一種酶法制備(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法制備(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，所述方法包括如下步驟：將共表達(dá)全細(xì)胞、(R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代叔丁酯、輔因子、葡萄糖和緩沖液按一定比例混合，在pH＝5～8、溫度為20～45℃下反應(yīng)，經(jīng)后處理得到產(chǎn)物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所采用的方法操作過程簡單、生產(chǎn)效率高、環(huán)境友好、生產(chǎn)成本較低且反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物光學(xué)純度高，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】-種酶法制備（3R, 5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羥基 己酸叔丁酯的生物制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 輝瑞公司生產(chǎn)的立普妥自1997年上市以來迅速占領(lǐng)降膽固醇他汀類藥物市場， 成為該藥物領(lǐng)域和醫(yī)藥界的重磅炸彈藥物，迄今上市17年，銷售額遠(yuǎn)超千億美元。其有效 成分為阿托伐他汀（八1:〇；1^^8丨31:;[11)，而（31?，510-6-氰基-3,5-二輕基己酸叔丁酯是該有效 成分的關(guān)鍵手性中間體，因而此中間體的合成技術(shù)受到廣泛的研究與關(guān)注。目前文獻(xiàn)報道 的制備方法主要有化學(xué)法和生物法。
[0003] 化學(xué)法工藝生產(chǎn)（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯是利用硼烷類衍生 物在-70°C下將（R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代叔丁酯不對稱還原得到。該工藝需要極端 低溫和無水無氧的反應(yīng)條件，所用的硼烷易燃，能耗嚴(yán)重且產(chǎn)品的立體異構(gòu)純度僅為98% (US2009/0216029A1)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] 生物催化技術(shù)以具有底物專一性強、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)步驟簡便及 環(huán)境污染小等特點，被廣泛用于制備他汀類手性側(cè)鏈前體。
[0005] 已報道的制備（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯的生物法中，大部分均需 要同時使用酮還原酶和葡萄糖脫氫酶，而且都是分開表達(dá)、分開加料的，這就使得發(fā)酵次數(shù) 增加、成本提高，同時也影響生產(chǎn)的使用和效率（W02008042876)。
[0006] 此外，CN103911403公開了一種（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯的生物 制備方法，以（R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代叔丁酯為底物，用重組大腸桿菌發(fā)酵液作為催 化劑，底物濃度最高只有55克/L，且需添加助溶劑二甲亞砜。該方法采用發(fā)酵液直接作催 化劑時發(fā)酵液中含有的雜質(zhì)會對反應(yīng)帶來不利的影響，而且助溶劑二甲亞砜對環(huán)境污染較 大，底物濃度過低等，都不利于工業(yè)化生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明公開了一種（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二 羥基己酸叔丁酯的生物制備方法。
[0008] 具體工藝路線如下所示：
[0009]

【權(quán)利要求】
1. 一種酶法制備（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在于：將共 表達(dá)全細(xì)胞、（R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代叔丁酯、輔因子、葡萄糖和緩沖液按一定比例混 合后反應(yīng)得到產(chǎn)物。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述共表達(dá)全細(xì)胞為含羰基還原酶（KRED) 與葡萄糖脫氫酶（GDH)的基因工程菌。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述共表達(dá)全細(xì)胞是由能同時表達(dá)羰 基還原酶（KRED)與葡萄糖脫氫酶（GDH)重組基因的大腸桿菌或酵母菌通過發(fā)酵培養(yǎng)得到， 其中優(yōu)選為大腸桿菌。
4. 如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：利用所述共表達(dá)全細(xì)胞直接催化反 應(yīng)。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述共表達(dá)全細(xì)胞的濃度為10?300g/L、 所述（R)-6-氰基-5-羥基-3-氧代叔丁酯的濃度為100?300g/L、所述輔因子的濃度為 0. 005?0. 01g/L、所述葡萄糖的濃度為100?300g/L和所述緩沖液的濃度為10?lOOmM/ L〇
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述反應(yīng)在pH = 5?8、溫度為20?45°C 下進(jìn)行。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述輔因子為NAD、NADH、NADP和NADPH的 任意一種或它們的組合，其中優(yōu)選為NADP。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液或三乙醇胺 緩沖液，其中優(yōu)選為三乙醇胺緩沖液。
【文檔編號】C12R1/19GK104195191SQ201410462724
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】竺偉, 賈翠英, 包蕾, 陳加利, 吳會 申請人:尚科生物醫(yī)藥（上海）有限公司