檢測(cè)小分子配體靶蛋白用rca產(chǎn)物及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物及其檢測(cè)方法。該RCA產(chǎn)物以小分子修飾的寡聚核苷酸鏈作為探針分子，該核酸探針分子的序列為5’-AAATTGAGCTGCAGAATGGGATCGGTACACTGCG-NH-folate-3’。利用了小分子與靶蛋白的高親和性高特異性結(jié)合產(chǎn)生的末端保護(hù)效果，保證了檢測(cè)的高度特異性，同時(shí)借助級(jí)聯(lián)信號(hào)放大技術(shù)，提高了檢測(cè)的靈敏性。通過紫外-可見光譜技術(shù)捕捉G-催化產(chǎn)生的顏色變化，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、快速、無需信號(hào)標(biāo)記；靈敏度高，可以在1ng/mL到500ng/mL范圍內(nèi)線性檢測(cè)葉酸受體蛋白，檢測(cè)限為0.46ng/mL；特異性強(qiáng)，可以有效地區(qū)分靶蛋白與其他對(duì)照蛋白。
【專利說明】檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物及其檢測(cè)方法。
發(fā)明背景
蛋白質(zhì)與小分子配體的相互作用，因其在化學(xué)、生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的廣泛需要和重要作用，已成為科研工作者共同關(guān)注的焦點(diǎn)。研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用不僅有助于揭示小分子物質(zhì)的作用機(jī)理并改善相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，而且對(duì)藥物代謝、藥物開發(fā)以及臨床藥理研究等具有重要的意義。
[0002]近年來，基于末端保護(hù)原理以小分子修飾的寡聚核酸作為探針分子研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)分析方法開始引起了廣泛的關(guān)注。由于小分子與靶蛋白之間的高度親和性和特異性的相互作用關(guān)系，靶蛋白分子可以固定在核酸探針分子的末端造成明顯的位阻作用從而阻礙核酸外切酶對(duì)核酸探針的消化作用，達(dá)到末端保護(hù)的效果。同時(shí)，寡聚核苷酸不可以結(jié)合信號(hào)放大技術(shù)促進(jìn)檢測(cè)靈敏性的提升，實(shí)現(xiàn)高靈敏高特異性檢測(cè)的目的。滾環(huán)核酸擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplificat1n,RCA)是近年來發(fā)展迅速且備受矚目的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，不僅可以直接擴(kuò)增DNA和RNA，還可以有效實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的信號(hào)放大；DNAZyme是具有催化活性的寡聚核酸分子，通過酶催化產(chǎn)生的信號(hào)放大效果，同樣可以達(dá)到提升生物分析靈敏性的目的。因此，利用RCA合成具有一系列DNAzyme序列的長(zhǎng)鏈核酸，并催化底物產(chǎn)生信號(hào)，可以產(chǎn)生級(jí)聯(lián)信號(hào)放大的效果，有效保障了高度靈敏檢測(cè)分析的需要。本發(fā)明巧妙地將末端保護(hù)原理和級(jí)聯(lián)信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合，利用紫外-可見分光光技術(shù)作為檢測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子與蛋白質(zhì)相互作用高靈敏高特異性分析檢測(cè)的目的。
[0003]目前，研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)技術(shù)主要有質(zhì)譜、親和層析、動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和酶互補(bǔ)片段免疫分析等。但是這些檢測(cè)技術(shù)有的需要昂貴的儀器，操作復(fù)雜，有的耗時(shí)費(fèi)力，靈敏度低，均難以滿足日?？焖俜治龅囊蟆Ｗ贤?可見分光光譜法由于其測(cè)量范圍廣、應(yīng)用領(lǐng)域?qū)?、操作?jiǎn)便快速且儀器成本相對(duì)較低的優(yōu)勢(shì)，成為了蛋白質(zhì)與小分子相互作用研究中具有重要地位的分析技術(shù)之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物。
[0005]本發(fā)明的目的之二在于提供用該RCA產(chǎn)物的檢測(cè)小分子配體靶蛋白的方法。
[0006]本發(fā)明第一次用紫外-可見光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)與小分子配體相互作用的特異性和靈敏性的檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的機(jī)理如下:選用葉酸作為代表性的小分子，以葉酸修飾的寡核酸鏈作為檢測(cè)的探針鏈。Exo I ( Exonuclease I)是一種沿3’到5’方向定向水解單鏈DNA的酶，修飾了小分子的單鏈DNA可以被Exo I從3’末端逐步水解。當(dāng)靶蛋白葉酸受體存在的條件下，葉酸受體蛋白與核酸探針末端的葉酸小分子結(jié)合產(chǎn)生明顯的位阻效應(yīng)，從而產(chǎn)生末端保護(hù)效果，阻礙了 Exo I從3’末端對(duì)核酸探針的水解消化。在切刻內(nèi)切酶存在的條件下，核酸探針分子末端結(jié)合的葉酸受體隨著多余核酸序列的切除，末端保護(hù)作用消除。去保護(hù)的核酸探針鏈中含有兩段序列分別與成環(huán)核酸鏈的3’和5’末端序列互補(bǔ)，因此，以探針鏈作為雜交模板通過DNA連接酶將成環(huán)核酸鏈的3’和5’末端連接起來形成了環(huán)狀DNA。在DNA聚合酶催化作用下，以探針DNA作為引物，以環(huán)狀DNA作為模板發(fā)生滾環(huán)核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生一條具有一系列重復(fù)的特定DNAzyme序列的長(zhǎng)鏈DNA產(chǎn)物。在血紅素(hemin)存在的條件下,RCA產(chǎn)物中的DNAzyme序列均會(huì)和hemin結(jié)合形成hemin/G-四聚體復(fù)合物，該復(fù)合物具有類似過氧化氫酶的作用，可以在過氧化氫存在的條件下，催化ABTS2_氧化為ABTS__。紫外-可見光譜技術(shù)對(duì)催化過程中產(chǎn)生的顏色變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子配體和蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)。與之相對(duì)應(yīng)的，當(dāng)體系中不存在靶蛋白的時(shí)候，缺乏保護(hù)的核酸探針被Exo I水解為單核苷酸片段，所以隨后的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大反應(yīng)由于缺少環(huán)狀鏈合成的模板以及引物被終止，無法產(chǎn)生比色法檢測(cè)的信號(hào)。因此,在這個(gè)檢測(cè)體系中，結(jié)合配體與受體的特異性以及DNA滾環(huán)擴(kuò)增和DNAzyme催化結(jié)合的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大的高靈敏度的特點(diǎn)，高靈敏高特異性分析小分子與蛋白質(zhì)相互作用成為可倉泛。
[0007]根據(jù)上述機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物，其特征在于RCA產(chǎn)物采用如下方法制備得到:
a.將小分子配體標(biāo)記的探針probe與待測(cè)樣品混合于IXNEBuffer2反應(yīng)緩沖液中，室溫下培育0.5?1.5小時(shí)；其中小分子配體標(biāo)記的探針probe的濃度為10 μΜ,待測(cè)樣品的濃度為:1 ng/mL?500 ng/mL ;所述的探針probe的序列為:
5’ -AAATTGAGCTGCAGAATGGGATCGGTACACTGCG-NH-folate-3’ ；
所述的反應(yīng)緩沖液為 10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，10 mM MgCl2 ；
b.在步驟a所配制的溶液中加入ExoI原液至濃度為15U/mL，37° C條件下培育0.5h后，升溫至80° C反應(yīng)20 min以終止酶切反應(yīng)，冷卻到室溫；
c.在步驟b所得溶液中，加入切克鏈和切刻內(nèi)切酶NB.BtsI至濃度分別為10 μΜ和5 U/mL,所述的切克鏈的序列為:5’ -CGCAGTGTACCGA-3’，在37° C條件下培育0.5 h后升溫至80° C熱失活20 min以終止切刻內(nèi)切酶的反應(yīng)，自然冷卻到室溫；
d.在步驟c所得溶液加入滾環(huán)鏈至濃度為10μΜ，加入T4 DNA Iigase至濃度為100U/mL和ATP至濃度為mM;所述的滾環(huán)鏈的序列為:
5’ -P-TCTGCAGCTCAATTCCCCACCCTCCCCACCCTCATTTTTTCCCCACCCTCCCCACCCTCATACCGATCCCAT-3’ ；16° C孵育0.5 h，升溫至65° C熱失活20 min，使連接酶失活；
e.在步驟d所得溶液中加入dNTPs至濃度為400μΜ，加入BSA至濃度為50(^g/mL和phi29DNA聚合酶至濃度為8U/mL，在37° C下聚合反應(yīng)0.5h，然后將反應(yīng)后的溶液升溫至80° C熱失活20 min,終止反應(yīng)得到檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物。
[0008]上述的小分子為葉酸。
[0009]一種檢測(cè)小分子配體靶蛋白的方法，采用上述的檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.將RCA擴(kuò)增產(chǎn)物與2 X 40 KT緩沖液按1: f 1: 1.5的體積比混合成混合液，再加入hemin至濃度為5 μΜ，在室溫下孵育I h ;所述的緩沖液為:100 mM MES, 200 mM Tris,80mM KCl ,0.1% Triton X-100 ,2% DMSO, pH 6.2 ； b.在步驟a所得混合液中加入50 mM ABTS2IK溶液和I mM H2O2水溶液，并立即對(duì)混合液在414nm波長(zhǎng)處，進(jìn)行總時(shí)間為300s的紫外動(dòng)力學(xué)檢測(cè)；所述的混合液、ABTS2_水溶液和H2O2水溶液的體積比為:48:1: Γ45:2:20
[0010]本發(fā)明利用小分子和蛋白質(zhì)高特異高親和性結(jié)合產(chǎn)生的末端保護(hù)效果，借助結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增以及DNAzyme催化產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大技術(shù)的高度靈敏性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子和蛋白質(zhì)相互作用非常靈敏的檢測(cè)。本發(fā)明以葉酸作為代表研究了其與葉酸受體蛋白之間的相互作用，理論上可以推廣對(duì)其他類型的小分子與靶蛋白相互作用進(jìn)行檢測(cè)。由于葉酸受體蛋白本身是一種腫瘤標(biāo)志物，該方法還可以用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，對(duì)腫瘤的臨床監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明的方法原理圖。
[0012]圖2為在有無葉酸受體蛋白存在的情況下，修飾有葉酸分子的核苷酸鏈經(jīng)核酸外切酶I切割以及RCA反應(yīng)之后，在414nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生的吸光值隨時(shí)間變化圖。內(nèi)嵌圖為有無葉酸受體蛋白存在條件下經(jīng)核酸外切酶I和RCA反應(yīng)后的瓊脂糖電泳圖。
[0013]圖3為不同濃度的葉酸受體蛋白存在情況下，修飾有葉酸分子的核苷酸鏈經(jīng)核酸外切酶I切割以及RCA反應(yīng)之后，催化ABTS2_氧化在414nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生的吸光值隨時(shí)間變化圖。
[0014]圖4為葉酸受體蛋白濃度和吸光度變化值(ΛΑ)之間的關(guān)系圖。其中內(nèi)嵌圖為蛋白質(zhì)濃度在I ng/mL到100 ng/mL范圍內(nèi)與吸光度變化值之間的線性關(guān)系圖。
[0015]圖5為不同種類的蛋白與葉酸修飾探針結(jié)合條件下獲得的在414nm波長(zhǎng)處吸光值隨時(shí)間變化圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例一:葉酸-葉酸受體相互作用檢測(cè)的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大反應(yīng)流程
步驟一，在 lXNEBuffer2 反應(yīng)緩沖液中(1mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 10 mM MgCl2)力口A 100 nM 葉酸標(biāo)記的探針 probe 與 500 ng/mL、300 ng/mL、100 ng/mL、80 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL>5 ng/mL、l ng/mL、0.46ng/mL和0 ng/mL的待測(cè)葉酸結(jié)合蛋白樣品，室溫下培育Ih ；
步驟二，然后在上一步的溶液中加入0.3 U/μ? Exo I原液，37° C下培育0.5 h后，升溫至80° C熱失活20 min以終止酶切反應(yīng)；
步驟三，等溶液冷卻到室溫后再加入100 nM N-DNA鏈，0.02 U/μ? NB.BtsI, 37° C下培育0.5 h，將反應(yīng)后的溶液升溫至80° C熱失活20 min以終止切刻酶的反應(yīng)；
步驟四，等溶液冷卻到室溫后再加入100 nM的Cir-DNA鏈，2 U/μ? T4 DNA Iigase和
ImM ATP, 16° C孵育30 min，升溫至65° C熱失活20 min，使連接酶失活；
步驟五,在上述溶液中加入400μΜ dNTPs, 500μδ/ mL BSA和(λ 2 υ/μ? phi29DNA聚合酶使體系的終體積為50ul。反應(yīng)體系在37° C下聚合反應(yīng)0.5h，然后將反應(yīng)后的溶液升溫至80° C熱失活20 min，終止反應(yīng)，得到RCA的產(chǎn)物。
[0017]如圖1所示當(dāng)目標(biāo)蛋白不存在時(shí)，葉酸標(biāo)記的核酸探針鏈被Exo I水解成單核苷酸，滾環(huán)擴(kuò)增在無模板存在下無法發(fā)生，因而無法合成能夠形成G-四鏈體的長(zhǎng)鏈并實(shí)現(xiàn)比色法的檢測(cè)。當(dāng)葉酸結(jié)合蛋白存在時(shí)，葉酸標(biāo)記的探針鏈與葉酸受體高度親和性特異性結(jié)合，從而保護(hù)探針鏈不被Exo I水解。通過切刻內(nèi)切酶切割去保護(hù)之后，成環(huán)鏈以去保護(hù)的探針鏈作為雜交模板連接成環(huán)，并以其為引物，在加入dNTPs和phi29 DNA聚合酶的條件下，引發(fā)RCA反應(yīng)，生成大量與環(huán)形DNA模板互補(bǔ)的重復(fù)的DNAzyme堿基序列。
[0018]實(shí)施例二:紫外-可見吸收光譜分析葉酸-葉酸受體相互作用
步驟一，將擴(kuò)增產(chǎn)物與 2X40 KT 緩沖液(10mM MES , 200mM Tris, 80mM KCl , 0.1%Triton X-100，2% DMS0，pH 6.2 )按1:1比例混合，在該體系中加入100 nM hemin溶液，在室溫下孵育I h ；
步驟二，在上述反應(yīng)液中加入0.5 mM ABTS2_溶液和ImM H2O2溶液，并立即對(duì)混合液在414nm波長(zhǎng)處，300s內(nèi)進(jìn)行紫外動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。
[0019]根據(jù)圖1所示，我們的設(shè)計(jì)延伸出來的長(zhǎng)鏈含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNAzyme，在鉀離子和hemin存在的條件下自發(fā)形成多個(gè)G-四鏈體-hemin復(fù)合物。該復(fù)合物具有類似過氧化氫酶的活性，可以在過氧化氫存在條件下，催化ABTS2_氧化，產(chǎn)生顏色變化。如圖2所示，當(dāng)有500 ng/mL葉酸受體蛋白存在時(shí)，由于核酸探針末端因?yàn)榻Y(jié)合被保護(hù)不被Eox I消化，經(jīng)RCA反應(yīng)產(chǎn)生重復(fù)的DNAzyme，可以催化ABTS2_氧化產(chǎn)生顏色變化，因此吸光值隨著時(shí)間變化有明顯的上升趨勢(shì)，這與未經(jīng)Eox I處理的核酸探針擴(kuò)增后的結(jié)果相類似，很好證明了葉酸-葉酸受體相互作用對(duì)核酸探針鏈的末端保護(hù)作用。與之相對(duì)應(yīng)的，在沒有葉酸受體蛋白存在時(shí)，由于核酸探針鏈被Exo I水解無法發(fā)生后續(xù)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，吸光值并沒有隨著時(shí)間推移產(chǎn)生明顯變化。
[0020]實(shí)施例三:瓊脂糖凝膠電泳分析葉酸-葉酸受體相互作用
步驟一，用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子；
步驟二，取IXTAE電泳緩沖液10mL于三角燒瓶中，稱取I g瓊脂糖粉放入后在微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻至約60°C，倒入電泳槽中。待瓊脂糖凝膠凝固后向電泳槽中倒入IXTAE溶液，其量以沒過膠面2 mm為宜，小心移去梳子；
步驟三，在實(shí)例I步驟五得到的RCA的樣品溶液中加入0.2體積的上樣緩沖液，混勻后加入樣品孔內(nèi)。接上電極，以5 V/cm的電壓進(jìn)行電泳。當(dāng)指示染料遷移至所需位置時(shí)，切斷電源，取出凝膠；
步驟四，在SYBR Green I核酸染料中染色30 min，最后用B1rad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。
[0021]如圖2的內(nèi)前圖所示，存在500 ng/mL葉酸受體蛋白以及核酸探針未被Eox I處理的條件下，均可以得到明顯的擴(kuò)增條帶，而無葉酸受體蛋白存在條件下，經(jīng)過Eox I處理處理后幾乎不能看見擴(kuò)增條帶。該結(jié)果很好驗(yàn)證了末端保護(hù)效果以及RCA的核酸擴(kuò)增效果，并再次驗(yàn)證了此發(fā)明的實(shí)施機(jī)理。
[0022]實(shí)施例四:不同濃度葉酸受體蛋白的檢測(cè)
將葉酸修飾的核酸探針與不同濃度的葉酸受體蛋白(500 ng/mL、300 ng/mL、100 ng/mL、80 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL>5 ng/mL 以及 I ng/mL)反應(yīng)，經(jīng)過 Exo I 處理以及級(jí)聯(lián)信號(hào)放大反應(yīng)，用紫外-可見分光光譜法檢測(cè)。
[0023]如圖3所示，反應(yīng)產(chǎn)物溶液在414 nm波長(zhǎng)處的吸光值隨時(shí)間的推移不斷增加，同時(shí)隨葉酸受體蛋白的濃度升高而增加幅度提升。圖4為300s時(shí)獲得的吸光度增加值與葉酸受體蛋白濃度之間的關(guān)系圖。圖4插圖表示在I ng/mL到100 ng/mL的葉酸受體蛋白濃度范圍內(nèi)，吸光度增加值與蛋白濃度成線性關(guān)系。根據(jù)3倍信噪比可得該方法的葉酸受體蛋白的檢測(cè)限為0.46ng/mL。
[0024]實(shí)施例五:生物傳感器特異性研究
為了驗(yàn)證本發(fā)明檢測(cè)葉酸結(jié)合蛋白的特異性，我們用了不同的蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)按照實(shí)施例一的操作過程處理來驗(yàn)證該生物傳感器的特異性。如圖5所示，即使BSA和OVA蛋白的濃度(I mg/mL)是目標(biāo)蛋白濃度的(500 ng/mL)的2000倍，仍然不能引起溶液吸光值明顯的變化。此對(duì)照反應(yīng)說明了葉酸與葉酸受體蛋白結(jié)合引起的末端保護(hù)作用有高度的特異性，保證了生物傳感器檢測(cè)的高度選擇性。
[0025]以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明方法能檢測(cè)到濃度低至0.46ng/mL的葉酸結(jié)合蛋白，實(shí)現(xiàn)了葉酸受體蛋白的靈敏檢測(cè)，并可有效地區(qū)分其他蛋白分子。這種簡(jiǎn)單、便捷、靈敏和高選擇性的檢測(cè)手段，為今后的小分子-蛋白質(zhì)相互作用以及腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)提供了一個(gè)新的思路，也有望在將來應(yīng)用到臨床檢測(cè)中以滿足不同的檢測(cè)需求。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物，其特征在于RCA產(chǎn)物采用如下方法制備得到: 將小分子配體標(biāo)記的探針probe與待測(cè)樣品混合于I XNEBuffer2反應(yīng)緩沖液中，室溫下培育0.5?1.5小時(shí)；其中小分子配體標(biāo)記的探針probe的濃度為10 μΜ，待測(cè)樣品的濃度為:1 ng/mL?500 ng/mL ;所述的探針probe的序列為:
5’ -AAATTGAGCTGCAGAATGGGATCGGTACACTGCG-NH-folate-3’ ； 所述的反應(yīng)緩沖液為 10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，10 mM MgCl2 ； b.在步驟a所配制的溶液中加入ExoI原液至濃度為15U/mL，37° C條件下培育0.5h后，升溫至80° C反應(yīng)20 min以終止酶切反應(yīng)，冷卻到室溫； c.在步驟b所得溶液中，加入切克鏈和切刻內(nèi)切酶NB.BtsI至濃度分別為10 μΜ和5 U/mL,所述的切克鏈的序列為:5’ -CGCAGTGTACCGA-3’，在37° C條件下培育0.5 h后升溫至80° C熱失活20 min以終止切刻內(nèi)切酶的反應(yīng)，自然冷卻到室溫； d.在步驟c所得溶液加入滾環(huán)鏈至濃度為10μΜ，加入T4 DNA Iigase至濃度為100U/mL和ATP至濃度為mM;所述的滾環(huán)鏈的序列為:
5’ -P-TCTGCAGCTCAATTCCCCACCCTCCCCACCCTCATTTTTTCCCCACCCTCCCCACCCTCATACCGATCCCAT-3’ ；16° C孵育0.5 h，升溫至65° C熱失活20 min，使連接酶失活； e.在步驟d所得溶液中加入dNTPs至濃度為400μΜ，加入BSA至濃度為50(^g/mL和phi29DNA聚合酶至濃度為8U/mL，在37° C下聚合反應(yīng)0.5h，然后將反應(yīng)后的溶液升溫至80° C熱失活20 min,終止反應(yīng)得到檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物，其特征在于所述的小分子為葉酸。
3.—種檢測(cè)檢測(cè)小分子配體靶蛋白的方法，采用根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)小分子配體靶蛋白用RCA產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，其特征在于該方法的具體步驟為: a.將RCA擴(kuò)增產(chǎn)物與2 X 40 KT緩沖液按1: f 1: 1.5的體積比混合成混合液，再加入hemin至濃度為5 μ M，在室溫下孵育I h ;所述的緩沖液為:100 mM MES, 200 mM Tris,.80 mM KCl ,0.1% Triton X-100 ,2% DMSO, pH 6.2 ； b.在步驟a所得混合液中加入50 mM ABTS2IK溶液和I mM H2O2水溶液，并立即對(duì)混合液在414nm波長(zhǎng)處，進(jìn)行總時(shí)間為300s的紫外動(dòng)力學(xué)檢測(cè)；所述的混合液、ABTS2_水溶液和H2O2水溶液的體積比為:48:1:1?45:2: 2。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104232618SQ201410460134
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】李根喜, 趙婧, 胡隨隨, 陳稀嫻, 王喬 申請(qǐng)人:上海大學(xué)