一種利用dhplc檢測(cè)豬流感病毒h5亞型的特異性引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物及其應(yīng)用，所述的特異性引物為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增結(jié)合非變性DHPLC分析模式，建立豬流感病毒快速篩選的一種新的方法，可以快速、自動(dòng)化、高通量篩查豬流感病毒，大大提高了檢測(cè)效率，縮短了檢測(cè)時(shí)間，對(duì)預(yù)防和控制豬流感H5亞型的爆發(fā)具有重要的臨床意義。
【專利說明】—種利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬流感，是由正黏病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒(Swine influezavirus, SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的呼吸道傳染病。在免疫選擇壓力下，豬流感病毒血清型眾多，遺傳變異頻繁。根據(jù)血清學(xué)和病原學(xué)的研究報(bào)道表明，世界范圍內(nèi)存在 H1N1、H1N2、H1N7、H3N1、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2 等 9 種亞型，我國(guó)已經(jīng)報(bào)道 H1N1、H1N2、H3N2、H5N1、H6N6和H9N2等亞型，其中H5亞型豬流感的毒力較強(qiáng)，且可能導(dǎo)致高致病力禽流感的流行，成為畜牧業(yè)關(guān)注的主要豬流感亞型。鑒于豬流感病毒的亞型較多，且導(dǎo)致豬呼吸道的病原較多，臨床癥狀難以區(qū)分。因此，建立豬流感H5亞型的快速診斷技術(shù)，是確診病原亞型的有效措施。對(duì)豬流感的診斷方法主要為病毒的分離鑒定，HI試驗(yàn)、ELISA方法等血清學(xué)方法，常規(guī)PCR和定量PCR方法等核酸診斷方法。其中，病毒的分離鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，準(zhǔn)確率低，現(xiàn)在已經(jīng)較少實(shí)用。ELISA等血清學(xué)方法隨著豬流感血清亞型的增多、新舊毒株之間具有一定的交叉反應(yīng)，其應(yīng)用受到一定的限制。常規(guī)PCR和定量PCR方法，敏感特異，但達(dá)不到高通量集成化診斷的要求。因此，需要研究一種能對(duì)豬流感病毒進(jìn)行高通量、快速排查，準(zhǔn)確鑒別的集成化檢測(cè)技術(shù)。
[0003]高效變性液相色譜技術(shù)(Denaturinghigh performance liquidchromatograph, DHPLC)是近年來發(fā)現(xiàn)起來的一種快速、非凝膠的核酸分析方法。其原理為帶有磷酸基團(tuán)的DNA樣品在緩沖液帶動(dòng)形成流動(dòng)相，通過三乙胺乙酸鹽(TEAA)的“橋分子”作用吸附于固定相上的DNASep分離柱。DNA片段越長(zhǎng)，與較多的TEAA結(jié)合使其在色譜柱中滯留時(shí)間越長(zhǎng)。通過增加流動(dòng)相中具有親水性的乙腈濃度，逐漸造成DNA和TEAA的脫離，核酸片段就會(huì)按分子量大小洗脫而分離。一般來說，產(chǎn)物分子相差1%的片段既能夠被分離。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用DHPLC進(jìn)行病原的分型鑒別、遺傳疾病的突變分析、食品微生物檢測(cè)等領(lǐng)域。
[0004]但如何利用高效變性液相色譜技術(shù)檢測(cè)豬流感病毒H5亞型，至今未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物及其應(yīng)用，能夠有效解決準(zhǔn)確、靈敏和高通量的鑒別豬流感病毒H5亞型的問題。
[0006]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，包括以下步驟:
[0007](I)豬流感H5亞型引物的設(shè)計(jì)和合成
[0008]登錄美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心(NCBI)，檢索已公布的豬流感病毒H5亞型基因序列，BLAST比對(duì)后，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物，具體序列如下:上游引物 SEQ ID N0.1 為 5，-AGTGAATTGGCATATGGTAACTG-3’ ；下游引物 SEQ ID N0.2 為5’ -AACTGAGTGTCCATTTTGTCAAT-3’，引物由大連寶生物有限公司合成；
[0009](2)病毒RNA的提取
[0010]參照Takra Minibest Viral RNA/DNA提取試劑盒說明書分別提取豬流感病毒H5N1亞型、HlNl亞型、H3N2亞型，豬瘟病毒，O型口蹄疫病毒，豬病毒性腹瀉病毒，豬繁殖和呼吸綜合征病毒的病毒RNA，取D26toZD28tol比值范圍在1.9~2.1的病毒RNA，_70°C保存?zhèn)溆茫?br> [0011](3) RT-PCR的反應(yīng)體系和條件
[0012]以提取的病毒RNA模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)體系如下，Taq酶(PrimeScript Enzyme) 2 μ I，反應(yīng)緩沖液(buffer) 25 μ I,濃度 20pm/ μ I 的上游引物 I μ I,濃度20pm/μ I的下游引物I μ 1，病毒RNA模板5 μ 1，超純水16 μ I,反應(yīng)條件為:42°C反轉(zhuǎn)錄 30min，95°C 3min, 95°C 30sec,退火溫度 52°C 30sec, 72°C lmin,共 30 個(gè)循環(huán)；
[0013](4) DHPLC方法的分析條件
[0014]DHPLC的分析條件:在非變性分析模式下，采用雙鏈單片段DNA (double strandesingal fragment)分析模式，DNASep柱溫選擇50°C,平衡分離柱至基線穩(wěn)定后開始進(jìn)樣，上樣量:PCR產(chǎn)物5μ 1，洗脫條件為:起始流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液B =69:125, 7分鐘時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液B = 46:125,16.5分鐘終止時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液B = 43:125，流速為:0.9 ml/min ;流動(dòng)相濃度梯度變化由Navigator software分析軟件控制設(shè)定,檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；
[0015]所述的緩沖溶液A為濃度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸鹽(TEAA);三乙胺乙酸鹽(TEAA)購自Transgenomic公司；所述的緩沖溶液B由以體積百分比的乙腈25%和緩沖溶液A75%混合在一起組成，乙腈(色譜純)購自Sigma公司；所述的Takra Minibest ViralRNA/DNA病毒DNA提取試劑盒購自寶生物公司。
[0016]本發(fā)明提出了利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物在制備檢測(cè)豬流感H5亞型病毒試劑盒或試劑中的應(yīng)用，其中，所述的DHPLC方法的分析條件同上。
[0017]本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增結(jié)合非變性DHPLC分析模式，建立豬流感病毒快速篩選的一種新的方法，可以快速、自動(dòng)化、高通量篩查豬流感病毒，大大提高了檢測(cè)效率，縮短了檢測(cè)時(shí)間，對(duì)預(yù)防和控制豬流感H5亞型的爆發(fā)具有重要的臨床意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為豬流感H5亞型DHPLC檢測(cè)方法的特異性結(jié)果。其中，1:SIV H5N1亞型，2:SIV H5亞型質(zhì)粒，3:SIV HlNl亞型，4:SIV H3N2亞型，5:豬瘟病毒，6:0型口蹄疫病毒，7:豬病毒性腹瀉病毒，8:豬繁殖和呼吸綜合征病毒。
[0019]圖2為豬流感H5亞型DHPLC檢測(cè)方法的敏感性結(jié)果。其中，1:106 copies,2:105copies, 3:1O4 copies, 4:1O3 copies, 5:1O2 copies, 6:10 copies, 7:1 copy, 8:陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明，這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0021 ] 實(shí)施例1 (檢測(cè)豬流感H5亞型的DHPLC方法特異性)的步驟如下:
[0022](I) SIV H5亞型的序列分析與豬流感H5亞型引物的設(shè)計(jì)和合成
[0023]在NCBI上查找豬流感病毒H5亞型的HA基因序列(即SIV H5亞型的靶基因序列)，HA基因序列如下:
[0024]Agtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaataggggcgataaactctagtatgccattccacaacatccaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactgggctcagaaatagccctcaaggagagagaagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaacgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattgacaaaatgaacactcagtt
[0025]BLAST分析比較基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物,具體序列如下:上游引物 SEQ ID N0.1 為 5’-AGTGAATTGGCATATGGTAACTG-3’；下游引物 SEQ ID N0.2為 5’ -AACTGAGTGTCCATTTTGTCAAT-3’。
[0026](2)病毒RNA的提取
[0027]含豬流感H 5亞型毒株的尿囊液和SIV豬鼻拭子的樣品，8000r/min離心10分鐘后，取上清，參照Takra Minibest Viral RNA/DNA提取試劑盒說明書提取含豬流感H5亞型毒株的尿囊液和SIV豬鼻拭子的樣品RNA，即從含豬流感H5亞型毒株的尿囊液的樣品中提取的是SIVH5N1亞型的RNA，從SIV豬鼻拭子的樣品中提取的分別是SIV HlNl亞型、SIV H3N2亞型、豬瘟病毒、O型口蹄疫病毒、豬病毒性腹瀉病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒的RNA,對(duì)提取出的樣品RNA用微量核酸蛋白分析儀測(cè)定D26tol和D28tol,計(jì)算RNA濃度，取D26tol/D280nm比值范圍在1.9~2.1的病毒RNA，_70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0028](3) RT-PCR的反應(yīng)體系和條件
[0029]以提取的病毒RNA模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)體系如下，Taq酶(PrimeScript Enzyme) 2 μ I，反應(yīng)緩沖液(buffer) 25 μ I,濃度 20pm/ μ I 的上游引物 I μ I,濃度20pm/μ I的下游引物I μ 1，病毒RNA模板5 μ 1，超純水16 μ I,反應(yīng)條件為:42°C反轉(zhuǎn)錄 30min，95°C 3min, 95°C 30sec,退火溫度 52°C 30sec, 72°C lmin,共 30 個(gè)循環(huán)。
[0030](4) DHPLC方法的分析條件
[0031]DHPLC的分析條件:DNAseq柱,4.6mm X 5.4mm,粒度3μηι,采用雙鏈單片段DNA(double strande singal fragment)分析模式，使用紫外檢測(cè)器，DNASep柱溫選擇50°C，平衡分離柱至基線穩(wěn)定后開始進(jìn)樣，上樣量:PCR產(chǎn)物5μ 1，洗脫條件為:起始流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液B = 69:125，7分鐘時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液B = 46:125,16.5分鐘終止時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液B = 43:125，流速為:0.9ml/min ;流動(dòng)相濃度梯度變化由Navigator software分析軟件控制設(shè)定。
[0032](5)檢測(cè)結(jié)果
[0033]豬流感病毒H5N1亞型出現(xiàn)特征性DHPLC吸收?qǐng)D譜，為陽性結(jié)果，而豬流感病毒HlNl亞型、H3N2亞型、豬瘟病毒，O型口蹄疫病毒、豬病毒性腹瀉病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒為陰性結(jié)果(如圖1)。
[0034]實(shí)施例2 (檢測(cè)豬流感H5亞型的DHPLC方法的靈敏性分析)步驟如下:
[0035](I) SIV-H5亞型重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0036]提取豬流感H5亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株的核酸，參照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的PCR產(chǎn)物，TA克隆于pMD18-T質(zhì)粒，挑選陽性重組體，使用EcoR I和Hind III進(jìn)行單、雙酶切鑒定，并進(jìn)行序列測(cè)定。
[0037](2)靈敏性試驗(yàn)
[0038]用微量核酸蛋白分析儀測(cè)定豬流感病毒H5亞型重組質(zhì)粒濃度，稀釋為16, 15, 14, 13, 12, 10和I個(gè)copies數(shù)核酸，參照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DHPLC檢測(cè)，研究方法的敏感性，結(jié)果表明DHPLC法可以檢測(cè)最低10個(gè)copies核酸。
[0039] 本發(fā)明經(jīng)臨床試驗(yàn)和應(yīng)用，取得了良好的效果，具體如下:使用本發(fā)明的DHPLC方法對(duì)臨床的151份豬鼻拭子皮毛樣品進(jìn)行SIV H5亞型檢測(cè)，同時(shí)使用商品化豬流感H5亞型核酸檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)。結(jié)果，其中32份陽性樣品中DHPLC法和定量PCR試劑盒的檢測(cè)結(jié)果均為陽性，剩余119份結(jié)果均為陰性，兩者的符合率為100%。說明DHPLC可以適用于臨床的大批量SIV H5亞型的診斷，且篩選速度快，縮短了檢測(cè)時(shí)間，對(duì)預(yù)防和控制豬流感H5亞型的爆發(fā)具有重要的臨床意義。
【權(quán)利要求】
1.一種利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物，其特征在于，所述的特異性引物為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物在檢測(cè)豬流感H5亞型病毒中的應(yīng)用，其中，所述的DHPLC的分析條件為=DNAseq柱，4.6mmX 5.4mm，粒度3 μ m,采用雙鏈單片段DNA分析模式，使用紫外檢測(cè)器，DNASep柱溫選擇50°C，平衡分離柱至基線穩(wěn)定后開始進(jìn)樣,上樣量:PCR產(chǎn)物5 μ I，洗脫條件為:起始流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液Β=69:125，7分鐘時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液Β=46:125，16.5分鐘終止時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液Β=43:125，流速為:0.9 ml/min ；流動(dòng)相濃度梯度變化由Navigator software分析軟件控制設(shè)定；所述的緩沖溶液A為濃度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸鹽的緩沖溶液；所述的緩沖溶液B由以體積百分比的乙腈25%和緩沖溶液A75%混合在一起組成。
3.權(quán)利要求1所述的利用DHPLC檢測(cè)豬流感病毒H5亞型的特異性引物在制備檢測(cè)豬流感H5亞型病毒試劑盒或試劑中的應(yīng)用，其中，所述的DHPLC的分析條件為=DNAseq柱，4.6mmX 5.4mm,粒度3 μ m,采用雙鏈單片段DNA分析模式，使用紫外檢測(cè)器，DNASep柱溫選擇50°C，平衡分離柱至基線穩(wěn)定后開始進(jìn)樣，上樣量:PCR產(chǎn)物5μ 1，洗脫條件為:起始流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液Β=69:125，7分鐘時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液Β=46:125，16.5分鐘終止時(shí)流動(dòng)相的體積比為緩沖溶液A:緩沖溶液Β=43:125，流速為:0.9 ml/min ;流動(dòng)相濃度梯度變化由Navigator software分析軟件控制設(shè)定；所述的緩沖溶液A為濃度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸鹽的緩沖溶液；所述的緩沖溶液B由以體積百分比的乙腈25%和緩沖溶液A75%混合在一起組成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104178587SQ201410462170
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】徐超, 袁萍, 張子宏, 楊娜, 李珂, 苗麗 申請(qǐng)人:徐超