陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒及制備方法，包括如下試劑：Mastermix反應(yīng)液；P-mix-1反應(yīng)液；P-mix-2反應(yīng)液；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；本發(fā)明解決了陳舊性生物樣本的種屬鑒定問(wèn)題，不僅可以直接應(yīng)用于刑事案件的偵破工作，維護(hù)社會(huì)安定，也可以通過(guò)對(duì)考古遺跡中動(dòng)物考古學(xué)信息的挖掘，來(lái)揭示古代人們對(duì)食物的選擇，狩獵和家畜飼養(yǎng)等重要的經(jīng)濟(jì)與文化背景。還可以幫助海關(guān)打擊野生動(dòng)物走私活動(dòng)，保護(hù)野生動(dòng)物資源，另外可以用于鑒定動(dòng)物的中藥材品質(zhì)，打擊假冒偽劣藥材。
【專利說(shuō)明】陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒，本發(fā)明同時(shí)還提供了該陳舊性 動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒的制備方法，屬于生物檢材的種屬鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 法醫(yī)物證鑒定實(shí)踐中，不明來(lái)源生物檢材的種屬鑒定是重要的一個(gè)鑒定環(huán)節(jié)。陳 舊性生物樣本的鑒定，成為現(xiàn)階段法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的難題，也制約了許多重要物證的價(jià)值。同 時(shí)在考古分析、海關(guān)稽查以及中藥材質(zhì)量鑒定過(guò)程中也常常會(huì)遇到對(duì)陳舊性生物檢材種屬 鑒定的需求。
[0003] 傳統(tǒng)的種屬鑒定方法的普遍存在的不足之處有以下幾點(diǎn)：一、某些檢測(cè)體系缺乏 必需的內(nèi)對(duì)照。單獨(dú)擴(kuò)增測(cè)mtDNA的編碼基因，如cytb基因、12SrRNA基因、5SrRNA基因等 進(jìn)行種屬鑒別時(shí)缺乏必需的內(nèi)對(duì)照，因而若檢測(cè)為陰性結(jié)，并不能判定檢材為非人類，也有 可能是檢材已被破壞，或者是DNA提取不當(dāng)?shù)仍?，在種屬鑒定過(guò)程中有可能得到假陰性 的結(jié)果。二、擴(kuò)增測(cè)序mtDNA的編碼基因，檢測(cè)過(guò)程煩瑣，測(cè)序費(fèi)用昂貴。三、所用的方法大 多基于新鮮或是保存較好的組織樣本，擴(kuò)增片段普遍在300-1200bp，對(duì)大部分陳舊性生物 檢材和所有考古樣本均不適用。四、多次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)會(huì)造成耗用模板量過(guò)大，使微量、高降解 的陳舊性生物樣本無(wú)法完成檢測(cè)。五、種屬關(guān)系較近的樣本無(wú)法鑒定。如黃牛和水牛，山羊 和綿羊。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)有上百家單位開展了法醫(yī)DNA檢測(cè)項(xiàng)目，每年檢驗(yàn)各類案件數(shù) 十萬(wàn)起，在許多重特大、疑難案件的偵破中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，取得了巨大的成功。但是在 現(xiàn)場(chǎng)檢材中遺留著許多陳舊性生物樣本，仍然沒(méi)有得到有效的利用，其原因就是沒(méi)有針對(duì) 陳舊性生物樣本的DNA鑒定方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開一種陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒，針對(duì)陳舊性生物樣本的DNA嚴(yán) 重降解的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)以線粒體基因組中的cytb基因和高可變I區(qū)為目標(biāo)序列的小片段擴(kuò)增 方體系，并首次創(chuàng)建平行復(fù)合PCR方法，使種屬鑒定結(jié)果通過(guò)簡(jiǎn)單的瓊脂糖凝膠電泳，即可 根據(jù)DNA片段長(zhǎng)度來(lái)對(duì)樣本進(jìn)行判斷。構(gòu)建了一套簡(jiǎn)捷、高敏感的mtDNA種屬鑒定體系，促 進(jìn)法醫(yī)DNA檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，為刑偵人員提供更多的信息和證據(jù)。
[0006] 本發(fā)明同時(shí)還提供了陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下： 選擇mtDNA基因組為檢測(cè)目標(biāo)，建立優(yōu)化的復(fù)合擴(kuò)增體系。其中cytochrome b基因 (細(xì)胞色素 b基因，cytb基因）作為mtDNA編碼基因，其編碼序列區(qū)域進(jìn)化緩慢，相對(duì)保守， 因而具有較穩(wěn)定性，作為反應(yīng)的內(nèi)對(duì)照片段；以mtDNA高可變I區(qū)的變異區(qū)為目標(biāo)區(qū)，通過(guò) 對(duì)Genebank中人和豬、牛、羊、馬、狗等常見家養(yǎng)動(dòng)物以及鹿、猴、熊、虎等野生動(dòng)物的線粒 體基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)2對(duì)熒引物，針對(duì)高度降解的生物檢材，以適合的片段大 小（< 200bp)對(duì)不同種屬的單一或混合樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同動(dòng)物種屬的擴(kuò)增片段長(zhǎng) 度的差異，在同一反應(yīng)中鑒定一個(gè)或是多個(gè)具體動(dòng)物的種屬。
[0008] 通過(guò)對(duì)引物的修訂和調(diào)整，建立平行復(fù)合擴(kuò)增體系：在這個(gè)體系中分為兩組平行 進(jìn)行擴(kuò)增：第一組將Cytb引物和mtDNA引物放在一組形成Ρ-mix-l進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)；第 二組復(fù)合體系將Cytb引物和另一對(duì)mtDNA引物結(jié)合形成P-mix-2,兩組平行進(jìn)行用于陳舊 性動(dòng)物種屬鑒定。
[0009] 本發(fā)明提供的一種陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒，是由以下物質(zhì)組成： 試劑盒包括如下試劑： ⑴Master mix反應(yīng)液 ⑵Ρ-mix-l反應(yīng)液 ⑶P-mix-2反應(yīng)液 ⑷DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物； 2. 上述陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒的組分特征在于：試劑盒內(nèi)含有Master mix反應(yīng)液lml，其組分為：0. IM Tris-HCl緩沖液，pH為8. 2 ;0. 1%牛血清白蛋白； 5mM Mgcl2 ;2mM dNTP ;2U/y L TaqDNA 聚合酶；Ρ-mix-l 反應(yīng)液 0· Iml,其組分包 括：25uM 引物 A:ACGAAACAGGATCCAACAAC,引物 B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC,引物 C: CCATCAACACCCAAAGCTG 和引物 D: CATTTAATGCACGACGTACAT; P-mix-2 反應(yīng)液 0· Iml,其組 分包括：25uM 引物 A :ACGAAACAGGATCCAACAAC,引物 B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC,引物 E :CCCATGCATATAAGCACGTAC 和引物 F : GAGGCATGGTGATTAAGCTC. 3. 本發(fā)明同時(shí)還提供了陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒的制備方法，包括以下步 驟： ⑴對(duì)生物檢材進(jìn)行DNA提取步驟： DNA的提取方法采用先裂解組織樣本，隨后使用硅膠法提取DNA的策略。具體步驟如 下： ① ·取0. I-Ig動(dòng)物組織，加入含有0. 5M EDTA，0. 5% SDS，0. 4 g/L蛋白酶K的裂解 液，56°C水浴3小時(shí)； ② ·將含有DNA的裂解液500 r/min，離心8 min，取2mL上清液加入到離心超濾管 中，6800 r/min離心3小時(shí)，將含有DNA的裂解液濃縮到100 μ L。
[0010] ③.使用硅膠法提取上一步濃縮的裂解液中DNA。4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0011] ⑵平行復(fù)合擴(kuò)增體系 ① 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系1 Master mix 反應(yīng)液 8. 5 μ L Ρ-mix-l 反應(yīng)液 IuL 樣本DNA模板 2. 5 μ L ② 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系2 Master mix 反應(yīng)液 8. 5 μ L P-mix-2 反應(yīng)液 1 μ L 樣本DNA模板 2. 5 μ L 建議加入樣本的DNA含量范圍在10-20ng/μ L，根據(jù)樣本量進(jìn)行稀釋或者濃縮。
[0012] (3)將上述PCR體系加到200 μ L體積的PCR管中，輕輕渦旋震蕩三次； ⑷將上述PCR反應(yīng)體系放入PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)置為： 95°C初始變性5分鐘，94°C熱變性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸45秒；7個(gè)循環(huán)， 94°C熱變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸45秒；33個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10分鐘，最后 4 C保溫。
[0013] (5) PCR產(chǎn)物電泳分析 所得的PCR產(chǎn)物均要進(jìn)行電泳檢測(cè)，具體方法如下：取5 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μ L6X加 樣緩沖液混合后，加入3%瓊脂糖凝膠的加樣孔中，電泳電壓恒壓在90V電泳50分鐘，EB染 色。使用凝膠成像分析儀檢測(cè)。
[0014] 6.根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行樣本種屬的鑒定 每種動(dòng)物每個(gè)PCR反應(yīng)均檢出兩條電泳條帶，其中一條為相同片段大小的Cytb基因的 擴(kuò)增產(chǎn)物片段，將此條帶作為反應(yīng)體系的內(nèi)對(duì)照(見圖1)，顯示DNA模板的提取質(zhì)量和PCR 擴(kuò)增的有效性。另一條帶則顯示出的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度差異（見圖2-3)，比對(duì)DNA片段長(zhǎng)度 (見下表)。根據(jù)2個(gè)平行復(fù)合擴(kuò)增體系的結(jié)果組合即可判斷樣本的種屬特異性。
[0015] 表1. 10種常見動(dòng)物在兩組復(fù)合體系中經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度

【權(quán)利要求】
1. 一種陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒，其特征在于是由以下物質(zhì)組成： ⑴ Master mix 反應(yīng)液 lml ; ⑵ P-mix-1 反應(yīng)液 0· lml ; (3) P-mix-2 反應(yīng)液 0· lml ; ⑷DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物； 其中， Master mix反應(yīng)液組分為：0. 1M Tris-HCl緩沖液，pH為8. 2 ;0. 1%牛血清白蛋白；5mM Mgcl2 ;2mM dNTP ;2U/ μ L TaqDNA 聚合酶； P-mix-1 反應(yīng)液組分包括：25uM 的引物 A :ACGAAACAGGATCCAACAAC，引 物 B :GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC，引物 C :CCATCAACACCCAAAGCTG 和引物 D : CATTTAATGCACGACGTACAT ； P-mix-2 反應(yīng)液組分包括：25uM 的引物 A :ACGAAACAGGATCCAACAAC，引 物 B:GGTGTAGTTGTCTGGGTCTCC，引物 E:CCCATGCATATAAGCACGTAC 和引物 F: GAGGCATGGTGATTAAGCTC ； DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物用于凝膠電泳中雙鏈線狀DNA分子量大小的參照。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述陳舊性動(dòng)物樣本種屬鑒定試劑盒的制備方法，包括以下步驟： 1) 對(duì)生物檢材進(jìn)行DNA提?。? ① 取0. Ι-lg動(dòng)物組織，加入含有0. 5M EDTA，0. 5% SDS，0.4 g/L蛋白酶K的裂解液， 56°C水浴3小時(shí)； ② 將含有DNA的裂解液7500 r/min，離心8 min，取2mL上清液加入到離心超濾管中， 6800 r/min離心3小時(shí)，將含有DNA的裂解液濃縮到100 μ L ; ③ 使用硅膠法提取上一步濃縮的裂解液中DNA ;4°C保存?zhèn)溆茫? 2) 平行復(fù)合擴(kuò)增體系 ①準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系1 Master mix 反應(yīng)液 8. 5 μ L Ρ-mix-l 反應(yīng)液 1 μ L 樣本DNA模板 2. 5 μ L ②準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系2 Master mix 反應(yīng)液 8. 5 μ L P-mix-2 反應(yīng)液 1 μ L 樣本DNA模板 2. 5 μ L 建議加入樣本的DNA含量范圍在10-20ng/μ L，根據(jù)樣本量進(jìn)行稀釋或者濃縮； 3) 將上述PCR體系加到200 μ L體積的PCR管中，輕輕渦旋震蕩三次； 4) 將上述PCR反應(yīng)體系放入PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)：95°C初始變性5分鐘， 94°C熱變性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸45秒；7個(gè)循環(huán)，94°C熱變性30秒，50°C退火 30秒，72°C延伸45秒；33個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10分鐘，最后4°C保溫； 5. PCR產(chǎn)物電泳分析 取5μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μ L6X加樣緩沖液混合后，加入3 %瓊脂糖凝膠的加樣孔中， 電泳電壓恒壓在90V電泳50分鐘，ΕΒ染色。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263821SQ201410465741
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】崔銀秋, 趙洪玉, 張雪梅, 寧超 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)