一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌，該菌的保藏號為CGMCCNO.9532，其是從健康日本海馬腸道內(nèi)分離獲得，能夠拮抗日本海馬腸炎病病原菌；該菌有芽孢，最適生長溫度為28℃～37℃，鹽度（NaCl）為0.5%～2%；該菌在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后，其發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抑菌效果，該芽孢桿菌能應(yīng)用于液體發(fā)酵生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)；經(jīng)單因素試驗(yàn)優(yōu)化了該菌產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的條件。該菌發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可以耐受高溫，這有利于活性物質(zhì)的保存和運(yùn)輸。該菌是從海馬腸道內(nèi)分離的芽孢桿菌，屬于益生菌，該菌既可以改善海馬養(yǎng)殖水體環(huán)境，也可以改善海馬腸道有益菌的種群數(shù)量，從而大大提高了海馬腸炎病的防治效果。
CGMCC NO.9532
2014.08.20
【專利說明】一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】： 本發(fā)明涉及一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌及其培養(yǎng)方法，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]

【背景技術(shù)】： 海馬是名貴的海洋中藥材，在我國海馬作為藥材的使用已有悠久歷史。世界上至少有 46種海馬，但據(jù)世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN)于2013年2月關(guān)于瀕危海馬物種的最新統(tǒng)計，世 界上有39種海馬屬于瀕危物種。雖然我國自1957年以來已經(jīng)開始養(yǎng)殖海馬，但是養(yǎng)殖規(guī) 模一直無法成功擴(kuò)大化，其主要原因之一就是海馬養(yǎng)殖過程中常見的細(xì)菌性疾病問題。據(jù) 2013年對深圳某一海馬養(yǎng)殖場的調(diào)查表明：該海馬養(yǎng)殖場購進(jìn)的一批日本海馬在短短的 幾個月期間，因患有腸炎病死亡了近2000余尾，給該廠造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 目前，針對海馬的細(xì)菌性疾病治療方法還是以使用抗生素類藥物為主，長期使用 抗生素類藥物不但會使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性、影響海馬健康和抗病害能力，而且效果不理想。我 國是亞洲出口海馬的主要國家之一，若是長時間使用抗生素，會使海馬體內(nèi)的抗生素含量 超標(biāo)，從而影響我國海馬的外出口貿(mào)易。
[0004] 益生菌是一類能夠與病原菌互相抵制、互相排斥、甚至互相殘殺的微生物種群， 因?yàn)榫哂写嬖诜秶鷱V、數(shù)量種類多、繁殖速度快、作用方式廣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物 防治領(lǐng)域中。益生菌既可以避免抗生素的副作用，也可以促進(jìn)動物生長。近年來，益生 菌已經(jīng)開始在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用，如Moriarty利用芽孢桿菌來控制養(yǎng)殖池內(nèi)弧菌的數(shù)量； Newaj-Fyzul等人利用枯草芽孢桿菌來抵御氣單胞桿菌對虹鱒魚的感染。
[0005] 芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如表面活性素、伊枯草菌素、豐原素等脂肽類抗 菌素和抗菌蛋白等；并已有相關(guān)報道證明芽孢桿菌是一種益生菌。目前關(guān)于海馬細(xì)菌性疾 病的報道不少，但是還沒有用微生生物拮抗來防治海馬細(xì)菌性疾病的相關(guān)報道。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足而從健康日本海馬腸道內(nèi)分離篩選一株 芽孢桿菌，它可以拮抗日本海馬腸炎病病原菌，從而起到生物防治的作用。
[0007] 本發(fā)明的可以通過如下措施來達(dá)到：一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌，其特征 在于其保藏名稱為sp. )HS17,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心，保藏日期：2014年8月20日，保藏號：CGMCC N0. 9532,分類命名：解淀粉芽 抱桿菌 Bacillus amyloliquefaciens。
[0008] -種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其包括如下步驟： (1)芽孢桿菌的分離純化： 清洗健康日本海馬體表，取出日本海馬腸道組織消毒并研磨后，再用無菌生理鹽水梯 度稀釋，之后涂布于2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12-24h后，挑選大小、顏色不同的菌落進(jìn)行 分離純化，將分離純化后的菌株于4-10°C保存?zhèn)溆?；其?000mL的2216E培養(yǎng)基的配方 組分為：蛋白胨10,酵母粉5,瓊脂20,海水700mL，蒸餾水300mL ; (2)將上述分離純化后的 日本海馬腸道菌菌株劃線于2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12-24h后，采用點(diǎn)種法，用接種環(huán)挑 取步驟（1)中分離純化的單菌落點(diǎn)種于涂布有供試菌株HC2的2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng) 24-48h，觀察有無抑菌圈，將出現(xiàn)抑菌圈的菌株進(jìn)行再次點(diǎn)種，確認(rèn)其抑菌性，最終獲得一 株抑菌效果較好的拮抗菌，命名為HS17。
[0009] 所述的芽孢桿菌的分離純化中采用無菌生理鹽水清洗健康日本海馬體表3-5次， 取出日本海馬腸道組織放入含有0. 5-2mL無菌生理鹽水的研磨器中，充分研磨之后，再用 無菌生理鹽水稀釋到菌液濃度為1 X 103cfu/mL。
[0010] 為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，將上述HS17在最佳培養(yǎng)基中，在25-37 °C、 140-200r/min發(fā)酵條件下，發(fā)酵培養(yǎng)72-120h ;所述的最佳培養(yǎng)基的配方組分為：蛋白胨 10. 0-20. Og/L、麥芽糖 5. 0-10. Og/L、ΚΗ2Ρ04 0· 5-1. 5g/L、NaCL 5-20. Og/L 和 MgS047H20 0· 1-0. 5g/L，蒸餾水 1000mL。
[0011] 為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的HS17在最佳培養(yǎng)基中裝瓶量為30%、初始 pH值7.0、接種量為3%。
[0012] 本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果： 1、本發(fā)明的拮抗菌HS17是從健康日本海馬腸道內(nèi)分離得到，拮抗海馬腸炎病病原菌 的芽孢桿菌，對其病原菌有顯著拮抗作用，可以代替防治腸炎病的抗生素類藥物。
[0013] 2、該芽孢桿菌為有益菌，可以改善養(yǎng)殖水體環(huán)境以及海馬腸道有益菌的種群數(shù) 量，從而可以使防治效果更加突出。
[0014] 3、以該芽孢桿菌為主進(jìn)行海馬腸炎病微生物的防治可以重復(fù)多次使用，不會產(chǎn)生 藥物殘留和耐藥性問題；該拮抗海馬腸炎病病原菌的芽孢桿菌的發(fā)明為海馬腸炎病的生物 防治技術(shù)提供切實(shí)可行的技術(shù)支持和理論依據(jù)。
[0015] 4、本發(fā)明的芽孢桿菌的抑菌活性物可以耐受高溫，這為應(yīng)用中的運(yùn)輸和保存提供 了便利。
[0016]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1為芽孢桿菌HS17革蘭氏染色圖片； 圖2為芽孢桿菌HS17芽孢染色圖片； 圖3為芽孢桿菌HS17發(fā)酵液抑菌圖片。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例的限 制。
[0018] 實(shí)施例1 :芽孢桿菌HS17的分離純化： 用無菌生理鹽水清洗健康日本海馬體表3-5次，取出日本海馬腸道組織放入含有 0. 5-2mL無菌生理鹽水的研磨器中，充分研磨之后，再用無菌生理鹽水稀釋到菌液濃度為 1 X 103cfu/mL，之后涂布于2216E培養(yǎng)基（1000mL培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母粉5g，瓊脂20g， 海水700mL，蒸餾水300mL)上，28°C培養(yǎng)12-24h后，挑選大小、顏色不同的菌落進(jìn)行分離純 化，將分離純化后的菌株于4-KTC保存?zhèn)溆谩?br> [0019] 將上述分離純化后的日本海馬腸道菌菌株劃線于2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng) 12-24h后，采用點(diǎn)種法，用接種環(huán)挑取單菌落點(diǎn)種于涂布有供試菌株HC2 (日本海馬腸炎病 病原菌）的2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24-48h，觀察有無抑菌圈，將出現(xiàn)抑菌圈的菌株進(jìn)行 再次點(diǎn)種，確認(rèn)其抑菌性，最終獲得一株抑菌效果較好的拮抗菌，命名為HS17。
[0020] 實(shí)施例2 :拮抗菌HS17的鑒定： 所述菌株HS17經(jīng)革蘭氏染色，可知該菌株為革蘭氏陽性桿菌，見圖1 ;經(jīng)芽孢染色可 知該菌株有芽孢，見圖2 ;該菌株在2216E平板上28°C恒溫培養(yǎng)24h，菌落呈白色，表面不光 滑，邊緣呈波浪狀，直徑約為1?2mm。
[0021] 對菌株HS17進(jìn)行生長溫度和耐鹽度（NaCL)測定，結(jié)果顯示該菌的最適生長溫度 為28°C?37°C，鹽度（NaCl)為0. 5%?2%，其詳細(xì)結(jié)果見表1 ;按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手 冊》（東秀珠等，2001)進(jìn)行生理生化特性檢測，其測定結(jié)果詳情見表1。 K 1 2 ft HS I Μ ± Μ I：,f t :：^ ? φ

【權(quán)利要求】
1. 一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌，其特征在于其保藏名稱為sp.) HS17,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年8月 20 日，保藏號：CGMCC NO. 9532。
2. 權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其包括如下步 驟： (1)芽孢桿菌的分離純化： 清洗健康日本海馬體表，取出日本海馬腸道組織消毒并研磨后，再用無菌生理鹽水梯 度稀釋，之后涂布于2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12-24h后，挑選大小、顏色不同的菌落進(jìn)行 分離純化，將分離純化后的菌株于4-10°C保存?zhèn)溆茫黄渲?000mL的2216E培養(yǎng)基的配方 組分為：蛋白胨10,酵母粉5,瓊脂20,海水700mL，蒸餾水300mL ; (2)將上述分離純化后的 日本海馬腸道菌菌株劃線于2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12-24h后，采用點(diǎn)種法，用接種環(huán)挑 取步驟（1)中分離純化的單菌落點(diǎn)種于涂布有供試菌株HC2的2216E培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng) 24-48h，觀察有無抑菌圈，將出現(xiàn)抑菌圈的菌株進(jìn)行再次點(diǎn)種，確認(rèn)其抑菌性，最終獲得一 株抑菌效果較好的拮抗菌，命名為HS17。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述的一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其特 征在于所述的芽孢桿菌的分離純化中采用無菌生理鹽水清洗健康日本海馬體表3-5次，取 出日本海馬腸道組織放入含有〇. 5-2mL無菌生理鹽水的研磨器中，充分研磨之后，再用無 菌生理鹽水稀釋到菌液濃度為1 X 103cfu/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述的一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其 特征在于將上述HS17在最佳培養(yǎng)基中，在25-37°C、140-200r/min發(fā)酵條件下，發(fā)酵培養(yǎng) 72-120h ;所述的最佳培養(yǎng)基的配方組分為：蛋白胨10. 0-20. Og/L、麥芽糖5. 0-10. Og/L、 ΚΗ2Ρ04 0· 5-1. 5g/L、NaCL 5-20. 0g/L 和 MgS047H20 0· 1-0. 5g/L，蒸餾水 1000mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的所述的一種促進(jìn)海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其特 征在于所述的HS17在最佳培養(yǎng)基中裝瓶量為30%、初始pH值7. 0、接種量為3%。
【文檔編號】C12R1/07GK104232541SQ201410472316
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】孫虎山, 李海東 申請人:魯東大學(xué)