茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因Smk1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因Smk1及其應(yīng)用，本申請首次利用第二代SolexaHiSeq2000進(jìn)行茯苓的轉(zhuǎn)錄組測序及Denovo拼接，分析找到茯苓中編碼MAPK的候選基因Smk1并進(jìn)行體外克隆表達(dá)，獲得的基因序列為SEQIDNO.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQIDNO.2所示。將其通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在茯苓中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可加快茯苓菌核的形成及提高菌核產(chǎn)量。
【專利說明】茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smk1及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smk 1 (PcWSmk)，及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 藥用茯苓是指多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos (Schw. ) Wolf)的菌核，它是我國常 用的大眾藥材品種之一，具有極高的藥用價值和膳食營養(yǎng)價值，入藥能夠利水滲濕、益脾和 胃、寧心安神。由于茯苓特殊的生態(tài)習(xí)性，其菌核的生長發(fā)育主要依賴于對松木的寄生并吸 取其中的碳源、氮源以及其它一些必需的物質(zhì)，為探索不依賴松木資源的新栽培技術(shù)、精準(zhǔn) 調(diào)控菌核形成條件及提高產(chǎn)量，研究茯苓菌核形成相關(guān)基因的功能及作用機(jī)理具有重要意 義。
[0003] 絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK)是絲 / 蘇氨 酸蛋白質(zhì)激酶的一個大家族，廣泛存在于真核生物中。真核生物的MAPK通路由三級激酶組 成，通過級聯(lián)反應(yīng)將信號不斷放大并傳遞下去，MAPK是該級聯(lián)途徑的最后一個激酶，既可以 作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個環(huán)節(jié)繼續(xù)磷酸化下游的成分，又可以進(jìn)入細(xì)胞核激活轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào) 節(jié)基因表達(dá)，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用非常重要。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物病原真菌的生長、 發(fā)育和致病性調(diào)節(jié)方面占有非常重要的地位。PcWSmk基因?qū)儆贛APK信號通路中的一個基 因，在菌核形成起始階段的表達(dá)量達(dá)到最高，PcWSmk基因沉默菌株不能形成成熟的菌核。
[0004] 本申請首次利用第二代Solexa HiSeq2000進(jìn)行獲茶的轉(zhuǎn)錄組測序及De novo拼 接。分析找到茯苓中編碼MAPK的候選基因并進(jìn)行體外克隆表達(dá)，將其通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在茯 苓中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可加快茯苓菌核的形成及提高產(chǎn)量。
[0005] 在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的PcWSmk 基因及其氨基酸序列。此基因編碼的酶在茯苓菌核形成過程中有重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)，其序列為SEQ ID NO. 1所示。Smkl在菌核形成過程中具有必不可少的作用，該基因能夠加快茯苓菌核的 形成。
[0007] 本發(fā)明另一個目的是提供Smkl基因編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID N0. 2所不。
[0008] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供一種茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)在加 快茯苓菌核形成中的應(yīng)用，還包括增加藥用茯苓產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0010] 一種茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)(以下或稱PcWSmk基因），其制備方法 如下：
[0011] 以茯苓的 cDNA 作為模板，設(shè)計引物 P1 :5' ATGGAAGACCGAGCAGCGGCGACAA3' ；P2 : 5' TCATTGAGGCCGAGGGCGCGTCACT3' 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 條件如下：
[0012] 3min, 95 °C ;30s 94 °C ;and 30s 57 °C，lmin 72 °C 35 個循環(huán)；lOmin, 72 °C ; lmin, 25°C。
[0013] 最終獲得了 PcWSmk基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID N 0. 2所示。
[0014] 一種茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)在加快茯苓菌核形成（提高菌核產(chǎn) 量）中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程如下：
[0015] 將茯苓M(jìn)APK蛋白（SEQ ID NO. 2所示氨基酸）對應(yīng)的基因（優(yōu)選SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列）通過PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入茯苓原生質(zhì)中，然后按常規(guī)方式進(jìn)行茯苓 的接種及栽培，可獲得高產(chǎn)茯苓菌核的轉(zhuǎn)基因茯苓。
[0016] 本發(fā)明的所要保護(hù)的內(nèi)容還包括：
[0017] 編碼SEQ ID N0. 2所示氨基酸的核苷酸序列；優(yōu)選SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。
[0018] 含有本發(fā)明的茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)或其0RF序列的的重組載 體，如原核類載體，真核類表達(dá)載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括但不限于 PRS314 載體，PEXp3300, pBARGPEl, pAN7-l, pAN52-l, pBC-hygro。
[0019] 含有本發(fā)明的茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)全序列或其0RF序列的宿主 細(xì)胞，如含有上述的重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括但不限于大腸桿 菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞EA101，EA105, LBA4404、畢赤酵母。
[0020] 本發(fā)明的茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)的應(yīng)用，包括用所述的重組載體， 如植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；或者用所述的茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)全序 列或其0RF序列轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因生物體，包括煙草，擬南芥，酵母，竹節(jié)參發(fā)根。
[0021] 本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿 菌；常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 本發(fā)明所提供的茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)是首次從茯苓植物中克隆 制備所得，利用本發(fā)明的技術(shù)對茯苓等真菌進(jìn)行基因工程改造，通過轉(zhuǎn)基因來加快茯苓菌 核的生長速度，同時增加其產(chǎn)量。MAPK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)參與茯苓菌核的形成， 因此本發(fā)明為茯苓菌核形成的進(jìn)一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為茯苓RNA及cDNA克隆的PCR擴(kuò)增電泳圖。
[0025] 左圖Ml為菌核形成初期，M2為菌核形成期，M3為菌核成熟期；右圖為PcWSmkPCR 擴(kuò)增電泳圖。
[0026] 圖2為PcWSmk功能域預(yù)測分析示意圖。
[0027] 圖3為PcWSmk系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0028] 圖4為表達(dá)載體pRS314-PcWSmk構(gòu)建示意圖
[0029] 圖5為酶促反應(yīng)產(chǎn)物及酶活力檢測示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明所述方案如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所用試劑如未特別說明， 均購自生化商店。
[0031] 實(shí)施例1 :
[0032] 茯苓轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析
[0033] 1、樣品采集
[0034] 獲茶植株（Poria cocos (Schw. ) Wolf)來源于云南省和大別山區(qū)獲茶種植基地，取 其菌核立即置于液氮中速凍后，于-80°C冰箱中冷凍保存。
[0035] 2、茯苓總RNA的分離和檢測
[0036] 取獲茶（P. cocos)菌核樣品0. lg，在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉(zhuǎn)移至 1. 5ml離心管中，加入lmlTrizol，混勻，放置10分鐘后離心10分鐘，棄上清；加入200ul氯 仿，震動15秒，放置2-3分鐘；4°C，12000g離心15分鐘，，棄上清液400ul加入600ul異 丙醇，輕混后放置10分鐘；4°C，12000g離心10分鐘；棄上清，lml75%乙醇清洗；4°C，7500g 離心5分鐘；棄上清，lml75%乙醇清洗；棄上清，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于25-30ul蒸餾 水，用1. 0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定A260、A280比值 和濃度。置于_80°C冰箱備用。
[0037] 3、轉(zhuǎn)錄組測序
[0038] 用 oligo (dT)的磁珠從總 RNA 中富集 mRNA，接加入 fragmentation buffer 將 mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers)合成第一條cD ΝΑ鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase Η和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng) 過QiaQuick PCR試劑盒純化并被EB緩沖液洗脫之后進(jìn)行末端修復(fù)、加 poly (A)并連接測 序接頭，瓊脂糖凝膠電泳分離并選擇片段大小，PCR擴(kuò)增構(gòu)建測序文庫，利用第二代SOlexa HiSeq2000進(jìn)行RNA測序，及De novo拼接。
[0039] 4、候選基因初步篩
[0040] 通過G0注釋，Blast比對分析以及MEGA5. 0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3)等軟件分析 初步找到茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl的候選基因。
[0041] 實(shí)施例2:
[0042] 茯苓PcWSmk基因的克隆
[0043] 分析候選基因讀碼框范圍，以獲考：（Poria cocos (Schw. ) Wolf)全長cDNA 片段為模板，利用正向引物PI :5'ATGGAAGACCGAGCAGCGGCGACAA3' ；反向引物P2 : 5' TCATTGAGGCCGAGGGCGCGTCACT3'克隆候選基因全長序列，鏈接到克隆載體Τ0Ρ0 ΤΑ載體 上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a中，步驟如下：
[0044] a)從_80°C超低溫冰箱中取100 μ L感受態(tài)細(xì)胞懸液，解凍后置于冰上；
[0045] b)加入5 μ L連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min ;
[0046] c) 42°C熱激90s，迅速置冰上5min ;
[0047] d)向EP管中加入lmL LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37°C 200rpm 45min ;
[0048] e)搖菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培養(yǎng)箱過夜；
[0049] f)挑取單菌落于4mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜選 取陽性克隆送樣測序。
[0050] 至此獲得了茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0051] 實(shí)施例3:
[0052] Smkl基因的生物信息學(xué)分析
[0053] 本發(fā)明涉及的茯苓M(jìn)APK蛋白編碼基因 Smkl (PcWSmk)全長cDNA的長度為1068bp， 其序列為SEQ ID NO. 1所示，其中開放讀碼框位于l-1068bp，編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO. 2 所不。將獲茶全長 cDNA 序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn) 行核苷酸同源性檢索。該基因具有典型的MAPK和Protein-Kinase結(jié)構(gòu)域。如圖2和3。
[0054] 實(shí)施例4 :
[0055] PcWSmk基因功能的研究
[0056] 1、表達(dá)載體的構(gòu)建
[0057] 依據(jù)PcWSmk基因全長序列（SEQ ID NO. 1)的0RF，設(shè)計擴(kuò)增完整開放閱讀框的引 物，分別在正、反向引物上分別引入限制性酶切位點(diǎn)kpnl和salI，利用正向引物P1 :5'匹I ACCATGGAAGACCGAGCAGCGGCGACAA 3' ；反向引物 P2 :5, GTCGACTCATTGAGGCCGAGGGCGCGTCACT 3'進(jìn)行PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，擴(kuò)增片段為1080bp，TA克隆， 提取質(zhì)粒。以kpnl和sail酶切擴(kuò)增產(chǎn)物2小時，利用回收試劑盒（Takara公司，中國）純 化酶切產(chǎn)物。同時利用kpnl和sail酶在37°C下酶切pRS314載體2小時，加入5ul溴酚藍(lán) 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用試劑盒回收大小約4758bp的片段。
[0058] 二者經(jīng)連接酶在16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉 素的LB平板上篩選重組子。PCR檢測陽性菌斑，提取陽性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切 電泳鑒定，保存且有正確目標(biāo)的重組質(zhì)粒pRS314-PcWSmk用于表達(dá)轉(zhuǎn)化。該表達(dá)載體命名 為 pRS314-PcWSmk (圖 4)。
[0059] 2、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0060] 以pRS314-PcWSmk質(zhì)粒轉(zhuǎn)化部分酶解酵母宿主菌AB1380,培養(yǎng)5天后篩選陽性酵 母于21111含2%葡萄糖的舊1培養(yǎng)基上，4-5天后挑取單克隆21111舊1液體培養(yǎng)基中，301： 劇烈震蕩培養(yǎng)過夜。5000rpm離心培養(yǎng)5min，棄上清，以含2%葡萄糖的USM液體培養(yǎng)基稀 釋20倍，30°C劇烈震蕩培養(yǎng)24h。提取培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白。選取高表達(dá)轉(zhuǎn)化子以50ml含2% 葡萄糖的USM液體培養(yǎng)基30°C劇烈震蕩培養(yǎng)20h后，接種到1L不含葡萄糖的USM液體培養(yǎng) 基30°C劇烈震蕩培養(yǎng)40h，回收菌體，分離微粒體，純化蛋白。
[0061] 3、酶促反應(yīng)鑒定
[0062] 在菌核形成培養(yǎng)的蛋白質(zhì)提取物中，用抗磷酸化后的ERK(MAPK家族中的一種）抗 體pERK(E-4)(與Smkl和EPK高序列相似）分析其MAPK的磷酸化，以此來測定MAPK的活 性。研究結(jié)果（圖5)表明，在菌核生產(chǎn)起始階段有明顯的特定磷酸化以及大幅度的磷酸 化增加。
[0063] 收集茯苓菌絲培養(yǎng)物，并立即在液氮中冷凍，用研缽和研杵研磨成細(xì)粉末，懸浮于 提取緩沖液（50%甘油，20mM的Tris-鹽酸，pH為7.5，lmM的EDTA，0.1mM的二硫蘇糖醇， 50mM的氟化鈉，0. 2mM的苯基甲基磺酰氟）。冰浴10分鐘后，10000g離心10分鐘，取上清 液。細(xì)胞裂解液的蛋白濃度用Bradford蛋白測定法定量。為了檢測磷酸化的和總ERK型 的MAPK，對相同數(shù)量的細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (10% )，印跡到硝酸纖維素膜上，并按照制造商的指導(dǎo)用相應(yīng)的抗體探測。
[0064] 圖5中，上圖表明Smkl在菌核形成初期的表達(dá)量最高。下圖表明在菌核形成初期 有明顯的特定磷酸化以及大幅度的磷酸化增加，這說明在菌核形成初期MAPK被激活。
[0065] 實(shí)施例5 :
[0066] Smkl基因在加快茯苓菌核形成和/或增加菌核產(chǎn)量中的應(yīng)用：
[0067] 通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)將茯苓Smkl基因 （SEQ ID NO. 1所示）轉(zhuǎn)入茯苓原生質(zhì)中， 獲得過表達(dá)茯苓Smkl基因的原生質(zhì)體，然后按常規(guī)方式進(jìn)行茯苓的接種及栽培，可獲得高 產(chǎn)茯苓菌核的轉(zhuǎn)基因茯苓。
[0068] 具體應(yīng)用過程如下：
[0069] 1.表達(dá)載體的構(gòu)建
[0070] 依據(jù)PcWSmk基因全長cDNA序列（SEQ ID NO. 1)的0RF，在擴(kuò)增編碼區(qū)的正反方向 引物引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)Apal和XBal，正向引物序列：5' -GGGCCCATGGAAGACCGAGCA GCGGCGACAA-3' ；反向引物序列:5, -TCTAGATCATTGAGGCCGAGGGCGCGTCACT-3,。以茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf)全長cDNA片段為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增片段大 約為1080bp。用Apal和XBal 37°C酶切擴(kuò)增產(chǎn)物3h，利用回收試劑盒（Takara公司，中國） 純化酶切產(chǎn)物，并將酶切產(chǎn)物連接到超表達(dá)載體PEXP3300上（該載體以pCAMBIA3300為 模板，以靈芝的磷酸脫氫酶基因的啟動子（NCBI Access ion:DQ404345. 1)替代原載體上的 CaMV 35S啟動子，并將篩選用的潮霉素 hygromycin基因克隆至該載體上即得）。PCR擴(kuò)增 檢測目的片段，進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證，保存且有正確目標(biāo)的重組質(zhì)粒用于表達(dá)轉(zhuǎn)化。該表達(dá) 載體命名為pEXP-PcWSmk。
[0071] 2.茯苓原生質(zhì)體制備：
[0072] (1)在250ml三角瓶中裝入lOOmlPDB液體培養(yǎng)基，接入茯苓菌絲碎片，于28°C， 150rmp 搖培 2-3 天；
[0073] (2)用三層滅菌擦鏡紙過濾收集菌絲，再用0. 6M甘露醇溶液沖洗菌絲至團(tuán)狀后， 轉(zhuǎn)至滅菌的50ml離心管中，加入溶壁酶溶液（lg溶壁酶溶解到50ml的0. 6M甘露醇溶液中， 依照每g菌絲加入lml的溶壁酶溶液計算），于30°C，80rmp酶解2. 5-3小時；
[0074] (3)酶解后經(jīng)三層滅菌擦鏡紙過濾，用0. 6M甘露醇溶液反復(fù)沖洗，收集濾液，于 4°C，3000rmp離心15分鐘（或者不過濾直接離心）；棄上清，沉淀用5mlMTC(0. 6M甘露醇； 10mMTris-HCl，pH7. 5 ;50mM 氯化鈣）溶液重懸；
[0075] (4)4°C，3000rmp離心15分鐘，得到的沉淀即為原生質(zhì)體；用300ulMTC溶液將原 生質(zhì)體溶解并鏡檢原生質(zhì)體數(shù)目，將原生質(zhì)體濃度調(diào)至1X 1〇8個/ml，即可用于轉(zhuǎn)化（制得 的原生質(zhì)體中加 DMS0,使DMS0的濃度為10%，混勻后可于-80°C長期保存）。
[0076] 3. PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：
[0077] (1)將原生質(zhì)體分裝到滅菌的50ml離心管中，每管為150ul。加入超表達(dá)載體 pEXP-Pc WSmk (依照每管加入2ug質(zhì)粒計算），補(bǔ)足MTC至每管300ul，冰上放置20分鐘；
[0078] (2)逐滴加入 2mlPTC(6〇% PEG335〇 或 PEG4000、10mMTris-HCl，pHL 5 ;5〇mM 氯化 鈣）溶液，冰上靜置20分鐘；
[0079] (3)每管加入30ml 預(yù)冷的MTC(0. 6M甘露醇；10mMTris-HCl，pH7. 5 ;50mM氯化鈣）， 混勻，3000rmp，4°C離心15分鐘；
[0080] (4)棄上清，每管加入3ml液體再生培養(yǎng)基，28°C靜置培養(yǎng)2-3天；
[0081] (5)將培養(yǎng)物倒入培養(yǎng)皿中，加入約10ml固體再生培養(yǎng)基（冷卻至50 °C 左右），混勻。待其凝固后，上面再鋪約l〇ml的固體再生培養(yǎng)基（含篩選用的潮霉 素 hygr〇mycin，20yg/mL)，3-4天后觀察茯苓的生長狀況，能生長出的菌落即為轉(zhuǎn) 化子，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行熒光定量PCR，引物P1 :5' -ATGGAAGACCGAGCAGCGGCGACAA-3'， P2 :5' -TCATTGAGGCCGAGGGCGCGTCACT-3'，以茯苓 18S rRNA 基因?yàn)閮?nèi)參（Prl : 5' -GCCGTTCTTAGTTCGTGGAT-3'，Pr2 :5' -TCGCTGGCTCTGTCAGTGTAG-3'），擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ? 預(yù)變性l〇min，95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所獲 得的轉(zhuǎn)化子中，與未轉(zhuǎn)基因的野生型茯苓相比，Smkl基因的表達(dá)量顯著升高。
[0082] 液體再生培養(yǎng)基：每L培養(yǎng)基中200g 土豆，20g葡萄糖，lg蛋白胨，lg酵母，0. 6M 甘露醇。
[0083] 固體再生培養(yǎng)基：每L培養(yǎng)基中200g 土豆，20g葡萄糖，lg蛋白胨，lg酵母，0. 6M 甘露醇；每200ml中加入2g瓊脂。
[0084] 將生長出的轉(zhuǎn)化子接種到松木培養(yǎng)基上，觀察其菌核生長情況。
[0085] 4.按照常規(guī)方式，對轉(zhuǎn)化子和未轉(zhuǎn)基因?qū)σ吧瓦M(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌核生長情況，本 發(fā)明采取以下方式：
[0086] 具體如下：
[0087] 小松木段片裝瓶（塑料）消毒，加適量培養(yǎng)基TOB，接上原生質(zhì)體所形成的菌絲，在 瓶內(nèi)長出白色旺盛的菌絲，用鑷子將瓶內(nèi)長有菌絲的松木段片取出，接種到松木上進(jìn)行栽 培。設(shè)置3個實(shí)驗(yàn)組。同時將不含pEXP-PcWSmk載體的茯苓菌絲作為對照組，接種到松木 上進(jìn)行栽培。設(shè)置3個對照組。
[0088] 結(jié)果：3個對照組菌核形成時間平均為100天。3個實(shí)驗(yàn)組的菌核形成時間明顯縮 短，平均為65天。6個月后，3個實(shí)驗(yàn)組的菌核重量是對照組重量的1. 5倍。
[0089] PDB培養(yǎng)基：每L培養(yǎng)基中200g 土豆，20g葡萄糖，lg蛋白胨，lg酵母。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有權(quán)利要求2所述核苷酸的載體。
5. 含有權(quán)利要求4所述載體的茯苓原生質(zhì)體。
6. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的核苷酸在提高茯苓菌核產(chǎn)量中的應(yīng) 用。
7. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的核苷酸在加快茯苓菌核形成中的應(yīng) 用。
8. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的核苷酸在同時提高茯苓菌核產(chǎn)量和加 快茯苓菌核形成中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/63GK104195120SQ201410467727
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】朱聞君, 汪琪, 趙小龍, 湯進(jìn), 陳平, 楊濤, 張紹鵬, 李長玲, 鄧琛 申請人:朱聞君, 汪琪, 趙小龍, 湯進(jìn), 陳平, 張紹鵬, 楊濤, 李長玲, 鄧琛, 霍夢蕊