一種霸王鞭懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種霸王鞭懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括從霸王鞭誘導(dǎo)愈傷組織、繼代培養(yǎng)愈傷組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮體系的優(yōu)化等步驟。本發(fā)明方法所制備的霸王鞭懸浮細(xì)胞工藝流程簡單，不受地域，季節(jié)等自然環(huán)境因素影響，有利于建立霸王鞭懸浮細(xì)胞的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。
【專利說明】一種霸王鞭懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下霸王鞭懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]霸王鞭，EupHorbia royleana Boiss,大戟科,喬木狀，莖干肉質(zhì)、粗壯，具5棱，后變圓形。分枝螺旋狀輪生，淺綠色，后變灰，具黑刺。葉片多漿，革質(zhì)，倒卵形，基部漸狹，淺綠色。全株含有白色劇毒乳汁，若誤食會中毒；濺入眼中可致失明。全草含蒲公英賽醇(taraxerol), 2，3_ 二甲氧基并沒食子酸，丁二酸，又含大戟二烯醇、巨大戟萜醇。乳汁含四環(huán)三萜，環(huán)霸王鞭萜烯醇，蒲公英賽醇，β -粘霉烯醇，大戟二烯醇，又含巨大戟萜四乙酸酯，巨大戟新萜醇三乙酸酯。主要用來祛風(fēng)解毒；殺蟲止癢。主瘡瘍腫毒；牛皮癬。喜溫暖干燥和陽光充足環(huán)境。喜光，喜溫暖氣候，甚耐干旱。畏寒，溫度偏低時常落葉。不耐寒，耐高溫。宜排水良好、疏松的沙壤土，性喜光照強(qiáng)、氣溫高的環(huán)境，培養(yǎng)得好主莖可高達(dá)3米。采用扦插法繁殖，組培方法研究目前尚處于起步階段，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)尚無人研究，懸浮細(xì)胞具有操作簡單可控，生產(chǎn)成本低，繁殖率高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供霸王鞭懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，工藝流程簡單，不受地域，季節(jié)等自然環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，有利于建立霸王鞭懸浮細(xì)胞的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
選用霸王鞭幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗15分鐘，在超凈工作臺上用2%的次氯酸鈉消毒8分鐘，無菌水沖洗至無殘留，接種在1/2ΜΡ，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照1000-15001χ，光照10h/d，溫度21°C，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基MP+0.5-lmg/L6-BA+1-2mg/LNAA+反玉米素2_3mg/L+lg/L活性炭培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后，挑選生長均一，顆粒細(xì)小，外觀濕潤，質(zhì)地松軟的愈傷組織，用120目的不銹鋼篩過濾，除去大細(xì)胞團(tuán),接種量為2g每30mL，每次換培養(yǎng)液,先將培養(yǎng)物靜止，倒去上層2/3培養(yǎng)液，添加2/3新液，每十天換一次培養(yǎng)液，用300目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗漆，烘干。
[0005]采用本發(fā)明制備的霸王鞭懸浮細(xì)胞，生長速度快，能耗小，污染小，次生代謝物含量高。
[0006]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。

【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施例1
選用霸王鞭幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗15分鐘，在超凈工作臺上用2%的次氯酸鈉消毒8分鐘，無菌水沖洗至無殘留，接種在1/2MP，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照1000-15001x，光照10h/d，溫度21°C，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基MP+0.5mg/L6-BA+lmg/LNAA+反玉米素2mg/L+lg/L活性炭培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后，挑選生長均一，顆粒細(xì)小，外觀濕潤，質(zhì)地松軟的愈傷組織，用120目的不銹鋼篩過濾，除去大細(xì)胞團(tuán)，接種量為2g每30mL，每次換培養(yǎng)液，先將培養(yǎng)物靜止，倒去上層2/3培養(yǎng)液，添加2/3新液，每十天換一次培養(yǎng)液，用300目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干，成活率95%。
[0008]實(shí)施例2
選用霸王鞭幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗15分鐘，在超凈工作臺上用2%的次氯酸鈉消毒8分鐘，無菌水沖洗至無殘留，接種在1/2MP，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照1000-15001x，光照10h/d，溫度21°C，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基MP+lmg/L6-BA+2mg/LNAA+反玉米素3mg/L+lg/L活性炭培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后，挑選生長均一，顆粒細(xì)小，外觀濕潤，質(zhì)地松軟的愈傷組織，用120目的不銹鋼篩過濾,除去大細(xì)胞團(tuán),接種量為2g每30mL，每次換培養(yǎng)液，先將培養(yǎng)物靜止,倒去上層2/3培養(yǎng)液，添加2/3新液，每十天換一次培養(yǎng)液，用300目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干，成活率94%。
[0009]實(shí)施例3
選用霸王鞭幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗15分鐘，在超凈工作臺上用2%的次氯酸鈉消毒8分鐘，無菌水沖洗至無殘留，接種在1/2MP，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，光照1000-15001x，光照10h/d，溫度21°C，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基MP+lmg/L6-BA+lmg/LNAA+反玉米素2mg/L+lg/L活性炭培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后，挑選生長均一，顆粒細(xì)小，外觀濕潤，質(zhì)地松軟的愈傷組織，用120目的不銹鋼篩過濾,除去大細(xì)胞團(tuán),接種量為2g每30mL，每次換培養(yǎng)液，先將培養(yǎng)物靜止,倒去上層2/3培養(yǎng)液，添加2/3新液，每十天換一次培養(yǎng)液，用300目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干，成活率93%。
【權(quán)利要求】
1.一種霸王鞭懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:霸王鞭的葉片經(jīng)消毒處理，接種在1/2MP，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入培養(yǎng)基MP+0.5-lmg/L6-BA+l-2mg/LNAA+反玉米素2_3mg/L+lg/L活性炭培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)40天后接入不加瓊脂的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，十天換一次培養(yǎng)液，用300目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，稱量鮮重，60°C烘干至恒重稱量，得干重。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霸王鞭懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒處理為:選用霸王鞭幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗15分鐘，在超凈工作臺上用2%的次氯酸鈉消毒8分鐘，無菌水沖洗至無殘留。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霸王鞭懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:誘導(dǎo)愈傷組織的條件為光照1000-15001x，光照10h/d，溫度21 °C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霸王鞭懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:霸王鞭愈傷組織繼代中添加了反玉米素和活性炭，反玉米素可以促進(jìn)細(xì)胞的分裂生長，活性炭可以防止愈傷組織的褐化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霸王鞭懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法為愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)之后，挑選生長均一，顆粒細(xì)小，外觀濕潤，質(zhì)地松軟的愈傷組織，用120目的不銹鋼篩過濾，除去大細(xì)胞團(tuán)，接種量為2g每30mL，每次換培養(yǎng)液，先將培養(yǎng)物靜止，倒去上層2/3培養(yǎng)液，添加2/3新液，每十天換一次培養(yǎng)液。
【文檔編號】C12N5/02GK104178450SQ201410463090
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司