用于檢測(cè)假高粱的引物對(duì)、探針、核酸組合物及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)假高粱的核酸引物對(duì)、探針、核酸組合物及檢測(cè)方法。核酸引物對(duì)包括核酸引物F：5’-TGGTGGGCGACACTTAGTTG-3’、核酸引物R：5’-CAACGATGTGCTGCGGTG-3’；核酸分子探針P為5’-FAM-ACGTGGCCGGCGC-TAMRA-3’；核酸組合物由核酸引物F、R和核酸分子探針P組成；本發(fā)明的檢測(cè)假高粱的方法為利用核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法能在半個(gè)工作日內(nèi)完成假高粱的檢測(cè)，不僅檢測(cè)時(shí)間大大縮短，檢測(cè)的靈敏度也顯著提高。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)假高粱的引物對(duì)、探針、核酸組合物及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和植物檢驗(yàn)檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)假高粱halepense)的引物對(duì)和探針，本發(fā)明還涉及利用該引物對(duì)和探針構(gòu)成的核酸組合物檢測(cè)假高粱的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]高觀(Sorghum S.)，為禾本科植物，目前在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中常出現(xiàn)的高粱屬的植物有假高梁黑高梁{Sorghum almum)、屬嗓{Sorghum Aico7or)、擬高梁(Sorghum propinquum )、光高梁(Sorghum ni tidum )及蘇丹草(Sorghum sudanense )等。高粱作為世界5大糧食作物之一，被廣泛地用于食品、飼料和釀造，因此，該屬許多種在世界各地(包括我國(guó))均有大量栽培，使得該屬在世界范圍內(nèi)分布較為廣泛。
[0003]高粱屬的各種植物的籽實(shí)極為相似，但是其危害性及檢疫地位各有不同。高粱屬中的假高粱(5br#?為檢疫性有害植物，不僅可使作物產(chǎn)量降低，同時(shí)也是高粱屬作物許多害蟲(chóng)和病害的寄主。在進(jìn)口高粱中，經(jīng)?？山孬@有毒和有害雜草假高粱，但由于高粱屬各種植物的籽實(shí)極為相似，其種子鑒定易發(fā)生混淆。
[0004]假高粱的傳統(tǒng)鑒定方法是利用種子形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞生物學(xué)特征等進(jìn)行鑒定。外觀形態(tài)鑒定因能便捷地根據(jù)不同植物的外部特征對(duì)不同種植物進(jìn)行分類而成為口岸檢疫雜草的重要手段之一。但在實(shí)際工作中，農(nóng)產(chǎn)品中夾雜的雜草種子的外觀特征往往會(huì)因運(yùn)輸受到磨損而變形，環(huán)境、氣候、栽培條件的影響、種子成熟度的不同也會(huì)引起個(gè)體差異，這為形態(tài)鑒定增加難度。細(xì)胞生物學(xué)方法需要的鑒定周期比較長(zhǎng)，且難以準(zhǔn)確鑒定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中在形態(tài)鑒定和細(xì)胞生物學(xué)鑒定方法中存在的困難，提供一種采用分子生物學(xué)的方法，對(duì)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribed Spacers, ITS)序列差異設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)假高粱的引物對(duì)。
[0006]一種用于檢測(cè)假高粱的引物對(duì)，其序列為:
核酸引物F，即上游引物:5’-TGGTGGGCGACACTTAGTTG-3’ (SEQ ID No I)或其互補(bǔ)鏈; 核酸引物R，即下游引物:5’ -CAACGATGTGCTGCGGTG-3’ (SEQ ID No 2)或其互補(bǔ)鏈。
[0007]本發(fā)明的第二目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用分子生物學(xué)的方法，對(duì)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacers, ITS)序列差異設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)假高粱的探針。
[0008]一種用于檢測(cè)假高粱的探針，其序列為:
核酸分子探針P:5’ -ACGTGGCCGGCGC-3’ ( SEQ ID No 3)或其互補(bǔ)鏈，該核酸分子探針P為Taqman熒光探針，5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
[0009]其中，所述熒光基團(tuán)可以是羧基熒光素(FAM)。所述淬滅劑可以是羧基四甲基落羅丹明(TAMRA)。
[0010]根據(jù)核苷酸堿基配對(duì)規(guī)則可以推知，與本發(fā)明提供的核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P核酸序列完全互補(bǔ)的核酸鏈組成的一組核酸組合物也適用于本發(fā)明當(dāng)中。
[0011]本發(fā)明提供的檢測(cè)假高粱的核酸引物對(duì)和探針是基于假高粱與其近似種在rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列上的差異設(shè)計(jì)的。18S-26S核核糖體DNA(nrDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS分為ITSl和ITS2兩部分，ITS區(qū)在植物核基因組中是高度重復(fù)的，全部nrDNA重復(fù)單位包括4萬(wàn)個(gè)拷貝以串聯(lián)重復(fù)(tandemr印eats)方式出現(xiàn)在一個(gè)或多個(gè)染色體基因位點(diǎn)上。在被子植物中，ITS區(qū)既具有核苷酸序列的高度變異性又有長(zhǎng)度上的保守性，說(shuō)明這些間隔區(qū)的序列很容易在近緣類群間排序，而且豐富的變異可在較低的分類階元上(如:屬間和種間)解決植物系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題。通過(guò)對(duì)不同生物類群的ITS序列(自生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù))的比較得出:被子植物大多數(shù)科屬的ITS序列的種間差異值為1.2 %-10.2 %，屬間差異值為9.6 %_28.8%，這對(duì)系統(tǒng)發(fā)育研究來(lái)說(shuō)都是較合適的范圍。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)假高粱的核酸組合物，包含上述核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P。
[0013]本發(fā)明的第四目的在于提供一種用于檢測(cè)假高粱的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(I)設(shè)計(jì)合成引物和探針:所述引物為上述的引物F和引物R，所述探針為上述的核酸分子探針P ;
(2 )樣品DNA提?。?br> (3 )采用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，通過(guò)熒光標(biāo)識(shí)判斷目標(biāo)樣品是否為假高粱。
[0014]所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ 1:2 XPremix Ex TaqTM 12.5 μ L，引物F和引物R各 lyL，核酸分子探針P I μ L，DNA 模板 I μ L，50X ROX Reference Dye II 0.5yL，滅菌蒸餾水補(bǔ)至25yL。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95°C 10s;然后以95°C 15s，67°C Imin進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
[0015]本發(fā)明的檢測(cè)方法中，在提取目標(biāo)樣品的總DNA后，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)就可完成對(duì)目標(biāo)樣品的擴(kuò)增，隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，所能檢測(cè)的熒光信號(hào)亦隨之增加，從而通過(guò)熒光標(biāo)識(shí)判斷目標(biāo)樣品是否為假高粱。
[0016]最后，本發(fā)明提供上述包含核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P的核酸組合物在對(duì)假高粱進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中的用途。
[0017]本發(fā)明是在提取種子的DNA后，利用核酸引物F/R和核酸分子探針P進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增后的陽(yáng)性樣品能檢測(cè)到熒光信號(hào)，PCR擴(kuò)增后的陰性樣品及空白對(duì)照無(wú)法檢測(cè)到有熒光信號(hào)的增加，由此可以區(qū)分假高粱和其它高粱屬的樣品。
[0018]假高粱的傳統(tǒng)鑒定方法是利用種子形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞生物學(xué)特征等進(jìn)行鑒定。然而，外觀形態(tài)鑒定存在不確定性，細(xì)胞生物學(xué)方法不僅需要較長(zhǎng)的周期，而且僅依據(jù)染色體的形態(tài)難以鑒定。本發(fā)明采用核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P及其互補(bǔ)核酸鏈形成的核酸組合物，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)假高粱的特異性區(qū)分，能在半個(gè)工作日內(nèi)完成檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并且能特異敏感準(zhǔn)確快速地鑒定假高粱及其近似種，有利于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)等領(lǐng)域?qū)δ繕?biāo)樣品的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是利用本發(fā)明的引物和探針對(duì)假高粱及其近似品種進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。
[0021](I)設(shè)計(jì)合成引物和探針
引物 F，即上游引物:5’ -TGGTGGGCGACACTTAGTTG-3’ ；
引物 R，即下游引物:5’ -CAACGATGTGCTGCGGTG-3’ ；
核酸分子探針 P:5’ -FAM-ACGTGGCCGGCGC-TAMRA-3’。
[0022]上述引物對(duì)和探針?lè)謩e委托上海生工生物科技公司和基康生物公司進(jìn)行合成。
[0023](2)樣品DNA提取
3粒種子液氮研磨粉碎，用試劑盒法(天根公司的DP320植物DNA提取試劑盒)提取DNA。
[0024](3)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)
實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系 25μ 1:Premix Ex TaqTM(2X )12.5 μ L，上、下游引物(5 μ mol/L)各 I μ L，TaqMan 核酸分子探針 P (5 μ mol/L)l μ L，DNA (10 ~20ng/μ L)模板 I μ L，ROXReference Dye II (50 X )0.5 μ L,滅菌蒸懼水補(bǔ)至 25 μ L,在 ABI 7500 型 Fast Real-TimePCR System上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95°C 10s;然后以95°C 15s,67°C Imin進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
[0025]采用上述檢測(cè)步驟，對(duì)來(lái)自于不同地區(qū)的假高粱及其近似品種的樣品(見(jiàn)表1)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0026]表1 PCR擴(kuò)增所用材料及其來(lái)源

【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)假高粱的引物對(duì)，其特征在于，其序列為: 核酸引物 F:5’-TGGTGGGCGACACTTAGTTG-3’ (SEQ ID No I)或其互補(bǔ)鏈; 核酸引物 R:5’-CAACGATGTGCTGCGGTG-3’ (SEQ ID No 2)或其互補(bǔ)鏈。
2.一種用于檢測(cè)假高粱的探針，其特征在于，其序列為: 核酸分子探針P:5’_ ACGTGGCCGGCGC -3，( SEQ ID No 3)或其互補(bǔ)鏈，其5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)假高粱的探針，其特征在于，所述熒光基團(tuán)為羧基熒光素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)假高粱的探針，其特征在于，所述淬滅基團(tuán)為羧基四甲基落羅丹明。
5.一種用于檢測(cè)假高粱的核酸組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的核酸引物F、核酸引物R和權(quán)利要求2-4所述的核酸分子探針P。
6.一種用于檢測(cè)假高粱的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)設(shè)計(jì)合成權(quán)利要求1所述的核酸引物F、核酸引物F及權(quán)利要求2所述的核酸分子探針P ; (2 )樣品DNA提??； (3 )采用步驟(1)的引物和探針對(duì)樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，通過(guò)熒光標(biāo)識(shí)判斷目標(biāo)樣品是否為假高粱。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ 1:2 XPremix Ex TaqTM 12.5 μ L，引物F和引物R各I μ L，核酸分子探針P I μ L，DNA 模板 IyL, 50 X ROX Reference Dye II 0.5 μ L,滅菌蒸懼水補(bǔ)至 25 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95°C 10s;然后以95°C 15s，67°C Imin進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
9.權(quán)利要求5所述的核酸組合物在對(duì)假高粱進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104178579SQ201410462473
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】印麗萍, 吳申懋, 傅怡寧, 薛華杰 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心