一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組畢赤酵母及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組畢赤酵母及其構(gòu)建方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用獸疫鏈球菌來源的透明質(zhì)酸合酶hasA和枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD，重組Pichia pastoris GS115宿主中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸的生產(chǎn)；同時，采用水蛭來源的透明質(zhì)酸酶整合至畢赤酵母基因組上，分別置于不同強(qiáng)度的組成型啟動子下分泌表達(dá)，通過控制透明質(zhì)酸酶的分泌表達(dá)量來制備不同分子量大小的小分子透明質(zhì)酸產(chǎn)物，制備的產(chǎn)物分子量范圍有差異，對于微生物直接生產(chǎn)特定范圍的小分子透明質(zhì)酸具有重要的指導(dǎo)借鑒意義。本發(fā)明為高效制備小分子透明質(zhì)酸奠定了一定的基礎(chǔ)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組畢赤酵母及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組畢赤酵母及其構(gòu)建方法，屬于生物工程

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一種高分子粘性多糖，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu) 和理化性質(zhì)，使其具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保 濕性最好的物質(zhì)，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng) 域。近年來研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的HA(低于IXlO 4)和透明質(zhì)酸寡糖具有獨(dú)特的生物學(xué)功 能。低分子量的HA(低于IXlO4)和寡聚透明質(zhì)酸，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的生物活性，具有抑制 腫瘤擴(kuò)散、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)骨和血管生成、免疫調(diào)節(jié)等作用，且易于滲透到真皮中，免疫 細(xì)胞、細(xì)胞因子的激活劑。HAlO(K)糖單位）和HA8 (8糖單位）可以刺激成纖維細(xì)胞增殖、 膠原合成以及可以通過破壞大分子透明質(zhì)酸與細(xì)胞受體的相互作用而選擇性殺死癌細(xì)胞； HA6和HA4可以誘導(dǎo)體內(nèi)樹突細(xì)胞的成熟以及新血管合成。此外，HA寡糖容易被人體吸收 而用于人體自身HA等多糖合成的前體，因此，HA寡糖在食品保健以及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的 應(yīng)用前景。
[0003] 目前，雖然已有報道采用從頭合成的方法來制備HA寡糖，但由于化學(xué)合成存在底 物昂貴、步驟繁瑣以及合成效率低等多問題，難以實(shí)現(xiàn)HA寡糖制備應(yīng)用。相比較，酶法催化 合成HA寡糖是一種很有潛力的方法，但需要制備大量的透明質(zhì)酸酶液和控制反應(yīng)條件。因 此，將微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA和透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，HAase)相偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)一菌發(fā)酵直 接生產(chǎn)獲取HA寡糖和透明質(zhì)酸酶兩種產(chǎn)物，具有一定的研究意義和工業(yè)化潛力。
[0004] 本發(fā)明在畢赤酵母（Pichia pastoris)內(nèi)重組表達(dá)Streptococcus zooepidemicus來源的透明質(zhì)酸合成酶hasA和UDP-葡萄糖脫氫酶的tuaD以構(gòu)建HA合成 途徑，并表達(dá)HAase，以實(shí)現(xiàn)一菌同步發(fā)酵生產(chǎn)HA和HAase，在發(fā)酵液中直接制備生產(chǎn)HA寡 糖產(chǎn)物。這一偶聯(lián)模式解決了當(dāng)前微生物生產(chǎn)HA過程中由于粘度過高導(dǎo)致發(fā)酵停滯產(chǎn)量 難以獲得突破的瓶頸問題，尤其是首次實(shí)現(xiàn)微生物高效合成HA寡糖，具有巨大的應(yīng)用價值 和經(jīng)濟(jì)效益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸的重組畢赤酵母， 是在重組畢赤酵母內(nèi)構(gòu)建了產(chǎn)透明質(zhì)酸的途徑并偶聯(lián)分泌表達(dá)透明質(zhì)酸酶。為構(gòu)建產(chǎn)透明 質(zhì)酸的途徑，在畢赤酵母中表達(dá)了編碼透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA和UDP-葡萄糖脫氫酶的 基因 tuaD。
[0006] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述畢赤酵母為Pichia pastoris GS115。
[0007] 所述透明質(zhì)酸合酶編碼基因 hasA可以來源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)或類馬鏈球菌(Streptococcus equissp)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA來源于獸疫鏈 球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述UDP-葡萄糖脫氫酶可以來源于鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿 菌（Escherichia coli)或芽孢桿菌（Bacillus)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述 Μ)Ρ-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，hasA和tuaD分別由組成型強(qiáng)啟動子控制表達(dá)，例如 畢赤酵母組成型強(qiáng)啟動子。如hasA由三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子GAP(SEQ ID N0.3)控制 表達(dá)，tuaD由翻譯延伸因子l-α啟動子TEF1(SEQ ID NO. 4)控制表達(dá)。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述透明質(zhì)酸酶LHyal來源于水蛭，融合啟動子和 信號肽后通過重組整合到畢赤酵母基因組進(jìn)行表達(dá)。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述透明質(zhì)酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述透明質(zhì)酸酶基因分別置于不同強(qiáng)度的組成型啟 動子GAP、TEFl或YPTl (SEQ ID NO. 6)控制下表達(dá)；信號肽為α -因子信號肽。透明質(zhì)酸 酶表達(dá)量越高，所制得HA的分子量越小。將水蛭透明質(zhì)酸酶基因與GAP啟動子融合，所得 重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量為41000道爾頓。將水蛭透明質(zhì)酸酶基因與TEFl 啟動子融合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量為66500道爾頓。將水蛭透明質(zhì) 酸酶基因與YPTl啟動子融合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量為110000道爾 頓。
[0013] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述重組畢赤酵母的方法，主要 包括以下步驟：
[0014] (1)構(gòu)建透明質(zhì)酸的合成途徑：將編碼透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA與啟動子GAP融 合，將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD與啟動子TEFl融合，將兩個融合片段再融合后 連接表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到含透明質(zhì)酸合成途徑的畢赤酵母；
[0015] (2)偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶：將透明質(zhì)酸酶基因融合啟動子后整合到步驟（1)所得 重組畢赤酵母的基因組中，獲得偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶的重組畢赤酵母。
[0016] 所述步驟（2)中的啟動子可根據(jù)需要制備的HA的分子量進(jìn)行調(diào)整，啟動子強(qiáng)度越 大，重組畢赤酵母產(chǎn)的HA的分子量就越小。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（2)選定畢赤酵母基因組上乙醇脫氫酶基因作 為透明質(zhì)酸酶整合位點(diǎn)。
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟（2)將水蛭透明質(zhì)酸酶基因與GAP啟動子融合， 所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量為41000道爾頓。
[0019] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，步驟（2)將水蛭透明質(zhì)酸酶基因與TEFl啟動子融 合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量為66500道爾頓。
[0020] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，步驟（2)將水蛭透明質(zhì)酸酶基因與YPTl啟動子融 合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的HA平均分子量為110000道爾頓。
[0021] 本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)小分 子透明質(zhì)酸（l〇 4Da〈Mr〈105Da)或透明質(zhì)酸寡糖（MKlO4Da)的方法，是以甘油、甲醇、山梨醇 或葡萄糖等作為碳源，在20-30°C，發(fā)酵48-96h。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將經(jīng)活化培養(yǎng)的重組畢赤酵母接種于發(fā)酵培養(yǎng)基， 200rpm3(TC培養(yǎng)96h。所得小分子透明質(zhì)酸分子量小于IO 5Da,主要產(chǎn)物為低分子量或者 HA-4、HA-6、HA-8、HA-10等透明質(zhì)酸寡聚糖。
[0023] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基含：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11. 8g/L KH2PO4,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X IOVD，甘油 lml/L，添加 2g/L 的 MgSO4, 葡萄糖濃度為5%。
[0024] 所得發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸酶分離純化后可用于食品、醫(yī)藥或臨床等用途。
[0025] 本發(fā)明利用畢赤酵母偶聯(lián)產(chǎn)透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸，在產(chǎn)高分子HA的過程中，HA 被同時分泌至胞外的透明質(zhì)酸酶降解為小分子透明質(zhì)酸，具有直接的目的性。與其他方式 相比，該發(fā)明具有非常大的應(yīng)用優(yōu)勢。首先，本發(fā)明偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶，降低了發(fā)酵液粘 稠度，增加了溶氧和提高了 HA的產(chǎn)量；其次，發(fā)酵液中酶水解制備的小分子寡聚透明質(zhì)酸 的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達(dá)95%以上，產(chǎn)物的分子量小余IO5道爾頓，且主要產(chǎn)物為低分子量寡聚糖， 易于純化回收?；趹?yīng)用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備小分子寡聚透明質(zhì)酸及其衍 生體具有潛在而非常廣泛的價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1所示為重組質(zhì)粒PAPAT9K的構(gòu)建示意圖。
[0027] 圖2所示為水蛭透明質(zhì)酸酶基因整合片段的構(gòu)建示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 序列表中為相關(guān)核苷酸序列信息：
[0029] (I)SEQ ID NO. 1序列信息為獸疫鏈球菌來源的透明質(zhì)酸合成酶編碼序列；
[0030] (2) SEQ ID NO. 2序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶編碼序列；
[0031] (3) SEQ ID NO. 3序列信息為畢赤酵母組成型啟動子GAP的基因序列；
[0032] (4) SEQ ID NO. 4序列信息為畢赤酵母組成型啟動子TEFl的基因序列；
[0033] (5) SEQ ID NO. 5序列信息為水蛭來源的透明質(zhì)酸酶LHyal的基因序列；
[0034] (6) SEQ ID NO. 6序列信息為畢赤酵母組成型啟動子YPTl的基因序列；
[0035] (7) SEQ ID NO. 7序列信息為編碼畢赤酵母α -因子信號肽序列的基因序列。
[0036] (8)SEQIDN0·8為畢赤酵母基因組無痕改造片段PA0X-mazF-Zeocin(AMZ)的基因 序列。
[0037] 實(shí)施例IhasA基因和UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD基因的克隆
[0038] 本發(fā)明所用的hasA基因來源于為獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246 和 UDP-葡萄糖脫氧酶基因來源于 Bacillus subtilis，Streptococcus zooepidemicus菌株在接種與5ml M17液體培養(yǎng)基，在37°C 200rpm培養(yǎng)16h。Bacillus subtilis 接種于 5ml LB 液體培養(yǎng)基，在 37°C 200rpm 培養(yǎng) 16h。Pichia pastorisGS115 接 種于5ml YH)液體培養(yǎng)基，置于200rpm30°C培養(yǎng)24h。分別收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取 試劑盒提取三菌株的基因組DNA。
[0039] 根據(jù)已公布的基因組信息序列，分別設(shè)計(jì)引物hasA-F/hasA-R、tuaD-F/tuaD-R, 以提取的基因組DNA為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增體系和程序，分別擴(kuò)增獲取hasA和tuaD 基因。以Pichia pastorisGS115基因組為模板,設(shè)計(jì)引物gap-F/gap-R和tef-F/tef-R分 別擴(kuò)增GAP和TEFl啟動子。
[0040] 引物序列信息：5' -3'方向
[0041] hasA-F ： TGAACAACTATTTCGAAACGATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0042] hasA-R ： TGTCTAAGGCGAATTAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTC
[0043] tuaD-F ：CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAACAGG
[0044] tuaD-R ： CCGGAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTCAGC
[0045] gap-F ：CTTGATTCGAGCTCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTC
[0046] gap-R ：AGGTTTTTTAATGTTCTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0047] tef-F ：GAACACGTAAAAAATTATTATAAGAATTCCGGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCGC
[0048] tef-R ：ATGACAGCTATTTTTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0049] 實(shí)施例2重組質(zhì)粒PAPT9K的構(gòu)建
[0050] 采用上述擴(kuò)增的DNA片段hasA、tuaD、GAP和TEF1，分別采用融合PCR進(jìn)行啟動子 和目的基因的融合。具體操作程序如下：hasA和GAP片段各取2ul混合于PCR管內(nèi)，加入無 菌水21 μ 1和25 μ 12xsuper pfu Master Mix (杭州寶賽生物科技有限公司），混勻后置于 PCR 儀，按如下程序運(yùn)行：94°C 3min，[94°C 30s，50°C 30s，72°C lmin]X10,72°C 5min。無 引物自融合PCR結(jié)束后，立即加入引物gap-F和hasA-R各I μ 1，混勻后按如下程序運(yùn)行： 94°C 3min，[94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin] X 32, 72°C 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1 % 的瓊脂糖凝膠 電泳后，切膠回收目標(biāo)條帶，獲得GAP-hasA片段。
[0051] 同理，按上述操作融合PCR獲得TEFl-tuaD片段。回收的兩個融合片段 GAP-hasA和TEFl-tuaD，在按上述融合PCR操作，將兩片段進(jìn)行融合，獲得目標(biāo)片段 GAP-hasA-TEFl-tuaD。由于在引物gap-F和tuaD-R兩端分別引入了 SacI和NotI限制性 酶切位點(diǎn)，將載體PPIC9K進(jìn)行SacI和EcoRI雙酶切，去掉了 AOX啟動子和α -因子信號 肽，重組目標(biāo)片段GAP-hasA-TEFl-tuaD同樣采取SacI和EcoRI雙酶切，回收后與已雙切的 PPIC9K載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109宿主，對鑒定出的陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，比對 分析重組質(zhì)粒PAPT9K構(gòu)建成功，質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如附圖1所示。
[0052] 實(shí)施例3重組畢赤酵母產(chǎn)HA的菌株構(gòu)建
[0053] 重組質(zhì)粒PAPT9K采用Sail線性化后，按畢赤酵母操作手冊，電轉(zhuǎn)Pichia pastoris GS115宿主，以MD平板（組氨酸缺陷型篩選標(biāo)記）篩選陽性重組子。同時，為篩 選多拷貝插入的宿主，以含有不同濃度抗生素 g418的YH)平板進(jìn)行高拷貝篩選。本發(fā)明中 采用的發(fā)酵重組菌株為4mg/ml篩選出來的陽性重組菌株，命名為PAPTGS115。
[0054] 實(shí)施例4重組畢赤酵母PAPTGS115菌株的搖瓶發(fā)酵
[0055] 挑取PAPTGS115重組菌單克隆接種于5ml YH)培養(yǎng)基，置于200rpm30°C過夜培養(yǎng)。 16h后接種于250ml三角搖瓶（裝液量25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY :酵母提取物10g/L，蛋 白胨 20g/L，3g/L K2HP04，11.8g/L KH2P04，lXYNB(13.4g/L)，500X 生物素 lml/L(4Xl(T4g/ L)，甘油lml/L，添加2g/L的MgS04,葡萄糖濃度為5 %。按I %的接種量轉(zhuǎn)接與BMGY搖瓶， 置于 200rpm30°C培養(yǎng) 96h。
[0056] 收集發(fā)酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發(fā)酵液上清轉(zhuǎn)移置另一離心管中，加入 2倍體積的無水乙醇充分混勻沉淀發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpmT 室溫離心20min，去除干凈液體，白色沉淀加入發(fā)酵液等體積的IM NaCl溶液充分溶解。對 發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測HA酸含量，對照組為Pichia pastoris GS115同等條件下發(fā)酵液的回收物。經(jīng)測定PAPTGS115重組菌株的HA產(chǎn)量為 0.36g/L〇
[0057] 實(shí)施例5水蛭透明質(zhì)酸酶LHyal基因整合片段的構(gòu)建
[0058] 以大腸桿菌來源的毒素基因 mazF和博來霉素抗性基因 Zeocin作為雙篩選標(biāo)記， 構(gòu)建畢赤酵母基因組無痕改造片段AMZ。具體操作如下：設(shè)計(jì)引物對A0X-F/R、mazF-F/R和 Zeo-F/R，分別擴(kuò)增啟動子AOX片段、mazF和Zeocin片段，采用融合PCR技術(shù)，按實(shí)施例2中 所述的融合步驟，將三個片段融合為PAOX-mazF-Zeocin，命名為AMZ。引物對信息如下：
[0059] AOX-F ：AACATCCAAAGACGAAAGGTTG
[0060] AOX-R ：ACGTATCGGCTTACCATCGTTTGGATCCTTCGAATAATTAG
[0061] mazF-F ： TTCGAAGGATCCAAACGATGGTAAGCCGATACGTACC
[0062] mazF-R ：GCTATGGTGTGTGGGAAGCTTGCACAAACGAAC
[0063] Zeo-F ： TTCGTTTGTGCAAGCTTCCCACACACCATAGCTTCAAAATG
[0064] Zeo-R ：AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG
[0065] 選定畢赤酵母基因組上乙醇脫氫酶位點(diǎn)（Alcohol dehydrogenase)作為透明質(zhì)酸 酶整合位點(diǎn)。采用AMZ無痕操作技術(shù)，構(gòu)建整合片段（見附圖2)。先采用融合PCR技術(shù)，將 不同強(qiáng)度的三個啟動子GAP、TEFl和YPTl分別與LHyal基因進(jìn)行融合；在乙醇脫氫酶基因 兩端各取600bp左右的DNA片段作為同源重組的同源臂Arm-F和Arm-R,同時取Arm-R下游 約33bp的序列作為二次交換序列（DR)，融合于AMZ片段前端。最后，采取多次重疊 PCR技 術(shù)，按實(shí)施例2操作過程和附圖2所示順序，分別構(gòu)建完整的三個基因整合片段。此實(shí)施例 引物信息序列如下：
[0066] Arm-F-F ：AAATTTCTTAGAAGGGGCCCATCTAGTTAGCGAG
[0067] Arm-F (GAP) -R :CCAAGACATTTCTACAAAAACTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0068] Arm-F (TEFl) -R ：GATAAAAGAGGCGACAGTTATCTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0069] Arm-F (YPTl) -R ：TCCCCAGACTACTTCCTCCACCTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0070] Arm-R-F ：AAGGCTTTAATTTGCAAGCTACGGATCTTTCCAGCAGTATGCTACTG
[0071] Arm-R-R ：GAAACTCATTACATAAGACGTATACAAACTATTCG
[0072] ADPGAP-F ：GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC
[0073] ADPGAP-R ：GTCACCGCGATCTCTTTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0074] ADPTEFI-F :GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCG
[0075] ADPTEFI-R :GTCACCGCGATCTCTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0076] ADPYPTI-F ：GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGGTGGAGGAAGTAGTCTGGGGAGGTTG
[0077] ADPYPTI-R ：GTCACCGCGATCTCTTTCATATCGATGGGTAATGAGTCTTTTTGTG
[0078] ADLHyal (GAP) -F ：TGAACAACTATTTCGAAACGATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0079] ADLHyal (TEFl)-F ：CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0080] ADLHyal (YPTI)-F ：AAGACTCATTACCCATCGATATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0081] ADLHyal-R ：
[0082] GAAACTCATTACATAAGACGTATACAAACTATTCGGCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAGCAG
[0083] ADAMZ-F ：GCCGAATAGTTTGTATACGTCTTATGTAATGAGTTTCAACATCCAAAGACGAAAGGTTG
[0084] ADAMZ-R：ATACTGCTGGAAAGATCCGTAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG
[0085] 三個融合重組片段，制備濃度為500ng/y 1，電轉(zhuǎn)產(chǎn)HA重組宿主PAPTGS115,涂布 含有50ug/ul Zeocin的YPD平板，置于37°C培養(yǎng)2-3天，發(fā)生同源重組的菌落攜帶AMZ片 段，可以在此平板上生長。對長出的單菌落轉(zhuǎn)移至以1%甲醇為碳源（不含葡萄糖）的YPD 平板上，置于37°C培養(yǎng)2-3天。在此過程中，以DR序列發(fā)生第二次交換，使得AMZ片段丟 失，實(shí)現(xiàn)LHyal的無痕整合。若未發(fā)生二次交換，AMZ未丟失，AOX啟動子在甲醇誘導(dǎo)下表 達(dá)毒性蛋白mazF，使得宿主死亡。因此，在含甲醇的YH)平板上生長的菌為成功重組LHyal 的宿主，通過提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測序，該宿主改造成功，含有不同強(qiáng)度的三個啟動 子 GAP、TEFl 和 YPTl 的重組菌株分別命名為 GLHAGS115、TLHAGS115 和 YLHAGS115。
[0086] 實(shí)施例6重組畢赤酵母LHPAPTGS115菌株的搖瓶發(fā)酵
[0087] 分別挑取GLHAGS115、TLHAGS115和YLHAGS115重組菌單克隆接種于5ml YH)培 養(yǎng)基，置于200rpm3(TC過夜培養(yǎng)。按實(shí)施例4發(fā)酵過程操作：16h后接種于250ml三角搖 瓶（裝液量25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY :酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4, 11. 8g/L KH2PO4,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X l(T4g/L)，甘油 lml/L，添加 2g/L 的MgS04,葡萄糖濃度為5%。按I %的接種量轉(zhuǎn)接與BMGY搖瓶，置于200rpm30°C培養(yǎng)96h。
[0088] 收集發(fā)酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發(fā)酵液上清轉(zhuǎn)移置另一離心管中，力口 入3倍體積的無水乙醇充分混勻沉淀發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpm 下室溫離心20min，去除干凈液體，白色沉淀加入發(fā)酵液等體積的IM NaCl溶液充分溶解。 對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測HA酸含量，對照組為Pichia pastoris GS115同等條件下發(fā)酵液的回收物。經(jīng)測定GLHAGS115、TLHAGS115和YLHAGS115 重組菌株的HA產(chǎn)量分別為0. 59g/L、0. 53g/L和0. 43g/L。同時，對三株重組菌產(chǎn)生的HA的 分子量進(jìn)行測定，平均分子量分別41000、66500和110000道爾頓。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組畢赤酵母，其特征在于，是在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)了編碼透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA和UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD以獲得產(chǎn)透明質(zhì)酸的途徑，并偶聯(lián)分泌表達(dá)透明質(zhì) 酸酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，以畢赤酵母（Pichia pastoris) GS115為宿主。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述透明質(zhì)酸合酶編碼基因 hasA 來源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcus equi)或類馬鏈球菌（Streptococcus equissp) 〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述UDP-葡萄糖脫氫酶來 源于鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)或芽抱桿菌 (Bacillus)〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，hasA和tuaD分別由畢赤酵母組 成型強(qiáng)啟動子控制表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶來源于 水蛭，融合啟動子和信號肽后通過重組整合到畢赤酵母基因組進(jìn)行表達(dá)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶基因分別采用 不同強(qiáng)度的組成型啟動子控制表達(dá)，包括GAP、TEF1或YPT1。
8. -種構(gòu)建權(quán)利要求1-5, 7任一所述重組畢赤酵母的方法，主要包括以下步驟： (1) 構(gòu)建透明質(zhì)酸的合成途徑：將編碼透明質(zhì)酸合酶的基因 hasA與啟動子GAP融合， 將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD與啟動子TEF1融合，將兩個融合片段再融合后連接 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到含透明質(zhì)酸合成途徑的畢赤酵母； (2) 偶聯(lián)表達(dá)透明質(zhì)酸酶：將透明質(zhì)酸酶基因融合啟動子、信號肽后整合到步驟（1)所 得重組畢赤酵母的基因組中，獲得偶聯(lián)分泌表達(dá)透明質(zhì)酸酶的重組畢赤酵母。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟⑵信號肽采用α-因子信號肽，啟 動子采用GAP、TEF1或ΥΡΤ1。
10. -種應(yīng)用權(quán)利要求1-5,7任一所述重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)小分子透明質(zhì)酸或寡聚透 明質(zhì)酸的方法，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖作為碳源，在20-30°C，發(fā)酵48-96h。
【文檔編號】C12P19/26GK104263666SQ201410467076
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國成, 康振, 金鵬 申請人:江南大學(xué)