用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因，其DNA序列為SEQIDNo.1。制備方法是：首先，從綠色巴夫藻中分離獲得綠色巴夫藻的基因組DNA；接著，以綠色巴夫藻的基因組DNA為模板，根據(jù)去飽和酶基因保守組氨酸框的序列設(shè)計簡并引物，從而擴增得到保守區(qū)基因；接下來，分別對其5’末端和3’末端進(jìn)行染色體歩移獲得全基因序列，通過普通PCR的方法獲得基因全長。該基因的獲得為進(jìn)一步認(rèn)識和利用極有現(xiàn)實意義的DHA合成過程提供了依據(jù)。
【專利說明】用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因及 制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因克隆分離【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及于一種來源于真核微藻的有關(guān)多不 飽和脂肪酸合成的去飽和酶基因及其分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營養(yǎng)物質(zhì)，真核微藻因富含多不飽和脂肪酸 而成為重要的生物資源。綠色巴夫藻（Pavlova viridis)含有豐富的EPA (二十碳五烯酸） 與DHA (二十二碳六烯酸)，該微藻是進(jìn)行多不飽和脂肪酸相關(guān)合成基因識別與克隆的良好 實驗材料。
[0003] SEFA-PCR全稱self-formed adaptor PCR，是一種通過引物"回頭"形成適配子的 方式來完成染色體行走的一種PCR技術(shù)。與其他如反向PCR等技術(shù)相比，SEFA-PCR具有擴 增片段長、可靠性高、無需酶切連接步驟等優(yōu)點。SEFA-PCR在擴增長未知DNA片段時尤其有 效。SEFA-PCR全程需要三個引物的參與，分別是SP1，SP2和SP3。其中SP1和SP2是退火 溫度較高的特異性引物，而SP3則是一個從5'到3'末端分別含有15個特異性堿基、9個隨 機堿基與6個特異性堿基的部分兼并引物。
[0004] S0E全稱Splicing by overlap extension,是一種不受酶切位點限制通過聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得基因拼合的方法。其原理是進(jìn)行兩端擴增的引物本身有一部分是反向互補 的，通過大片段互為引物擴增的方式來獲得經(jīng)過拼合后的基因全長。S0E方法的優(yōu)點是簡單 快捷，缺點是容易引入錯配堿基，需要重復(fù)實驗確認(rèn)拼接結(jié)果。
[0005] 在真核微藻的DHA的體內(nèi)合成途徑中，起到最關(guān)鍵作用的是多不飽和脂肪酸去飽 和酶和多不飽和脂肪酸延伸酶兩大酶類。但由于其為與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的膜蛋白，上述酶類在 分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta-5去飽和酶是合成二十碳五烯酸EPA的最 后一個關(guān)鍵酶，其在合成途徑中的地位是極為重要的。目前在真核微藻中已經(jīng)有數(shù)個來自 于不同物種的delta-5去飽和酶獲得了分離和識別，但不同物種的同源酶顯然都存在序列 上和結(jié)構(gòu)上的差異，進(jìn)而導(dǎo)致其酶活性和功能的不同。因此，從綠色巴夫藻中分離得到其 delta-5去飽和酶的同源酶是對該部分研究資源的很好補充，本發(fā)明就試圖從這個角度展 開相關(guān)的工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因 及制備方法。
[0007] 用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的DNA序列為SEQ ID No. 1。
[0008] 制備所述的綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的具體操作步驟如下： 首先，從綠色巴夫藻中分離獲得綠色巴夫藻的基因組DNA ;接著，以綠色巴夫藻的基因 組DNA為模板，根據(jù)去飽和酶基因保守組氨酸框的序列設(shè)計簡并引物P3F和P3R，從而擴增 得到保守區(qū)基因；接下來，分別對其5'末端和3'末端進(jìn)行染色體歩移獲得全基因序列，通 過普通PCR的方法獲得基因全長。
[0009] 本發(fā)明首次從綠色巴夫藻的基因組中分離獲得了推定的多不飽和脂肪酸delta-5 去飽和酶基因，豐富了該類酶的重要的基因資源，為進(jìn)一步研究該酶的體內(nèi)和體外的作用 機制奠定了基礎(chǔ)。
[0010] 綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因可直接應(yīng)用于多不飽和脂肪酸EPA的合成，為 通過分子生物學(xué)手段體外合成EPA這種重要的營養(yǎng)物質(zhì)提供了最關(guān)鍵的基因元件，其在畢 赤酵母中的異源表達(dá)和轉(zhuǎn)化實驗如下： 為驗證上述delta-5去飽和酶基因的功能，以所提mRNA為模板利用〇1 igo dT Primer :5' -oligod(T) 15GTAAAACGACGGCCAGT-3' 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈，并以之作為克 隆delta-5表達(dá)基因的模板。隨后根據(jù)獲得的delta-5全長基因的序列，分別設(shè)計上游引 物 TAGGATTCATGGCTCCGCGCGACGCTTACACG 和下游引物 AAGCGGCCGCTTAGTGCTTGTGCTCGTGCAC G，并以 94oC 3 min;94oC 30 s, 60〇C 30 s, 72oC 1.5 min，30 個循環(huán)；72oC 10 min 的 PCR條件擴增獲得表達(dá)基因片段。隨后通過本領(lǐng)域常用的亞克隆手段將該片段連接到載體 pPIC3. 5k，得到畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3. 5k-delta-5，隨后將該質(zhì)粒與空載體分別電轉(zhuǎn) 化入畢赤酵母中得到GS115-5和GS115-pPIC3. 5K。挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種到裝有5mlBMGY液 體培養(yǎng)基的試管中，29〇C，180rpm搖床培養(yǎng)過夜。然后吸取500μ1過夜培養(yǎng)的菌液接種 至50mlBMGY液體培養(yǎng)基的三角瓶中，正常條件培養(yǎng)至0D600達(dá)到4-6。離心收集菌體，稀釋 4-6倍將菌體轉(zhuǎn)移至BMMY液體培養(yǎng)基中，使初始的菌密度值達(dá)到1. 0。向培養(yǎng)基中加入終 濃度為〇. 5%的甲醇和100 μ Μ的底物ETA (二十碳四烯酸）開始誘導(dǎo)。要每隔半天添加甲 醇維持0. 5%的誘導(dǎo)濃度。培養(yǎng)96h后離心收集菌體，超聲法提取脂肪酸并進(jìn)行甲酯化，氣 相色譜分析脂肪酸組成變化。脂肪酸變化的結(jié)果如表1所示。通過表1的結(jié)果可以看出， 重組菌具備了將ETA合成EPA (二十二碳五烯酸）的能力，表明所克隆得到的基因為一種新 的脂肪酸delta-5去飽和酶的編碼基因。
[0011] 表1重組畢赤酵母的長鏈脂肪酸組成

【權(quán)利要求】
1. 用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因，其特征在于：所述綠色巴 夫藻delta-5去飽和酶基因的DNA序列為SEQ ID No. 1。
2. 制備權(quán)利要求1所述的綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的方法，其特征在于： 首先，從綠色巴夫藻中分離獲得綠色巴夫藻的基因組DNA ;接著，以綠色巴夫藻的基因 組DNA為模板，根據(jù)去飽和酶基因保守組氨酸框的序列設(shè)計簡并引物P3F和P3R，從而擴增 得到保守區(qū)基因；接下來，分別對其5'末端和3'末端進(jìn)行染色體歩移獲得全基因序列，通 過普通PCR的方法獲得基因全長。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的方法，其特征在于： 具體操作步驟如下： (1) 利用本領(lǐng)域常規(guī)的DNA、RNA提取分離手段從綠色巴夫藻中獲得綠色巴夫藻的基 因組DNA和總mRNA ; (2) delta-5去飽和酶基因的保守區(qū)擴增過程如下： (2. 1)使用5 μ? RNA作為模板，利用多聚胸腺嘧啶寡核苷酸引物（oligo dT Primer): 5' -oligod(T) 15GTAAAACGACGGCCAGT-3' 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈； (2. 2)以上述cDNA第一鏈作為模板，并根據(jù)delta-5去飽和酶同源基因的保守性設(shè)計 上游引物P3F、下游引物P3R來進(jìn)行保守區(qū)基因的擴增；所述上游引物P3F的DNA序列為： 5' -TTGCAGCACATGGGCGGCCACTAC-3' ；所述下游引物 P3R 的 DNA 序列為：5' -AGCCATGTGG TGCTCGATCTCTGGTA-3' ；PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性時間 3 min ;94°C變性時間 30 s，60°C 退火時間30 s，72°C延伸時間1 min, 30個循環(huán)；72°C后延伸時間10 min;其具體的1〇μ1 反應(yīng)體系如下：上游引物P3F、下游引物P3R各0. 4μ1 ;10 XPCR buffer ?μ? ;dNTP 2. 5 mM each 0· 8μ1 ;Easytaq 酶 0· 2μ1 ;去離子水 6· 2μ1 ; 本步驟（2)擴增得到delta-5去飽和酶基因的保守區(qū)片段； (3) delta-5去飽和酶基因兩端基因的克隆通過SEFA-PCR的方法來完成，具體步驟如 下： (3. 1)獲得delta-5去飽和酶基因的保守區(qū)3'末端片段； (3. 1. 1)在10 μ?無引物的所述常規(guī)PCR體系中，加入?μ? SP3-3'引物，94°C變性時間 30s，35-45°C退火時間30s，然后以0. 2度/s的速度升至70度，接下來以70°C延伸5min ; (3. 1. 2)加入3μ1 SP1-3'引物，94°C變性時間30s，以70°C退火和延伸5min，進(jìn)行兩 個循環(huán)； (3. 1. 3)94°C變性時間30s，以70°C退火和延伸5min，再以94°C變性時間30s，55-60°C 退火時間30s，70°C延伸時間5min，進(jìn)行25個循環(huán)； 第二輪反應(yīng)是只使用SP2-3'引物的普通的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)為94°C預(yù)變性時間3 min;94°C變性時間30 s，70°C退火時間30 s，72°C延伸時間1 min，進(jìn)行30個循環(huán)；最后 72 °C延伸時間10 min ; 本步驟擴增得到delta-5去飽和酶基因的保守區(qū)3'末端片段； 以上所述的3'末端的引物序列為： SP1-3' ：5' - GCTTCCCGTCCCCAGGGTCGAGTATG-3' ； SP2-3' ：5' - TCGTGGTGGTGCGACTGGTGGATGT-3' ； SP3-3' ：5' -CCTACCTCAACTACCAGANNNNNNNNNACATGG-3' ； (3. 2)獲得delta-5去飽和酶基因的保守區(qū)5'末端片段； (3. 2. 1)在10 μ?無引物的所述常規(guī)PCR體系中，加入?μ? SP3-5'引物，94°C變性時間 30s，35-45°C退火時間30s，然后以0. 2度/s的速度升至70度，接下來以70°C延伸5min ; (3. 2. 2)加入3μ1 SP1-5'引物，94°C變性時間30s，以70°C退火和延伸5min，進(jìn)行兩 個循環(huán)； (3. 2. 3)94°C變性時間30s，以70°C退火和延伸5min，再以94°C變性時間30s，55-60°C 退火時間30s，70°C延伸時間5min，進(jìn)行25個循環(huán)； 第二輪反應(yīng)是只使用SP2-5'引物的普通的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)為94°C預(yù)變性時間3 min;94°C變性時間30 s，70°C退火時間30 s，72°C延伸時間1 min，進(jìn)行30個循環(huán)；最后 72 °C延伸時間10 min ; 本步驟擴增得到delta-5去飽和酶基因的保守區(qū)5'末端片段； 以上所述的5'末端的引物序列為： SP1-5' ：5' - TGCGGCGTCGCGTGGTGCTTGTTGTG-3' ； SP2-5, ：5, - ACCCGACATGCCGCAACCGAG-3,； SP3-5' ：5' - CCATACACCGCGACCTGANNNNNNNNNGATTCG-3' ； 將所有獲得的基因片段連入PMD18T載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌后挑取轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行 測序，分別獲得所述基因的保守區(qū)片段的DNA序列以及5'末端的DNA序列、3'末端的DNA 序列，利用常規(guī)的DNA序列拼接方法將上述三個序列拼接到一起，得到的多不飽和脂肪酸 delta-5去飽和酶的全長多核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
【文檔編號】C12N15/53GK104195148SQ201410470682
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】徐毅, 汪惠麗 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)