一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用。本發(fā)明所述免疫缺陷質(zhì)粒包括LTR、gag基因、SEQ ID No.1所示核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。本發(fā)明通過(guò)在致病性的SIVmac239全長(zhǎng)質(zhì)粒框架上引入SEQ ID No.1所示核苷酸序列，構(gòu)建出包含多個(gè)藥物靶點(diǎn)的免疫缺陷質(zhì)粒，并在293T細(xì)胞中包裝產(chǎn)生免疫缺陷病毒，該病毒具有感染靶細(xì)胞的能力和高效的復(fù)制能力，能夠應(yīng)用在研究艾滋病毒體內(nèi)感染過(guò)程、病原特性、發(fā)病機(jī)理、免疫反應(yīng)以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥物用藥策略中。CGMCC No.95792014.08.29
【專利說(shuō)明】一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)，是由于感染人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV)而 導(dǎo)致的一種免疫缺陷病，同時(shí)可并發(fā)一系列機(jī)會(huì)性感染及腫瘤，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的綜合 征。1983年人類首次發(fā)現(xiàn)HIV，至今已有三十余年，目前該病毒仍然嚴(yán)重威脅著人類的健康 和生命。疫苗和藥物是人類防治傳染性疾病的兩種主要思路和研究方向。直到目前為止， 艾滋病疫苗研發(fā)尚未成功，臨床上藥物治療仍然占據(jù)主導(dǎo)地位。
[0003] 目前用于臨床的抗艾滋病藥物普遍具有很強(qiáng)的毒副作用，嚴(yán)重?fù)p害了其他正常代 謝器官，加重了病人的痛苦。針對(duì)這些現(xiàn)狀，科研人員正在研究毒副作用小，更加有效的新 一代藥物和治療方案?？笻IV新藥研發(fā)及聯(lián)合用藥策略探索需要體內(nèi)評(píng)價(jià)用靶標(biāo)病毒。猴 /人嵌合免疫缺陷病毒（Simian/Human Chimeric Immunodeficiency Virus, SHIV)是目前廣 泛應(yīng)用于藥物有效性實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，其以猴免疫缺陷病毒SIV作為骨架，將其中env、tat和rev 基因由人免疫缺陷病毒的相應(yīng)片段所替換。
[0004] 但是這些嵌合病毒仍然存在一定的局限性，含有的藥物靶點(diǎn)比較單一，不能綜合 評(píng)估多種藥物治療效果。此外，構(gòu)建猴/人嵌合免疫缺陷病毒能否具有感染細(xì)胞的能力是 成功與否的重要標(biāo)準(zhǔn)，嵌入的基因以及位點(diǎn)的不適宜雖然在分子水平上能夠構(gòu)建出正確的 病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒，但是包裝成病毒后無(wú)感染能力，這其中需要極為精密的構(gòu)建策略。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用，使得所 述免疫缺陷質(zhì)粒包裝成的病毒具有多個(gè)藥物靶點(diǎn)；
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用，使得所述免 疫缺陷質(zhì)粒包裝成的病毒具有感染靶細(xì)胞的能力；
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用，使得所述免 疫缺陷質(zhì)粒包裝成的病毒具有高效的復(fù)制能力。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0009] 一種重組免疫缺陷質(zhì)粒，其特征在于，包括LTR、gag基因 、SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。
[0010] 其中，所述env基因、tat基因和rev基因部分重疊，這屬于本領(lǐng)域公知。
[0011] 優(yōu)選地，所述免疫缺陷質(zhì)粒從5'端開始由LTR、gag基因 、SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因、nef基因和LTR組成。 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。
[0012] 更優(yōu)選地，所述免疫缺陷質(zhì)粒核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0013] 本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，在致病性的SIVmac239全長(zhǎng)質(zhì)?？蚣苌弦隨EQ ID No. 1所示核苷酸序列，其上同時(shí)包含了 HIV-1CRF01-AE亞型的蛋白酶基因 PR、逆轉(zhuǎn)錄酶基 因 RT和整合酶基因 IN，構(gòu)建出一種新型的具有多個(gè)藥物靶點(diǎn)的線性免疫缺陷質(zhì)粒，并且其 包裝成病毒后具有感染靶細(xì)胞的能力和高效的復(fù)制能力。
[0014] 此外，本發(fā)明還提供了所述免疫缺陷質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括：
[0015] 以點(diǎn)突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切 位點(diǎn)，然后連入T載體中；
[0016] 以SIVmac2395'端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpSp5'為模板，通過(guò)重疊 PCR在Pol基因兩端引 入Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)，然后雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質(zhì)粒片段；
[0017] Apa I和Nhe I雙酶切連入SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的T載體，然后SEQ ID No. 1所示核苷酸序列與去掉Pol基因的p239SpSp5'質(zhì)粒片段連接，最后連接SIVmac2393' 端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpE3'，獲得所述重組免疫缺陷質(zhì)粒。
[0018] 作為優(yōu)選，上述以點(diǎn)突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷酸序列兩端分別引入Apa I 和Nhe I酶切位點(diǎn)，然后連入T載體中的步驟為：
[0019] 通過(guò)分別帶有Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)的上游引物（SEQ ID No. 3所示核苷酸序 列）和下游引物（SEQ ID No. 4所示核苷酸序列），以點(diǎn)突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)，然后連入T載體；
[0020] F ：ATCCTTTAGCGGGCCCCAAATCACTCTTTG(Apa I) ；R ：CATGTGCTAGCCCTCATCCTGTCTAC TTGCCACAC(Nhe I)〇
[0021] 作為優(yōu)選，上述以SIVmac2395'端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpSp5'為模板，通過(guò)重疊 PCR在 Pol基因兩端引入Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)，然后雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5' 質(zhì)粒片段的步驟為：
[0022] 以SIVmac2395'端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpSp5'為模板，通過(guò)分別帶有Apa I酶切位點(diǎn)的 兩對(duì)引物 2982-F 和 3736-R(SEQ ID No. 5-6 所示核苷酸序列）、3736-F 和 6307-R(SEQ ID No. 7-8所示核苷酸序列）擴(kuò)增，然后以所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過(guò)引物2982-0V-F和 6307-0V-R(SEQ ID No. 9-10所示核苷酸序列）擴(kuò)增出pol基因5'端引入單酶切位點(diǎn)Apa I 的 3539bp P-12 片段；
[0023] 2982-F ：TTAGGGAGCCGTCAGGATCAGATAT, 3736-R ：AAGAGAGAATTGGGGCCCAGCAAATCCT CT(Apa I)；
[0024] 3736-F ： AGAGG AT T TGC TGGGCCC CAA T T C T CT CT T (Apa I) , 6307-R ： ACTGCTCCTTCCCCTTTCCACAATA ；
[0025] 2982-0V-F :AGGATCAGATATTGCAGGAACAACT，6307-0V-R GCCTTCTCTGTAATAGACCCGAAA A ；
[0026] 以SIVmac2395'端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpSp5'為模板，通過(guò)分別帶有Nhe I酶切位點(diǎn)的 兩對(duì)引物 6307-F和 6591-R(SEQ ID No. 11-12 所示核苷酸序列）、6591-F和 7056-R(SEQ ID No. 13-14所示核苷酸序列）擴(kuò)增，然后以所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過(guò)引物6307-0V-F和 7056-0V-R(SEQ ID No. 15-16所示核苷酸序列）擴(kuò)增出pol基因3'端引入單酶切位點(diǎn)Nhe I 的 899bp P-34 片段；
[0027] 6307-F ：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA,6591-R = ATATTT TATGAGGCTAGCCCACCTCTCTAG(Nhe I)；
[0028] 6 59 I-F ： CTAGAGAGGTGGGCTAGCCTCATAAAATAT (Nhe I) , 7056-R ： CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT ；
[0029] 6307-0V-F :AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，7056-0V-R : CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT。
[0030] 將P-12和P-34分別連入T載體中得到質(zhì)粒T-12和T-34,質(zhì)粒T-12和質(zhì)粒 p239SpSp5'通過(guò)BsrG I和Pac I雙酶切連接反應(yīng)將單酶切位點(diǎn)Apa I引入到p239SpSp5' 中，然后將所得質(zhì)粒和質(zhì)粒T-34通過(guò)Pac I和BstB I雙酶切連接反應(yīng)將單酶切位點(diǎn)Nhe I 引入到p239SpSp5'中，Apa I和Nhe I雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質(zhì)粒片段。
[0031] 本發(fā)明還提供了由本發(fā)明所述免疫缺陷質(zhì)粒在包裝細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的免疫缺陷 病毒。
[0032] 作為優(yōu)選，所述包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述免疫缺陷病毒保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9579,簡(jiǎn)稱 Pol-SHIV。
[0033] 本發(fā)明所述免疫缺陷病毒具有感染性，使用病毒特異性抗體染色Pol-SHIV感染 CEMxl74細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，未感染Pol-SHIV的CEMxl74細(xì)胞背景為1. 02%;而 感染Pol-SHIV的CEMxl74細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到11. 30%。
[0034] 本發(fā)明所構(gòu)建的免疫缺陷病毒接種TZM-bl細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在2500-4000RLU之 間，大于細(xì)胞對(duì)照2. 5倍的cutoff值，說(shuō)明本發(fā)明所述Pol-SHIV病毒能感染TZM-bl細(xì)胞， 該病毒是一個(gè)具有感染靶細(xì)胞能力的病毒，且與SIVmac239毒株具有相似的生物學(xué)特性。 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步測(cè)定了免疫缺陷病毒的TCID 5tl為700TCID5(l/mL。
[0035] 同時(shí)，本發(fā)明所述免疫缺陷病毒SIV P27蛋白含量和逆轉(zhuǎn)錄酶活性均高于猴免疫 缺陷病毒，表明其具有高效的復(fù)制能力。因此，本發(fā)明還提供所述免疫缺陷質(zhì)粒以及所述免 疫缺陷病毒在研究艾滋病毒體內(nèi)感染過(guò)程、病原特性、發(fā)病機(jī)理、免疫反應(yīng)以及篩選抗HIV 藥物和抗HIV藥物用藥策略中的應(yīng)用。
[0036] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過(guò)在致病性的SIVmac239全長(zhǎng)質(zhì)粒框架上引入 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列，構(gòu)建出包含多個(gè)藥物靶點(diǎn)的免疫缺陷質(zhì)粒，并在293T細(xì)胞中 包裝產(chǎn)生免疫缺陷病毒，該病毒具有感染靶細(xì)胞的能力和高效的復(fù)制能力，能夠應(yīng)用在研 究艾滋病毒體內(nèi)感染過(guò)程、病原特性、發(fā)病機(jī)理、免疫反應(yīng)以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥 物用藥策略中。
[0037] 生物材料保藏信息說(shuō)明：
[0038] Pol-SHIV，分類命名：含HIV-IPol基因的雜交免疫缺陷病毒，于2014年8月29日 保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9579。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0039] 圖1示本發(fā)明所述免疫缺陷質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；其中元件A表示SEQ ID No. 1所示 核苷酸序列；
[0040] 圖2示本發(fā)明所述免疫缺陷質(zhì)粒的酶切鑒定圖；其中M為DL10K，1為EcoR I酶切 條帶，2為Apa I酶切條帶，3為Nhe I酶切條帶；
[0041] 圖3示CEMxl74細(xì)胞表面病毒蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞儀圖譜；其中，A為未感染 CEMxl74細(xì)胞；B為Pol-SHIV感染CEMxl74細(xì)胞第9天。

【具體實(shí)施方式】：
[0042] 本發(fā)明公開了一種重組免疫缺陷質(zhì)粒和病毒以及應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒 本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的免疫缺陷質(zhì)粒和病毒及 應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍 內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0043] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0044] 實(shí)施例1 :構(gòu)建本發(fā)明所述免疫缺陷質(zhì)粒
[0045] 通過(guò)分別帶有Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)的上游引物（SEQ ID No. 3所示核苷酸序 列）和下游引物（SEQ ID No. 4所示核苷酸序列），以點(diǎn)突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)，然后連入T載體；
[0046] F ：ATCCTTTAGCGGGCCCCAAATCACTCTTTG(Apa I) ；R ：CATGTGCTAGCCCTCATCCTGTCTAC TTGCCACAC(Nhe I)〇
[0047] 以SIVmac2395'端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpSp5'為模板，通過(guò)分別帶有Apa I酶切位點(diǎn)的 兩對(duì)引物 2982-F 和 3736-R(SEQ ID No. 5-6 所示核苷酸序列）、3736-F 和 6307-R(SEQ ID No. 7-8所示核苷酸序列）擴(kuò)增，然后以所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過(guò)引物2982-0V-F和 6307-0V-R(SEQ ID No. 9-10所示核苷酸序列）擴(kuò)增出pol基因5'端引入單酶切位點(diǎn)Apa I 的 3539bp P-12 片段；
[0048] 2982-F ：TTAGGGAGCCGTCAGGATCAGATAT, 3736-R ：AAGAGAGAATTGGGGCCCAGCAAATCCT CT(Apa I)；
[0049] 3736-F ： AGAGG AT T TGC TGGGCCC CAA T T C T CT CT T (Apa I) , 6307-R ： ACTGCTCCTTCCCCTTTCCACAATA ；
[0050] 2982-0V-F :AGGATCAGATATTGCAGGAACAACT，6307-0V-R GCCTTCTCTGTAATAGACCCGAAA A ；
[0051] 以SIVmac2395'端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpSp5'為模板，通過(guò)分別帶有Nhe I酶切位點(diǎn)的 兩對(duì)引物 6307-F和 6591-R(SEQ ID No. 11-12 所示核苷酸序列）、6591-F和 7056-R(SEQ ID No. 13-14所示核苷酸序列）擴(kuò)增，然后以所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過(guò)引物6307-0V-F和 7056-0V-R(SEQ ID No. 15-16所示核苷酸序列）擴(kuò)增出pol基因3'端引入單酶切位點(diǎn)Nhe I 的 899bp P-34 片段；
[0052] 6307-F ：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA,6591-R = ATATTT TATGAGGCTAGCCCACCTCTCTAG(Nhe I)；
[0053] 6 59 I-F ： CTAGAGAGGTGGGCTAGCCTCATAAAATAT (Nhe I) , 7056-R ： CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT ；
[0054] 6307-0V-F :AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，7056-0V-R : CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT。
[0055] 將P-12和P-34分別連入T載體中得到質(zhì)粒T-12和T-34,質(zhì)粒T-12和質(zhì)粒 p239SpSp5'通過(guò)BsrG I和Pac I雙酶切連接反應(yīng)將單酶切位點(diǎn)Apa I引入到p239SpSp5' 中，然后將所得質(zhì)粒和質(zhì)粒T-34通過(guò)Pac I和BstB I雙酶切連接反應(yīng)將單酶切位點(diǎn)Nhe I 引入到p239SpSp5'中，Apa I和Nhe I雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質(zhì)粒片段。 [0056] Apa I和Nhe I雙酶切連入SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的T載體，然后SEQ ID No. 1所示核苷酸序列與去掉Pol基因的p239SpSp5'質(zhì)粒片段連接，最后連接SIVmac2393' 端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpE3'，獲得所述重組免疫缺陷質(zhì)粒。
[0057] 實(shí)施例2 :所述免疫缺陷質(zhì)粒的大量制備
[0058] 將所述免疫缺陷質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109菌株，30°C平板培養(yǎng)18?20小時(shí)后，挑取單菌 落接種到5mL含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中。30°C，180rpm震蕩培養(yǎng)12?14小時(shí)后，取 I. 5mL菌體培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)粒小提，酶切鑒定無(wú)誤后，將剩余的3. 5mL菌體培養(yǎng)液全部接種到 IL含有氨芐的2X YT液體培養(yǎng)基中。30°C、180rpm震蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，取I. 5mL菌體培養(yǎng) 液再次進(jìn)行小提，酶切鑒定無(wú)誤后，參照Qiagen公司的的說(shuō)明書，將IL的菌液用Endofree Plasmid Giga Kit進(jìn)行質(zhì)粒的大量制備。步驟如下：
[0059] (1)將菌液于4°C，6000rpm離心15min，棄去上清,將沉淀重懸于500ml冰預(yù)冷的 STE溶液中，4°C，6000rpm離心15min，棄去上清；
[0060] (2)菌體沉淀重懸于125ml的Buffer Pl中，振蕩至無(wú)沉淀團(tuán)塊出現(xiàn)，加入125ml 的Buffer P2,輕輕的顛倒離心管數(shù)次，室溫下靜置5min，待裂解充分后加入125ml的 Buffer P3,顛倒離心管數(shù)次，充分混勻；
[0061] (3)將混勻后的裂解產(chǎn)物倒入濾器（Mega-Giga Cartridge)中，室溫下靜置20min 以上，打開真空泵加壓抽濾，待液體抽濾完畢后，加入50ml的Buffer FWB2,用無(wú)菌玻璃棒 輕輕攪動(dòng)沉淀團(tuán)塊，繼續(xù)進(jìn)行抽濾；
[0062] (4)在裂解液中加入30ml的Buffer ER，顛倒混勻，冰浴30min，待溶液澄清后加入 預(yù)先用75ml的Buffer QBT平衡好的制備柱；
[0063] (5)待裂解液完全通過(guò)DNA制備柱后，用600ml的Buffer QC洗脫雜質(zhì)，待液體全 部過(guò)柱后，以IOOml的洗脫液Buffer QN洗脫DNA ;
[0064] (6)收集DNA洗脫液，加入70ml的異丙醇，充分混勻后，于12°C，IOOOOrpm離心 50min ；
[0065] (7)小心倒去上清，用IOml 70%乙醇洗滌沉淀，棄去乙醇洗液，離心管倒置在紙 巾上自然干燥；
[0066] (8)加入5ml-10ml的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA ;
[0067] (9)分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度，根據(jù)測(cè)定的質(zhì)粒濃度稀釋為終濃度為1 μ g/ μ 1(或 0.4yg/y l，40ng/y 1)，-20°C保存。
[0068] 結(jié)果得到2. 205mg的所述免疫缺陷質(zhì)粒，使用三個(gè)限制性內(nèi)切酶（EcoR I，Apa I 和Nhe I)酶切所述免疫缺陷質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物電泳圖見圖2,結(jié)果顯示：EcoR I不能酶切該質(zhì) 粒，Apa I把質(zhì)粒剪切成兩段，長(zhǎng)度分別為7725bp和5476bp，Nhe I把質(zhì)粒剪切成兩段，長(zhǎng) 度分別為9865bp和3336bp，證明成功構(gòu)建序列正確的免疫缺陷質(zhì)粒。同時(shí)使用PCR方法特 異性擴(kuò)增所述免疫缺陷質(zhì)粒中的SEQ ID No. 1所示核苷酸序列，序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒保持穩(wěn) 定。
[0069] 實(shí)施例3 :本發(fā)明所述免疫缺陷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染包裝
[0070] 使用實(shí)施例2制備的所述免疫缺陷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得具有感染性的完整病 毒顆粒，使用6孔板進(jìn)行293T細(xì)胞培養(yǎng)并獲得病毒顆粒，具體步驟如下：
[0071] (1)用10 %完全DMEM培養(yǎng)基將293T細(xì)胞鋪入6孔板中（5 X IO5/孔），過(guò)夜培養(yǎng)， 細(xì)胞密度達(dá)到70%，目的是為了培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。
[0072] (2)每孔用2ml不含抗生素的完全DMEM培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。
[0073] (3)將5 μ g所述免疫缺陷質(zhì)粒DNA稀釋于650 μ 1無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng) 基，輕輕混勻。
[0074] (4) 10 μ I Lipofectamine 2000試劑（使用前輕輕混勻）稀釋于650 μ 1無(wú)血清、 無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基，室溫孵育5分鐘。
[0075] (5)將稀釋的質(zhì)粒DNA和稀釋的Lipofectamine 2000試劑（總體積為I. 3ml)混 合，輕輕混勻，室溫20分鐘，注意：溶液可能會(huì)混濁，但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。
[0076] (6)直接將混合液分別加入每孔細(xì)胞中，輕輕搖動(dòng)孔板混勻，5% C02, 37°C培養(yǎng)5 小時(shí)。
[0077] (7)取2ml新鮮的2%完全培養(yǎng)基換液，5% C02, 37°C培養(yǎng)40小時(shí)。
[0078] (8)收集每孔上清，用0.45 μ M濾器過(guò)濾后，獲得包含所述免疫缺陷病毒的上清。
[0079] 用SIV Ρ27抗原檢測(cè)試劑盒測(cè)定，轉(zhuǎn)染上清檢測(cè)到高水平的SIVP27抗原含量，SIV Ρ27抗原含量大于33. llng/mL，證明轉(zhuǎn)染出能高水平表達(dá)的免疫缺陷病毒Pol-SHIV。所述 免疫缺陷病毒Pol-SHIV于2014年8月29日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編 號(hào)為 CGMCC No. 9579
[0080] 實(shí)施例4 :本發(fā)明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV感染CEMxl74細(xì)胞試驗(yàn)
[0081] 使用病毒特異性抗體染色Pol-SHIV感染CEMxl74細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果見圖3。 A為未感染Pol-SHIV的CEMxl74細(xì)胞背景1. 02% ;B為感染Pol-SHIV的CEMxl74細(xì)胞，感 染第9天，陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到11. 30%。表明本發(fā)明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV具有感染性。
[0082] 實(shí)施例5 :本發(fā)明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的TCID5tl滴定
[0083] 對(duì)所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV在TZM-bl細(xì)胞中單循環(huán)感染周期（48小時(shí)培養(yǎng)） 的 TCID5tl 進(jìn)行測(cè)定，將對(duì)照的 relative luminescence units(RLU)的 2. 5 倍定為 Cutoff 值。步驟如下：
[0084] (1)將所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV從液氮中取出后4°C緩慢融化，用完全DMEM培 養(yǎng)基2倍稀釋病毒，取100 μ 1病毒稀釋液加入96孔培養(yǎng)板中，設(shè)四孔重復(fù)。
[0085] (2) IOml 含 45 μ g/ml DEAE 的完全培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)前補(bǔ)充 30 μ I Indinavir。
[0086] (3)消化一瓶TZM-bl細(xì)胞，離心，用3ml完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，取Iml細(xì)胞懸浮液， 加3ml完全培養(yǎng)基以及8ml含45 μ g/ml DEAE完全培養(yǎng)基，混勻，每孔加100 μ 1。
[0087] (4)用封口膜封住平板四周，37 °C，5 % CO2孵育48小時(shí)。
[0088] (5)除去培養(yǎng)基，200 μ I I XPBS洗一遍。加入50 μ I CCRL裂解液，室溫400rpm 振蕩30分鐘。鏡下觀察細(xì)胞是否裂解完全。
[0089] (6)將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到黑色96孔讀數(shù)板中（0ptiplate-96F)，避免氣泡產(chǎn)生。
[0090] (7)避光在96孔讀數(shù)板中每孔加入50 μ I Iuciferase底物，輕輕振蕩混勻。
[0091] (8)將96孔讀數(shù)板上機(jī)（1420Multilabel Counter)，計(jì)數(shù)熒光強(qiáng)度。
[0092] (9)半數(shù)細(xì)胞感染劑量TCID5tl可運(yùn)用Reed-Muench法公式計(jì)算：
[0093] TCID5tl = CPE>50 %病毒稀釋度+(>50 %的百分?jǐn)?shù)-50)八50 %的百分?jǐn)?shù)-〈50 %的 百分?jǐn)?shù)）
[0094] TZM-bl細(xì)胞表達(dá)功能性TAT蛋白，激活熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，并且感染細(xì)胞 的病毒量與細(xì)胞產(chǎn)生的熒光素酶活性成正比，而沒感染病毒細(xì)胞的熒光素酶活性很差。根 據(jù)該原理檢測(cè)本發(fā)明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的感染性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)照的熒光強(qiáng) 度為638RLU，Pol-SHIV轉(zhuǎn)染上清1:2稀釋后，接種TZM-bl細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在2500-4000RLU 之間，大于細(xì)胞對(duì)照2. 5倍的cutoff值，說(shuō)明本發(fā)明所述Pol-SHIV病毒能感染TZM-bl細(xì) 胞，該病毒是一個(gè)具有感染靶細(xì)胞能力的病毒，且與SIVmac239毒株具有相似的生物學(xué)特 性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定了轉(zhuǎn)染上清的TCID 5tl，經(jīng)計(jì)算，本發(fā)明構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清中含 有 700TCID5Q/mL 的病毒。
[0095] 實(shí)施例6 :本發(fā)明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的生物活性鑒定
[0096] 所測(cè)樣品為：本發(fā)明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV、猴免疫缺陷病毒SIVmac239。
[0097] 1、測(cè)定 SIVP27 蛋白
[0098] 取 450 μ L樣品加入 50 μ L Lysing Buffer，振蕩混勻。用 300 μ L IXPlate Wash Buffer洗板，扣干，洗6次。加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，每孔200 μ L，留一孔作空白對(duì)照，力口 入處理好的樣品20(^1^。封板，371：孵育2小時(shí)。洗板。加入10(^1^31￥?27〇6七6(^(^ Antibody,空白孔不加。封板，37 11C孵育1小時(shí)；洗板。加入IOOyL Streptavidin Peroxidase Working Solution,空白孔不加。封板，37°C孵育30分鐘；洗板。加入IOOyL Substrate Working Solution,不封板，室溫孵育30分鐘，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，結(jié)果見表1。
[0099] 2、測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性
[0100] 取樣品于4°C、8000Xg離心IOmin去除細(xì)胞碎片；上清移入新的離心管。將PEG 與含病毒上清以1:2體積比小心混勻，冰上置放過(guò)夜。4°C，8000Xg離心10min。棄上清 并盡量移去PEG。用50-60 μ L裂解液（solution 4)重懸沉淀，15-25°C放置30min，以完 全裂解病毒。取40 μ L移入一新離心管,加入20 μ L反應(yīng)液（solution 3a)于病毒裂解液 中，37°C孵育1?15h。取微孔板固定好并標(biāo)記名稱，將60 μ L逆轉(zhuǎn)錄液移入微孔板，加蓋于 37°〇孵育111。仔細(xì)移去微孔板內(nèi)上清，用250^洗液（8〇11^ 〇116)清洗5次，每次308，最 后盡量去凈上清。每孔加入20(^1^311衍-016-?00工作液（8〇11^丨〇1153)，55:58 = 1:100 稀釋，加蓋37°C孵育lh。盡量移去上清，用250 μ L洗液（solution 6)清洗5次，每次30s， 最后盡量去凈上清。每孔加入ABTS基質(zhì)液（Solution 7)或含基質(zhì)增強(qiáng)劑的ABTS基質(zhì)液 (solution 7a) 200 μ L 15?25°C孵育至顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)，結(jié)果見表1。
[0101] 表1本發(fā)明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的生物活性鑒定
[0102]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組免疫缺陷質(zhì)粒，其特征在于，包括LTR、gag基因、SEQ ID No. 1所示核苷酸 序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫缺陷質(zhì)粒，其特征在于，從5'端開始由LTR、gag基因 、SEQ ID No. 1所不核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因 、nef 基因和LTR組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述免疫缺陷質(zhì)粒，其特征在于，所述免疫缺陷質(zhì)粒核苷酸序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
4. 一種重組免疫缺陷質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括： 將SEQ ID No. 1所示核苷酸序列連入去掉Pol基因的SIVmac239全長(zhǎng)質(zhì)粒片段中，獲 得所述重組免疫缺陷質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建方法，其特征在于，包括： 以點(diǎn)突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)， 然后連入T載體中； 以SIVmac2395'端半長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpSp5'為模板，通過(guò)重疊 PCR在Pol基因兩端引入 Apa I和Nhe I酶切位點(diǎn)，然后雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質(zhì)粒片段； Apa I和Nhe I雙酶切連入SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的T載體，然后SEQ ID No. 1 所示核苷酸序列與去掉Pol基因的p239SpSp5'質(zhì)粒片段連接，最后連接SIVmac2393'端半 長(zhǎng)質(zhì)粒p239SpE3'，獲得所述重組免疫缺陷質(zhì)粒。
6. 權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述免疫缺陷質(zhì)粒在包裝細(xì)胞中包裝產(chǎn)生的免疫缺陷病毒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述免疫缺陷病毒，其特征在于，所述包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述免疫缺陷病毒，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9579。
9. 權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述免疫缺陷質(zhì)粒在研究艾滋病毒體內(nèi)感染過(guò)程、病原特 性、發(fā)病機(jī)理、免疫反應(yīng)以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥物用藥策略中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求6-8任意一項(xiàng)免疫缺陷病毒在研究艾滋病毒體內(nèi)感染過(guò)程、病原特性、發(fā) 病機(jī)理、免疫反應(yīng)以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥物用藥策略中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104263745SQ201410471676
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】王衛(wèi), 鞠斌, 董志會(huì), 叢喆, 鮑琳琳, 魏強(qiáng), 秦川 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所