:3)，其中X表示的是熒光報(bào)告基團(tuán)，Y表示的是熒光淬滅基團(tuán)； 所述的ABL反應(yīng)液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探針、PCR反應(yīng)緩沖液，其 中ABL反應(yīng)液中正向和反向引物分別是： 5' -GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3' （SEQ ID N0:4) 5' -TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3' （SEQ ID N0:5) ABL的寡核苷酸探針是：5'-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3'（SEQIDN0:6)，其中 X表不的是突光報(bào)告基團(tuán)，Y表不的是突光淬滅基團(tuán)； 所述的AML1-ET0陽性定量參考品1-5為均含有濃度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 107拷 貝/5 μ L·的AML1-ET0目的片段的重組質(zhì)粒；所述的ABL·陽性定量參考品1-4為均含有濃度 為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 106拷貝/5 μ L的ABL目的片段的重組質(zhì)粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的AML1-ET0反應(yīng)液和ABL反應(yīng)液 中的PCR緩沖液包含10mmol/L的Tris-HCl緩沖液、50mmol/L的KC1溶液和3. Ommol/L的 MgCl2溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述一步法PCR酶系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱 啟動Taq酶、RNA酶抑制劑、dNTPs以及酶稀釋液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的AML1-ET0反應(yīng)液中引物和探針 所用的濃度均為2?lOpmol/人份。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的ABL反應(yīng)液中引物和探針?biāo)?的濃度均為2?lOpmol/人份。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒的待檢樣本是外周血或骨 髓。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6任一項(xiàng)所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 標(biāo)本米集 標(biāo)本采集：抽取受檢者靜脈血或骨髓3?5ml，注入含乙二胺四乙酸二鈉或枸櫞酸鈉抗 凝劑的采血管，立即輕緩顛倒采血管混合5?10次，使抗凝劑與靜脈血或骨髓充分混勻，密 閉待用； (2) 核酸提取 (a)先將5 X的紅細(xì)胞裂解液用無菌純化水稀釋得到IX的紅細(xì)胞裂解液；(b)取5mL 潔凈離心管加入抗凝血2mL;(c)向離心管中加入2mL IX的紅細(xì)胞裂解液，蓋緊管蓋，漩渦 振蕩15s以充分混勻，室溫放置3min ; (d)室溫下6000rpm離心5min，去上清，保留沉淀；（e) 重復(fù)步驟（c)和（d)，盡可能吸除殘存液體；(f)向離心管中加入lmL RNA提取液-Trizol 試劑，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，再將其轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管并靜置5min ; (g)繼 續(xù)向離心管中加入200yL氯仿，蓋緊管蓋，用力上下振搖15s，15?30°C靜置3min，4°C條 件下12000rpm離心15min，離心后得到酚-氯仿下層、中間層及無色水相上層；(h)小心吸 取400 μ L上層水相轉(zhuǎn)移到另一潔凈離心管中，加入500 μ L異丙醇，蓋緊管蓋，上下顛倒3 次，15-30°C條件下靜置lOmin，然后4°C條件下12000rpm離心lOmin離心后可見白色膠狀 RNA沉淀，去上清；（i)加入向離心管中加入lmL 75%的DEPC乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，4°C 條件下12000rpm離心5min，小心吸去大部分DEPC乙醇，短暫離心，再吸去剩余DEPC乙醇， 打開離心管蓋將沉淀在室溫空氣中干燥5min以使痕量乙醇揮發(fā)；（j)用50 μ L DEPC水溶 解沉淀，室溫靜置2min，RNA溶液可立即進(jìn)行PCR或存于-70± 10°C備用； (3) PCR檢測 (a) 配置體系 AML1-ET0反應(yīng)體系：將3 μ L反應(yīng)酶系和17 μ L AML1-ET0反應(yīng)液充分混合，然后分裝 20 μ L至若干PCR反應(yīng)管； ABL反應(yīng)體系：將3 μ L反應(yīng)酶系和17 μ L ABL反應(yīng)液充分混合，然后分裝20 μ L至若 干PCR反應(yīng)管； (b) 加樣、擴(kuò)增 往上述裝有AML1-ET0反應(yīng)體系的不同的反應(yīng)管中分別加入提取后的待測核酸5 μ L、 陰性對照品-DEPC水5 μ L和AML1-ET0陽性定量參考品5 μ L，往上述裝有ABL反應(yīng)體系的 不同的反應(yīng)管中分別加入提取后的待測核酸5 μ L、陰性對照品-DEPC水5 μ L和ABL陽性定 量參考品5 μ L，各自蓋緊反應(yīng)管蓋，SOOOrpm離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增 完成后收集熒光信號，并保存檢測數(shù)據(jù)文件； (c) 結(jié)果分析 按對應(yīng)順序設(shè)置AML1-ET0的5個(gè)陽性定量參考品，Task中設(shè)為Standard，Quantity中 設(shè)為對應(yīng)的拷貝數(shù)，然后根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold 值，使"Standard curve"窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳，即R2值彡0.97,最后到"Import" 窗口下記錄儀器自動分析計(jì)算出的AML1-ET0未知標(biāo)本的拷貝數(shù)，將該結(jié)果導(dǎo)出，然后重新 按對應(yīng)順序設(shè)置ABL的4個(gè)陽性定量參考品，步驟同前，將ABL未知標(biāo)本的拷貝數(shù)導(dǎo)出； (4) 結(jié)果判定 如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則判所檢測的基因表達(dá)量小于檢測限度； 如果增長曲線呈S型曲線且ABL的Ct值< 35，則樣品的AML1-ET0/ABL表達(dá)量為 AMLl-ETO-Qty/ABL-Qty。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述的AML1-ET0陽性定量 參考品1-5為均含有濃度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 107拷貝/5 μ L的AML1-ET0目的片段 的重組質(zhì)粒；所述的ABL陽性定量參考品1-4為均含有濃度為1 X 103拷貝/5 μ L?1 X 106 拷貝/5 μ L的ABL目的片段的重組質(zhì)粒。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述標(biāo)本在2?8°C條件下 保存不應(yīng)超過48小時(shí)；或者保存在-20±5°C待測，保存期為1個(gè)月；或者使用紅細(xì)胞裂解 液處理全血或骨髓，獲得有核細(xì)胞沉淀后加入lml RNA提取液，振蕩混勻，于-70± 10°C保 存1個(gè)月；避免反復(fù)凍融。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)溫度 和時(shí)間為：50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，l個(gè)循環(huán)；95°C 15min，l個(gè)循環(huán)；最后94°C 15s，55°C 45s，40 個(gè)循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195255SQ201410455526
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】徐偉杰 申請人:廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司