一種環(huán)氧化物水解酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種環(huán)氧化物水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本發(fā)明涉及一種環(huán)氧化物水解酶的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明還涉及一種環(huán)氧化物水解酶的應(yīng)用，所述環(huán)氧化物水解酶以外消旋的芳香環(huán)氧化物為底物制備手性的芳香環(huán)氧化物。本發(fā)明提供的環(huán)氧化物水解酶可以整細(xì)胞的濕菌體或凍干菌體的形式，也可以粗酶液或純酶的形式，以外消旋的芳香環(huán)氧化物為底物，制備得到對(duì)映純的手性的芳香環(huán)氧化物(ee>99％)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種環(huán)氧化物水解酶及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶催化領(lǐng)域，更具體地涉及一種環(huán)氧化物水解酶及其編碼基因和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)氧化物水解酶（EC 3. 3. 2. 3)是一組功能相似的酶系，能夠立體選擇性催化環(huán) 氧化合物生成光學(xué)純的環(huán)氧化物和相應(yīng)鄰位二醇。作為一種水解酶它具有一般水解酶的特 點(diǎn)如：反應(yīng)不需要輔酶的協(xié)助；具有廣泛的來(lái)源；在非水溶劑中仍具有催化活力；以及這些 反應(yīng)常常顯示出化學(xué)、區(qū)域和立體對(duì)映選擇性，能夠?qū)ν?lèi)型廣泛的底物進(jìn)行作用。
[0003] 環(huán)氧化物水解酶廣泛存在于自然界中，在哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、微生物和植物中 均有發(fā)現(xiàn)。由于微生物種類(lèi)的多樣性、生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，從微 生物中篩選獲得環(huán)氧化物水解酶是目前主要的途徑。近年，已從多種微生物中發(fā)現(xiàn)

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)氧化物水解酶，其特征在于，所述環(huán)氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. -種環(huán)氧化物水解酶的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)氧化物水解酶的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)氧化物水 解酶以外消旋的芳香環(huán)氧化物為底物制備手性的芳香環(huán)氧化物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芳香環(huán)氧化物為苯基縮水甘油醚、間 甲基苯基縮水甘油醚、間硝基苯基縮水甘油醚或?qū)谆交s水甘油醚。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述底物溶解于二甲基亞砜中，所述環(huán)氧 化物水解酶溶解于pH為7?8的緩沖液或純水中，兩者混合形成反應(yīng)體系。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)氧化物水解酶的制備方法包括： S1，將來(lái)源于 DSM20162 Tsukamurella paurometabola 的 SEQ ID N0:1 所不的環(huán)氧化物水 解酶的基因構(gòu)建載體，將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；S2,獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培 養(yǎng)液分離獲得含環(huán)氧化物水解酶的菌體細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟S1包括：以GenBank登錄號(hào)為 YP_003645475 的序列設(shè)計(jì)引物 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4;以從DSM20162 Tsukamurella paurometabola提取的基因組為模板克隆獲得全長(zhǎng)1038bp的基因片段；經(jīng)過(guò)BamHI和 Hindlll兩個(gè)內(nèi)切酶酶切后，與對(duì)應(yīng)的經(jīng)過(guò)酶切的pET-28a線性化質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化至克隆宿主E. coli DH5a，獲得的單克隆過(guò)夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟S2包括：獲得的重組基因工程 菌以IPTG為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21的濕 菌體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)氧化物水解酶的制備方法還包括： S3,冷凍干燥所述濕菌體得到凍干菌體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)氧化物水解酶的制備方法還包 括：S4,破碎所述濕菌體或所述凍干菌體后得到粗酶液。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)氧化物水解酶的制備方法還包 括：S5,提純所述粗酶液得到純酶。
【文檔編號(hào)】C12N15/55GK104450641SQ201410475055
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】王華磊, 吳鍇, 魏東芝 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)