用于具有3’-5’外切活性的核酸酶檢測(cè)的硫代探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有3’-5’外切活性的核酸酶檢測(cè)的硫代探針。該硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其環(huán)部為單鏈結(jié)構(gòu)，由4-8個(gè)核苷酸殘基組成，而莖部則由8-15對(duì)核苷酸殘基組成，該探針每兩個(gè)堿基之間的磷酸二酯鍵全部硫酰化，只有3’末端的堿基與其上標(biāo)記的熒光基團(tuán)之間連接的磷酸基團(tuán)不硫酰化，猝滅基團(tuán)標(biāo)記在3’→5’第四個(gè)堿基上。本發(fā)明可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸外切酶活性、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、成本低、準(zhǔn)確可靠的分析方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的諸多局限。
【專利說明】用于具有3' -5'外切活性的核酸酶檢測(cè)的硫代探針
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2013年6月17日，申請(qǐng)?zhí)枮?01310239614. 0的發(fā)明專利申請(qǐng) "硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針及其在核酸酶檢測(cè)中的應(yīng)用"的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及核酸酶的檢測(cè)，更具體地，涉及硫代（硫?；┬揎椆丫酆塑账釤晒馓?針，以及利用該熒光探針對(duì)實(shí)際生物體系中具有3' -5'外切活性的核酸酶進(jìn)行檢測(cè)。

【背景技術(shù)】
[0003] DNA是生命體遺傳信息的載體，核酸酶確保了基因復(fù)制的準(zhǔn)確性和遺傳的穩(wěn)定性。 核酸酶廣泛存在于生物體系。核酸與核酸酶之間的相互作用是傳遞遺傳信息的重要過程， 包括復(fù)制，重組和修復(fù)。不正常的酶活動(dòng)通常會(huì)導(dǎo)致疾病，核酸酶組學(xué)研究的更重要的意義 在于疾病的診斷和藥物的研發(fā)。因此，發(fā)展靈敏度高且選擇性強(qiáng)的檢測(cè)核酸酶的技術(shù)成為 現(xiàn)代分子生物學(xué)和藥物研發(fā)的一項(xiàng)重要任務(wù)。
[0004] 對(duì)于核酸酶的檢測(cè)分析，傳統(tǒng)方法一般是利用凝膠電泳、液相色譜等手段來分析 核酸酶與底物反應(yīng)后的產(chǎn)物，這些方法都操作繁瑣，無法快速、方便地獲取分析結(jié)果，而且 通常還需要采用放射性元素標(biāo)記，對(duì)環(huán)境不友好。另外，酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA)也被 用于酶切反應(yīng)的研究。但是這種方法需要大量的時(shí)間來制備抗體，而且很難發(fā)展成為均相 檢測(cè)體系。近幾年來，利用熒光核酸探針來檢測(cè)核酸酶在該領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。這種探 針具備實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸酶活性的能力，免除放射性標(biāo)記，而且由于是熒光方法，所以靈敏度一 般比傳統(tǒng)方法要高。這種探針的工作原理主要是通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移對(duì)目標(biāo)DNA與核酸 酶反應(yīng)前后體系熒光的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)。這種探針的結(jié)構(gòu)類似于分子信標(biāo)（Molecular Beacon)-呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的短鏈DNA，一端標(biāo)記突光基團(tuán)，一端標(biāo)記粹滅基團(tuán)。在進(jìn)行核酸酶 活性分析中，探針與核酸酶相互作用導(dǎo)致分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而由熒光信號(hào)實(shí)時(shí) 指示核酸酶的動(dòng)力學(xué)作用過程。但是由于很多復(fù)雜的生物體系有多種核酸酶共存，這種分 子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的探針可以與多種核酸酶同時(shí)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致很難找出目標(biāo)酶的信號(hào)。雖 然我們可以通過設(shè)計(jì)對(duì)照探針來區(qū)分假陽性信號(hào)，但這樣會(huì)大大降低探針的靈敏度，而且 如果目標(biāo)酶的含量低，采用對(duì)照探針也達(dá)不到區(qū)分的目的。在這種情況下，往往還是需要對(duì) 酶反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行分析，這樣不僅增加了設(shè)計(jì)成本和工作量，而且喪失了熒光核酸探針的 檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。因此，迫切需要開發(fā)出靈敏度高、選擇性好、快速、實(shí)時(shí)、成本低、準(zhǔn)確可靠的核酸 酶實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸外切酶活性、選擇性好、靈敏度高、 速度快、成本低、準(zhǔn)確可靠的分析方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的諸多局限。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，利用硫代核酸骨架對(duì)核酸酶的抑制作用，設(shè)計(jì)硫代修飾寡 聚核苷酸熒光探針，來實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸外切酶的特異性檢測(cè)。這些探針的信號(hào)產(chǎn)生是依賴于熒 光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)作用。在沒有目標(biāo)酶存在時(shí)，熒光基團(tuán) 與猝滅基團(tuán)靠近，熒光處于猝滅狀態(tài)。當(dāng)目標(biāo)酶與熒光探針發(fā)生反應(yīng)時(shí)，探針結(jié)構(gòu)發(fā)生變 化，導(dǎo)致兩個(gè)基團(tuán)分離，從而熒光恢復(fù)。
[0007] 所謂硫代核酸骨架是指：DNA的磷酸二酯鍵中的(Γ被取代。核酸酶與DNA的反 應(yīng)一般都包含磷酸二酯鍵的水解，水解機(jī)理涉及到游離水分子的氧進(jìn)攻DNA的磷酸二酯鍵 中的磷。當(dāng)這種硫代骨架存在時(shí)，由于磷酸二酯鍵中的磷的電負(fù)性發(fā)生變化，親電能力變 差，因此酯鍵在核酸酶的存在下不能被水解。而DNA中未硫酰化的部分仍然可以被相應(yīng)的 核酸酶水解。利用這一性質(zhì)，我們針對(duì)不同的核酸外切酶的性質(zhì)，設(shè)計(jì)優(yōu)化了部分硫?；?三種探針分別用于對(duì)三類核酸外切酶進(jìn)行特異性檢測(cè)。
[0008] 由于大部分核酸酶都識(shí)別DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了硫代修飾的自雜交發(fā)夾 型雙標(biāo)記探針（簡稱硫代探針），其中環(huán)部為單鏈結(jié)構(gòu)，由4-8個(gè)核苷酸組成，而莖部結(jié)構(gòu) 較長，由8-15對(duì)核苷酸組成，以利于核酸酶的識(shí)別和水解作用。根據(jù)待測(cè)核酸外切酶的 活性功能設(shè)計(jì)分為非限制性核酸內(nèi)切酶探針、核酸外切酶探針和脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)（AP site)內(nèi)切酶探針三種設(shè)計(jì)（參見圖1):
[0009] 1)非限制性核酸內(nèi)切酶探針
[0010] 非限制性核酸內(nèi)切酶可以作用于單鏈DNA、雙鏈DNA、染色質(zhì)和RNA = DNA雜交鏈， 切割DNA產(chǎn)生二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸產(chǎn)物。本發(fā)明中所使用的非限制性內(nèi)切酶是 DNasel，這種酶與DNA作用產(chǎn)生3'羥基和5'磷酸末端。這種酶的特點(diǎn)是不依賴DNA的特 定序列對(duì)DNA進(jìn)行降解。如果核酸中含有人為設(shè)計(jì)的硫代核酸骨架，則DNase I從那些非 硫?；牟糠珠_始降解。
[0011] 針對(duì)上述特點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的非限制性核酸內(nèi)切酶探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷 酸，環(huán)部有5個(gè)堿基，莖部有10對(duì)堿基。從5'端部開始有六個(gè)堿基之間為硫?；姿岫?鍵，從3'端開始有七個(gè)堿基之間為硫?；姿岫ユI。
[0012] 該探針在3'和5'分別引入硫?；姿峁羌苤荚诜乐购怂嵬馇忻傅倪M(jìn)攻，從而對(duì) 非限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行特異性識(shí)別。該探針的熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在5' 一 3'第五個(gè)堿基 上，猝滅基團(tuán)BHQl標(biāo)記在3'一 5'第六個(gè)堿基上，探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)后，兩個(gè)基團(tuán)相互靠近， 導(dǎo)致熒光粹滅。
[0013] 該探針與DNase I反應(yīng)時(shí)，非硫酰化部分的磷酸二酯鍵被水解，導(dǎo)致環(huán)部和莖部結(jié) 構(gòu)被破壞。雖然熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)所在堿基并沒有被水解，但是由于六對(duì)堿基在室溫下 不能保持互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，從而兩個(gè)基團(tuán)分離，熒光恢復(fù)。這種探針可用于多種非限制性核酸內(nèi)切 酶的檢測(cè)，不受其他類型的核酸酶的干擾。
[0014] 2)核酸外切酶探針
[0015] 具有3' -5'或5' -3'外切活性核酸酶在維持基因穩(wěn)定性方面發(fā)揮非常重要的 作用。這類酶從核酸的末端逐步切去單核苷酸。每次酶與底物結(jié)合催化，有幾個(gè)核苷 酸被切除掉，從而在DNA分子群內(nèi)產(chǎn)生漸進(jìn)缺失。本發(fā)明中使用代表酶是核酸外切酶 III (Exonuclease III)。
[0016] 針對(duì)上述特點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸，環(huán)部有4個(gè)堿基， 莖部有8對(duì)堿基。為了防止這種探針被非限制性核酸內(nèi)切酶降解，探針每兩個(gè)堿基之間的 磷酸二酯鍵全部硫?；?，只有3'末端的堿基與其上標(biāo)記的熒光基團(tuán)之間連接的磷酸基團(tuán)不 硫酰化。這一磷酸酯結(jié)構(gòu)作為Exonuclease III的識(shí)別位點(diǎn)。粹滅基團(tuán)標(biāo)記在3' 一 5'第 四個(gè)堿基上，從而熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)靠近，熒光處于猝滅狀態(tài)。
[0017] 當(dāng)探針與酶反應(yīng)時(shí)，上述未硫酰化的磷酸酯鍵被水解，熒光基團(tuán)離開探針，從而熒 光恢復(fù)。這種探針能夠避免非限制性核酸內(nèi)切酶和5' -3'方向核酸外切酶的干擾。同時(shí)， 由于該磷酸酯鍵外有熒光基團(tuán)保護(hù)，去磷酸酶也不能使這一探針產(chǎn)生信號(hào)。這種探針可用 于多種具有3' -5'外切活性的核酸酶的檢測(cè)。
[0018] 3)脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)（AP site)內(nèi)切酶探針
[0019] DNA容易受到外界因素如射線和化學(xué)試劑等的影響，從而產(chǎn)生DNA損傷。一旦產(chǎn) 生損傷，DNA就容易在復(fù)制過程中產(chǎn)生突變。為了防止這種突變，生命體存在著基因修復(fù)響 應(yīng)機(jī)制。具有脫嘌呤/脫嘧啶（AP)內(nèi)切活性的核酸酶在基因修復(fù)過程中起到重要的作用。 本發(fā)明中選用的內(nèi)切酶為核酸內(nèi)切酶IV (Endonuclease IV)和人脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切 酶（Human AP Endonuclease，簡稱ΑΡΕΙ)。這兩種酶都水解DNA上的完整AP位點(diǎn)，切割A(yù)P 位點(diǎn)5'端的第一個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3'羥基和5'脫氧核糖磷酸末端。其他常見的AP內(nèi) 切酶包括Apnl和有AP切割活性的Exonuclease等。
[0020] 針對(duì)上述特點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針為具有AP位點(diǎn)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸，環(huán) 部有8個(gè)堿基，莖部有15對(duì)堿基。為了防止非限制性核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的干擾，我 們將除AP位點(diǎn)5'以外的磷酸二酯鍵全部硫?；＞唧w標(biāo)記位置是：AP位點(diǎn)在5' 一 3'第 八個(gè)堿基、熒光基團(tuán)在5' 一 3'第三個(gè)堿基、猝滅基團(tuán)在3' 一 5'第二個(gè)堿基。探針形成自 雜交的發(fā)夾結(jié)構(gòu)后，熒光猝滅。內(nèi)切酶與探針反應(yīng)時(shí)，未硫?；牧姿岫ユI被水解，帶有 熒光基團(tuán)的7個(gè)堿基片段離開探針，熒光恢復(fù)。由于探針只有一個(gè)可供DNase切割的位點(diǎn)， DNase識(shí)別困難，所以這種探針與DNase反應(yīng)不產(chǎn)生信號(hào)。
[0021] 本發(fā)明中的熒光基團(tuán)可以選擇FAM、TAMRA、Cy3和Cy5等常用的熒光基團(tuán)，猝滅基 團(tuán)一般選擇猝滅能力強(qiáng)的BHQ系列，如BHQl或BHQ2。
[0022] 如本文所用，下列詞語/術(shù)語具有下列含義，除非另外說明。
[0023] "DNA" ：脫氧核糖核酸；
[0024] "磷酸二酯鍵":兩個(gè)核苷酸分子核苷酸殘基的兩個(gè)羥基分別與同一磷酸基團(tuán)形成 的共價(jià)連接鍵；
[0025] "硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針"（簡稱硫代探針）：具有自雜交結(jié)構(gòu)的寡核苷酸 序列，探針中的部分磷酸二酯鍵中的非橋氧原子被硫原子取代。
[0026] 本發(fā)明可快速準(zhǔn)確地對(duì)三類重要的核酸酶的活性進(jìn)行分析，具有高靈敏度和高選 擇性。如果結(jié)合多通道實(shí)時(shí)熒光儀器，可以實(shí)現(xiàn)高通量地對(duì)樣品中酶組成的分析。本方法 不僅操作簡便，而且設(shè)計(jì)合成成本較低。利用本方法，可以對(duì)于核酸酶與DNA相互作用的特 點(diǎn)和機(jī)理進(jìn)行深入研究。另外，由于本方法具有高選擇性和高靈敏度，可以對(duì)復(fù)雜生物樣品 中的酶組成進(jìn)行分析和研究，也可以用于細(xì)胞中酶的原位熒光成像。本方法在疾病診斷、藥 物篩選、細(xì)胞分子生物學(xué)研究等方面均有很高的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明具有明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù) 的優(yōu)點(diǎn)，其主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0027] (1)反應(yīng)與檢測(cè)的高選擇性，有利于抑制假陽性信號(hào)。本發(fā)明通過將探針的部分磷 酸二酯鍵硫酰化來提高探針對(duì)目標(biāo)酶的特異性。針對(duì)目標(biāo)酶的特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)可供其催化 水解的磷酸二酯鍵。而其他非目標(biāo)酶由于硫酰化磷酸二酯鍵的存在，不與探針反應(yīng)。
[0028] (2)高靈敏度，有利于樣品中低含量酶的分析。本發(fā)明所有探針中都采用了自雜 交的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣使得熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離很近，熒光猝滅效率提高，降低了檢測(cè)背 景。另外，探針與酶反應(yīng)后的產(chǎn)物均是攜帶有熒光基團(tuán)的小片段離開探針，與猝滅基團(tuán)徹底 分離，熒光恢復(fù)效果好。
[0029] (3)檢測(cè)窗口多樣性，可用于多通道對(duì)多種酶進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。由于本發(fā)明是利用熒 光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生信號(hào)，所以可以更改探針熒光基團(tuán)的標(biāo) 記種類，使得不同的酶對(duì)應(yīng)不同窗口下的熒光信號(hào)。這對(duì)復(fù)雜生物樣品和細(xì)胞成像提供了 有利手段。
[0030] (4)在實(shí)際生物樣品檢測(cè)和細(xì)胞中酶的原位成像方面表現(xiàn)良好。基于高選擇性和 高靈敏度兩大優(yōu)點(diǎn)，本方法中的探針能夠在少量目標(biāo)酶和大量非目標(biāo)酶的共存的體系中檢 出目標(biāo)酶的信號(hào)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1是本發(fā)明硫代修飾寡核苷酸熒光探針的檢測(cè)模式示意圖。
[0032] 圖2是針對(duì)非限制性核酸內(nèi)切酶的硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針對(duì)Hela細(xì)胞中 的酶進(jìn)行原位熒光成像的結(jié)果。
[0033] 圖3是針對(duì)核酸外切酶的硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針對(duì)Hela細(xì)胞中的酶進(jìn)行 原位熒光成像的結(jié)果。
[0034] 圖4是針對(duì)脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)內(nèi)切酶的硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針對(duì)Hela 細(xì)胞中的酶進(jìn)行原位熒光成像的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖，通過具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 實(shí)施例1〈非限制性核酸內(nèi)切酶DNase I活性分析〉
[0037] 在該實(shí)施例中，使用硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針1進(jìn)行非限制性核酸內(nèi)切酶 DNase I活性的檢測(cè)并與其他酶產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行比較。
[0038] 具體步驟如下：
[0039] 1.硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針1起始時(shí)的熒光信號(hào)為猝滅狀態(tài)，分別與不同濃 度的DNase I混合置于合適的溶液條件中形成反應(yīng)體系。探針非硫?；糠值牧姿岫ユI 在DNase I的催化下被水解為小片段，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)被釋放，通 過實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，被水解的探針增多，熒光信號(hào)快速增強(qiáng)，直 到反應(yīng)平衡，熒光強(qiáng)度達(dá)到平臺(tái)值。
[0040] 2.硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針1起始時(shí)的熒光信號(hào)為猝滅狀態(tài)，分別與其他酶 混合置于合適的溶液條件中形成反應(yīng)體系。探針1沒有其他非目標(biāo)酶的可及位點(diǎn)，熒光信 號(hào)無明顯上升。
[0041] 在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)的硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針1序列如下：
[0042] 5J -C*A*A*C*T*ACATCACTCGGATG*T*A*G*T*T*G-3?
[0043] *表示硫酰化磷酸二酯鍵，粗體字母分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。
[0044] 不同DNase I的50 μ L反應(yīng)體系：硫代修飾寡聚核苷酸熒光探針1濃度為200nM
[0045] PCR方案是：37°C 1250秒，每5s檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，熒光增益值設(shè)定為10。
[0046] 檢測(cè)時(shí)使用的檢測(cè)儀器為Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光PCR儀，激發(fā)波長為470nm，發(fā)射 波長為510nm。
[0047] 檢測(cè)結(jié)果：
[0048] 在反應(yīng)前200s，熒光上升速率隨著DNase I濃度由低到高逐漸增加，酶濃度高于 2. 4U/ml的體系在5min即達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，熒光信號(hào)趨于穩(wěn)定；反應(yīng)20min后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 歸一化數(shù)據(jù)如下表所示：
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于具有3' -5'外切活性的核酸酶檢測(cè)的硫代探針，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其環(huán)部為 單鏈結(jié)構(gòu)，由4-8個(gè)核苷酸殘基組成，莖部由8-15對(duì)核苷酸殘基組成，該探針每兩個(gè)堿基之 間的磷酸二酯鍵全部硫?；?，只有3'末端的堿基與其上標(biāo)記的熒光基團(tuán)之間連接的磷酸基 團(tuán)不硫?；?，猝滅基團(tuán)標(biāo)記在3' 一 5'第四個(gè)堿基上。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于具有3' -5'外切活性的核酸酶檢測(cè)的硫代探針，其特征在 于，所述具有3' -5'外切活性的核酸酶包括核酸外切酶III。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于具有3' -5'外切活性的核酸酶檢測(cè)的硫代探針，其特征在 于，所述熒光基團(tuán)選自FAM、TAMRA、Cy3或Cy5,所述猝滅基團(tuán)選自BHQ1或BHQ2。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293917SQ201410468748
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月17日
【發(fā)明者】趙美萍, 蘇昕, 張晨, 柳楊, 肖先金 申請(qǐng)人:北京大學(xué)