一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)細(xì)胞治療領(lǐng)域，具體涉及一種快速、即時(shí)分離人皮膚中表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的裝置，以及分離方法；本發(fā)明的分離裝置由微型磁力加熱攪拌器、操作面板、消化酶及等滲電解質(zhì)溶液組成。本發(fā)明的分離方法不但明顯減少了分離人體皮膚細(xì)胞所需儀器、簡(jiǎn)化了操作步驟，明顯縮短了分離細(xì)胞所需時(shí)間，而且避免了血清的應(yīng)用，顯著減少過(guò)敏、病原微生物傳播等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，有利于人體皮膚細(xì)胞移植應(yīng)用的廣泛推廣。本發(fā)明分離的細(xì)胞可用于瘢痕整形、各種原因所致色素異常改變(如白癜風(fēng)、瘢痕性色素減退)的治療及急慢性創(chuàng)面修復(fù)。
【專利說(shuō)明】一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)細(xì)胞治療領(lǐng)域，具體涉及一種快速、即時(shí)分離人皮膚中表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的裝置，以及分離方法；本發(fā)明分離的細(xì)胞可用于瘢痕整形、各種原因所致色素異常改變(如白癜風(fēng)、瘢痕性色素減退)的治療及急慢性創(chuàng)面修復(fù)。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞治療已成為多種疾病的重要治療手段之一，受到研究者和臨床醫(yī)師的廣泛關(guān)注。人皮膚中主要的細(xì)胞成份為表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及黑色素細(xì)胞，分離上述細(xì)胞后即時(shí)應(yīng)用(即未經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增)、或延時(shí)應(yīng)用(即經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增)，結(jié)合其它治療手段已成功應(yīng)用于瘢痕、瘢痕性色素減退或沉著、白癜風(fēng)、燒傷深度創(chuàng)面、供皮區(qū)及各種慢性創(chuàng)面(如糖尿病足、靜脈曲張性皮膚潰瘍)等的治療，并取得了良好的效果。例如:分離小塊人皮膚中表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞移植于經(jīng)磨削的白癜風(fēng)創(chuàng)面或其它原因所致的色素異常改變創(chuàng)面，可恢復(fù)治療區(qū)正常顏色；分離皮膚中表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后種植于真皮替代物表面，形成復(fù)層組織工程皮膚，可修復(fù)深度燒傷創(chuàng)面。
[0003]盡管人皮膚細(xì)胞治療已取得一定效果，然而，存在的最大問(wèn)題是目前尚無(wú)理想的表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分離設(shè)備和技術(shù)，常用的方法是切取患者斷層皮片后采用中性蛋白酶或胰蛋白酶進(jìn)行消化，第一步是分離斷層皮片的表皮層，可采用熱消化或冷消化。熱消化是將斷層皮片置于由中性蛋白酶或胰蛋白酶組成的消化液中，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱等清潔環(huán)境下于37攝氏度消化0.5-2小時(shí)，冷消化是指在4攝氏度下將斷層皮片消化8-12小時(shí)，然后以攝子揭起表皮層。第二步是分離表皮層中的細(xì)胞成份，將分離的表皮層剪切成碎片，加入一定濃度的胰蛋白酶溶液，在37攝氏度下消化10-30分鐘不等，適當(dāng)吹打，然后以200目濾網(wǎng)過(guò)濾去除表皮碎片，加入l-5ml異體或異種血清中和胰酶，臺(tái)式離心機(jī)上以800 - 1200rpm離心5_10分鐘，吸除溶液，在沉淀物中加入培養(yǎng)基或其它類似溶液，適當(dāng)吹打，獲得含表皮細(xì)胞及部分黑色素細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞懸液(參見(jiàn)文獻(xiàn):陳俊穎，魏泓，周建華。人表皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的研究。中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，14 (2):114-117。)。上述方法操作步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，且需專用儀器設(shè)備，難以在手術(shù)室內(nèi)與手術(shù)同步進(jìn)行，成為人體皮膚細(xì)胞治療推廣應(yīng)用的主要障礙，具體表現(xiàn)如下:1.消化分離時(shí)間長(zhǎng):無(wú)論是熱消化或冷消化，整個(gè)細(xì)胞分離過(guò)程需耗時(shí)2-16小時(shí)，分離的細(xì)胞難以在短時(shí)間內(nèi)在手術(shù)室得到應(yīng)用；2.分離細(xì)胞步驟多:需首次消化以分離表皮層、再次消化以分離表皮層中的細(xì)胞成份、然后過(guò)濾、離心、重懸細(xì)胞等，操作相對(duì)復(fù)雜、需一定的儀器設(shè)備及相關(guān)技術(shù)，只能在具備一定實(shí)驗(yàn)條件及技術(shù)人員的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，難以在臨床上推廣應(yīng)用；3.存在過(guò)敏及病毒、支原體、衣原體等病原微生物傳播的嚴(yán)重并發(fā)癥危險(xiǎn):細(xì)胞懸液中殘余胰蛋白酶，需添加胰蛋白酶抑制劑或血清，中止胰蛋白酶活性以免加重細(xì)胞損傷，異體或異種血清成份復(fù)雜，可導(dǎo)致過(guò)敏甚至過(guò)敏性休克等嚴(yán)重并發(fā)癥，且存在難以檢測(cè)的病原微生物傳播的風(fēng)險(xiǎn)；
4.所采用的分離方法據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的條件及經(jīng)驗(yàn)均有所不同，缺乏統(tǒng)一的流程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，臨床應(yīng)用效果不穩(wěn)定。
[0004]目前急需一種快速、即時(shí)、無(wú)傳染風(fēng)險(xiǎn)的人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的專用分離設(shè)備及其分離方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種快速、即時(shí)、無(wú)傳染風(fēng)險(xiǎn)的人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的專用分離設(shè)備及其分離方法。
[0006]本發(fā)明擬對(duì)目前實(shí)驗(yàn)室及臨床上所使用的人皮膚細(xì)胞分離設(shè)備及技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，不僅要減少細(xì)胞分離的步驟和所需儀器，而且要縮短細(xì)胞分離時(shí)間，最重要的是要避免血清的應(yīng)用，提高細(xì)胞治療的安全性。
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供了一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，該裝置包括:
[0008]磁力加熱攪拌器和操作面板，所述的操作面板鑲嵌于磁力加熱攪拌器上，二者形成一個(gè)整體；
[0009]所述的操作面板上設(shè)有3個(gè)以上孔，其中一個(gè)孔為磁力攪拌及過(guò)濾孔，其內(nèi)放置一個(gè)磁力攪拌子，所述的磁力攪拌子的直徑為0.1-1cm,長(zhǎng)度為0.4-2cm。
[0010]所述的磁力加熱攪拌器，也稱加熱磁力攪拌器，可控制溫度在25-40攝氏度之間，攪拌速度為100-1200rpm。
[0011]磁力加熱攪拌器驅(qū)動(dòng)力為一次性電池或反復(fù)充電式電池或常用的220伏交流電。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的磁力加熱攪拌器，可選用市售的微型磁力加熱攪拌器加以組裝或改造，例如但不限于上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司的0MS-5A多聯(lián)動(dòng)磁力攪拌機(jī)、常州普天儀器制造有限公司的六聯(lián)磁力加熱攪拌器等。
[0013]所述的操作面板上設(shè)有3個(gè)以上孔，各孔分別為:至少一個(gè)消化孔；至少一個(gè)漂洗孔；至少一個(gè)磁力攪拌及過(guò)濾孔，所述的磁力攪拌及過(guò)濾孔內(nèi)裝有可抽取式80目一 200目的過(guò)濾網(wǎng)。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的操作面板上設(shè)有5個(gè)孔，分別為A、B、C、D、E孔，其中A孔為皮片消化孔，呈圓形、正方形或其它任意形狀，直徑為l-5cm，深度為l-5cm，溫度由加熱磁力攪拌器精確控制在25-40攝氏度；B孔、C孔、D孔為皮片漂洗孔，為圓形、正方形或其它任意形狀，直徑為l_5cm，深度為l-5cm ；E孔為磁力攪拌及過(guò)濾孔，直徑為
0.5-5cm，深度為0.5-5cm，孔內(nèi)裝有可抽取式80目一 200目的過(guò)濾網(wǎng)。
[0015]所述的操作面板，為高強(qiáng)度塑料或鋁質(zhì)、鋼質(zhì)、木質(zhì)材料構(gòu)成。
[0016]優(yōu)選的，操作面板為長(zhǎng)方體，長(zhǎng)度為1cm?30cm,寬度為1cm?30cm,高度為5cm ?40cmo
[0017]本發(fā)明的裝置還包括:
[0018]消化酶，為由膠原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶組成的固態(tài)消化酶，優(yōu)選的所述的膠原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶的重量比為1:1:1;
[0019]等滲電解質(zhì)溶液，為Ph值7.4的電解質(zhì)溶液生理鹽水、PBS液、D-hank’ s液，或Hank，S 液；
[0020]一次性手術(shù)刀，優(yōu)選的為常規(guī)23號(hào)刀片；
[0021]一次性手術(shù)用鑷子，優(yōu)選的為無(wú)齒鑷子。
[0022]優(yōu)選的，本發(fā)明的裝置還包括:注射器，為lml、2.5ml或5ml常規(guī)注射器。
[0023]本發(fā)明的第二方面，提供了一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟:
[0024]A、將消化酶溶解于等滲電解質(zhì)溶液中，配制成質(zhì)量濃度為0.1% -1%的消化液，加入消化孔中，啟動(dòng)微型磁力加熱攪拌器，預(yù)熱5-10分鐘，使溶液溫度為25-40攝氏度；
[0025]B、將需要分離的斷層皮片，處理成厚度為0.15-0.6mm,大小為0.5cm2_16cm2 ；
[0026]C、將切取步驟B的斷層皮片置于消化孔中孵育5-45分鐘；
[0027]D、漂洗孔中加入等滲電解質(zhì)溶液，將孵育后的斷層皮片進(jìn)行漂洗；
[0028]E、將漂洗后的斷層皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手術(shù)用鑷子揭起、分離表皮層，用一次性手術(shù)刀刮除表皮層的真皮面數(shù)次，并刮除真皮層的表皮面數(shù)次，得到少量的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液；
[0029]F、在磁力攪拌及過(guò)濾孔中加入等滲電解質(zhì)溶液，將所獲得的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液置于磁力攪拌及過(guò)濾孔中過(guò)濾，然后取出可抽取式80目一 200目的過(guò)濾網(wǎng)，即可獲得含分離細(xì)胞的溶液；
[0030]G、進(jìn)一步優(yōu)選的方案為，將漂洗后的斷層皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手術(shù)用鑷子揭起、分離表皮層，用一次性手術(shù)刀刮除表皮層的真皮面數(shù)次，并刮除真皮層的表皮面數(shù)次，得到少量的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液。然后用手術(shù)刀將表皮層適當(dāng)切割成碎片，將所獲得的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液和表皮碎片置于預(yù)先加入等滲電解質(zhì)溶液的磁力攪拌及過(guò)濾孔中，常溫下以100 - 1200rpm攪拌5-10分鐘，然后取出可抽取式80目一 200目的過(guò)濾網(wǎng)，在磁力攪拌及過(guò)濾孔中即可獲得含分離細(xì)胞的溶液。
[0031 ] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，上述方法中，
[0032]優(yōu)選的，步驟Ajf0.001-0.02克消化酶(膠原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶為1:1:I比例)溶解于2-10ml等滲電解質(zhì)溶液D-hank’ s液中，配制成質(zhì)量濃度為0.1% -1%的消化液，加入A孔中，啟動(dòng)微型磁力加熱攪拌器，預(yù)熱5-10分鐘，使溶液溫度為25-40攝氏度；
[0033]優(yōu)選的，步驟D、三個(gè)漂洗孔(B、C、D孔)中分別加入等滲電解質(zhì)溶液如Hank’ S液，取出孵育后的斷層皮，分別于B、C、D孔中漂洗1-3次(可為I次，也可為3次不等)；
[0034]優(yōu)選的，步驟E、將漂洗后的斷層皮片平放于操作面板上，以鑷子等固定皮片，以另一鑷子揭起分離的表皮層，然后以安裝23號(hào)刀片的手術(shù)刀刮除表皮層的真皮面，刮除真皮層的表皮面，并適當(dāng)將表皮層切割成碎片，即可獲得一定量的分離的細(xì)胞；
[0035]優(yōu)選的，步驟F、為進(jìn)一步提高細(xì)胞分離量并去除表皮碎片，在E孔中加入0.5-5ml等滲電解質(zhì)溶液如Hank’ S液，置入磁力攪拌子，將刮除后所得到的細(xì)胞溶液及表皮碎片置于E孔中，常溫下以100 — 1200rpm攪拌5-10分鐘，然后取出可抽取式80目一 200目的過(guò)濾網(wǎng)，在E孔中即可獲得約0.5-5ml含分離細(xì)胞的溶液，以注射器抽吸細(xì)胞溶液，待用。
[0036]經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)表明，分離人皮膚細(xì)胞所需時(shí)間為15 - 60分鐘。
[0037]分離細(xì)胞的組成，是由表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及黑色素細(xì)胞組成，其中表皮細(xì)胞占50-93 %、成纖維細(xì)胞占10-25 %，黑色素細(xì)胞占2-5 %。每平方厘米人斷層皮片分離的細(xì)胞總數(shù)為1.0X 16 — 3.5 X 16個(gè)，細(xì)胞活性為80-95%。
[0038]分離的細(xì)胞，采用注射器均勻滴注或噴灑于經(jīng)磨削等處理的瘢痕、白癜風(fēng)或其它色素異常改變創(chuàng)面，包扎固定1-2周，可顯著減輕瘢痕增生、恢復(fù)正常皮膚色澤。分離的細(xì)胞應(yīng)用于供皮區(qū)、燒傷創(chuàng)面及各種慢性創(chuàng)面(如糖尿病足、靜脈曲張性皮膚潰瘍)等，移植后細(xì)胞存活并分泌生長(zhǎng)因子，明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合。此外，分離的細(xì)胞也可用作實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)擴(kuò)增表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或黑色素細(xì)胞，以供研究應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的一種快速、即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的裝置及方法，與目前常規(guī)的細(xì)胞分離技術(shù)相比，具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
[0040]1.常規(guī)細(xì)胞分離方法需要培養(yǎng)箱或水浴箱及離心機(jī)等，不但體積大，而且操作復(fù)雜，需在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行操作。本發(fā)明的細(xì)胞分離裝置由微型磁力加熱攪拌器及操作面板形成一體化構(gòu)件，體積小、攜帶簡(jiǎn)便，可一次性使用，或經(jīng)薰蒸消毒后反復(fù)使用，尤其適合于在手術(shù)室使用，便于臨床相關(guān)細(xì)胞治療的開(kāi)展；
[0041]2.常規(guī)細(xì)胞分離方法耗時(shí)2-16小時(shí)，分離的細(xì)胞難以在短時(shí)間內(nèi)在手術(shù)室得到應(yīng)用。本發(fā)明分離人皮膚細(xì)胞所需時(shí)間為15 - 60分鐘，可與手術(shù)同時(shí)進(jìn)行，分離細(xì)胞后即時(shí)應(yīng)用，便于臨床推廣；
[0042]3.應(yīng)用本發(fā)明提供的細(xì)胞分離裝置分離細(xì)胞時(shí)，操作流程簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)化，具備一般醫(yī)學(xué)知識(shí)的醫(yī)護(hù)人員即可進(jìn)行操作，不需在具備一定實(shí)驗(yàn)條件及技術(shù)人員的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，且分離細(xì)胞數(shù)量及活性穩(wěn)定、移植應(yīng)用時(shí)存活率高；
[0043]4.本發(fā)明分離細(xì)胞時(shí)不需添加胰蛋白酶抑制劑或血清等中止殘余胰蛋白酶活性，避免了因異體或異種血清導(dǎo)致過(guò)敏、過(guò)敏性休克及病毒、支原體、衣原體病原微生物傳播等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1為本發(fā)明裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0045]其中:
[0046]磁力加熱攪拌器1、
[0047]操作面板2、
[0048]孔3，消化孔3A ;漂洗孔3B、3C、3D ;磁力攪拌及過(guò)濾孔3E ；
[0049]過(guò)濾網(wǎng)4、
[0050]溫度指示5、
[0051]轉(zhuǎn)速指示6。

【具體實(shí)施方式】
[0052]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于此。
[0053]實(shí)施例1:
[0054]如圖1所示，一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，該裝置包括:磁力加熱攪拌器I和操作面板2，所述的操作面板2鑲嵌于磁力加熱攪拌器I上，二者形成一個(gè)整體；
[0055]所述的操作面板上設(shè)有5個(gè)孔，一個(gè)消化孔3A ;三個(gè)漂洗孔3B、3C、3D 個(gè)磁力攪拌及過(guò)濾孔3E，所述的磁力攪拌及過(guò)濾孔內(nèi)裝有可抽取式80目一 200目的過(guò)濾網(wǎng)4。所述的磁力攪拌及過(guò)濾孔，其內(nèi)放置一個(gè)磁力攪拌子。
[0056]所述的磁力加熱攪拌器，還包括溫度指示5、轉(zhuǎn)速指示6，可控制溫度在25-40攝氏度之間，攪拌速度為100-1200rpm。
[0057]3A孔為呈圓形,直徑為3cm,深度為3cm,溫度由加熱磁力攪拌器精確控制在25-40攝氏度；
[0058]3B孔、3C孔、3D孔為圓形,直徑為3cm,深度為3cm ；
[0059]3E孔為磁力攪拌及過(guò)濾孔，直徑為0.5cm，深度為1cm，孔內(nèi)裝有可抽取式100目的過(guò)濾網(wǎng)。
[0060]本發(fā)明的裝置還包括:
[0061 ] 消化酶，為由膠原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶組成的固態(tài)消化酶，優(yōu)選的所述的膠原酶(購(gòu)自Life Technologies公司，型號(hào)17100-017-lg)、中性蛋白酶(購(gòu)自LifeTechnologies公司，型號(hào)17105-041_5g)及膜蛋白酶(購(gòu)自Life Technologies公司，型號(hào)27250-018-100g)的重量比為 1:1:1;
[0062]等滲電解質(zhì)溶液，為Ph值7.4的電解質(zhì)溶液生理鹽水、PBS液、D-hank’ s液，或Hank，S 液；
[0063]一次性手術(shù)刀，為常規(guī)23號(hào)刀片；
[0064]一次性手術(shù)用鑷子，為常規(guī)無(wú)齒鑷。
[0065]實(shí)施例2:
[0066]利用實(shí)施例1的裝置，分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法包括以下步驟:
[0067]1.將0.001-0.02克消化酶(膠原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶為1:1:1比例)溶解于2-10ml等滲電解質(zhì)溶液D-hank’s液中，配制成質(zhì)量濃度為0.1% _1%的消化液，加入A孔中，啟動(dòng)微型磁力加熱攪拌器，預(yù)熱5-10分鐘，使溶液溫度為25-40攝氏度；
[0068]2.切取人體任意部位斷層皮片，厚度約0.15-0.6mm,大小為0.5cm2-16cm2等；
[0069]3.將切取的斷層皮片置于3A孔中孵育5-45分鐘；
[0070]4.3B、3C、3D孔中加入電解質(zhì)溶液如Hank’ S液，取出孵育后的斷層皮，分別于3B、3C、3D孔中漂洗1-3次；
[0071]5.將漂洗后的斷層皮平放于操作面板上，以鑷子等固定皮片，以另一鑷子揭起分離的表皮層，然后以安裝23號(hào)刀片的手術(shù)刀刮除表皮層的真皮面，刮除真皮層的表皮面，并適當(dāng)將表皮層切割成碎片，即可獲得一定量的分離的細(xì)胞；
[0072]6.為進(jìn)一步提高細(xì)胞分離量并去除表皮碎片，在3E孔中加入0.5_5ml電解質(zhì)溶液如Hank’S液，置入磁力攪拌子，將刮除后所得到的細(xì)胞溶液及表皮碎片置于E孔中，常溫下以200 — 1200rpm攪拌5-10分鐘，然后取出可抽取式80目一 200目的過(guò)濾網(wǎng)，在3E孔中即可獲得約0.5-5ml含分離細(xì)胞的溶液，以注射器抽吸細(xì)胞溶液，待用。
[0073]所述的分離細(xì)胞主要由表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及黑色素細(xì)胞組成，其中表皮細(xì)胞占85%、成纖維細(xì)胞占11%，黑色素細(xì)胞占4%，細(xì)胞活性為90%。
[0074]以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述的實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可以作出種種的等同的變型或替換，這些等同變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，其特征在于，該裝置包括: 磁力加熱攪拌器和操作面板，所述的操作面板鑲嵌于磁力加熱攪拌器上，二者形成一個(gè)整體； 所述的操作面板上設(shè)有3個(gè)以上孔，其中一個(gè)孔為磁力攪拌及過(guò)濾孔，其內(nèi)放置一個(gè)磁力攪拌子，所述的磁力攪拌子的直徑為0.1?Icm,長(zhǎng)度為0.4?2cm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，其特征在于，所述的磁力加熱攪拌器，控制溫度為25?40攝氏度，攪拌速度為100 ?1200rpmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，其特征在于，所述的操作面板上設(shè)有3?5個(gè)孔，各孔分別為:一個(gè)消化孔；一到三個(gè)漂洗孔；一個(gè)磁力攪拌及過(guò)濾孔，所述的磁力攪拌及過(guò)濾孔內(nèi)裝有可抽取式80目?200目的過(guò)濾網(wǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，其特征在于，所述的消化孔，呈圓形、正方形或其它任意形狀，直徑為I?5cm，深度為I?5cm ； 所述的漂洗孔，為圓形、正方形或其它任意形狀，直徑為I?5cm,深度為I?5cm ; 所述的磁力攪拌及過(guò)濾孔，直徑為0.5?5cm,深度為0.5?5cm,孔內(nèi)裝有可抽取式80目?200目的過(guò)濾網(wǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，其特征在于，操作面板為長(zhǎng)方體，長(zhǎng)度為1cm?30cm,寬度為1cm?30cm,高度為 5cm ?40cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1一5任一所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，其特征在于，該裝置還包括: 消化酶，為由膠原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶組成的固態(tài)消化酶，優(yōu)選的所述的膠原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶的重量比為1:1:1; 等滲電解質(zhì)溶液，為Ph值7.4的電解質(zhì)溶液生理鹽水、PBS液、D-hank’s液，或Hank’S液； 一次性手術(shù)刀； 一次性手術(shù)用鑷子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的裝置，其特征在于，該裝置還包括:注射器，為lml、2.5ml或5ml常規(guī)注射器。
8.一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: A、將消化酶溶解于等滲電解質(zhì)溶液中，配制成質(zhì)量濃度為0.1%?1%的消化液，加入消化孔中，啟動(dòng)微型磁力加熱攪拌器，預(yù)熱5?10分鐘，使溶液溫度為25?40攝氏度； B、將需要分離的斷層皮片，處理成厚度為0.15?0.6mm,大小為0.5cm2?16cm2 ； C、將切取步驟B的斷層皮片置于消化孔中孵育5?45分鐘； D、漂洗孔中加入等滲電解質(zhì)溶液，將孵育后的斷層皮片進(jìn)行漂洗； E、將漂洗后的斷層皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手術(shù)用鑷子揭起、分離表皮層，用一次性手術(shù)刀刮除表皮層的真皮面數(shù)次，并刮除真皮層的表皮面數(shù)次，得到少量的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液； F、在磁力攪拌及過(guò)濾孔中加入等滲電解質(zhì)溶液，將所獲得的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液置于磁力攪拌及過(guò)濾孔中過(guò)濾，然后取出可抽取式80目?200目的過(guò)濾網(wǎng)，即可獲得含分離細(xì)胞的溶液； G、進(jìn)一步優(yōu)選的方案為，將漂洗后的斷層皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手術(shù)用鑷子揭起、分離表皮層，用一次性手術(shù)刀刮除表皮層的真皮面數(shù)次，并刮除真皮層的表皮面數(shù)次，得到少量的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液。然后用手術(shù)刀將表皮層適當(dāng)切割成碎片，將所獲得的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液及表皮碎片置于預(yù)先加入等滲電解質(zhì)溶液的磁力攪拌及過(guò)濾孔中，常溫下以100?1200rpm攪拌5?10分鐘，然后取出可抽取式80目?200目的過(guò)濾網(wǎng)，在磁力攪拌及過(guò)濾孔中即可獲得含分離細(xì)胞的溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟Ajf0.001?0.02克消化酶溶解于2?1ml等滲電解質(zhì)溶液D-hank’ s液中，配制成質(zhì)量濃度為0.1%?I %的消化液，加入消化孔中，啟動(dòng)微型磁力加熱攪拌器，預(yù)熱5-10分鐘，使溶液溫度為25?40攝氏度。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟D、一到三個(gè)漂洗孔中分別加入等滲電解質(zhì)溶液Hank’ S液，取出孵育后的斷層皮，分別于一到三個(gè)漂洗孔中漂洗I?3次。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種快速即時(shí)分離人皮膚表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟G、在磁力攪拌及過(guò)濾孔中加入0.2?5ml等滲電解質(zhì)溶液Hank’ S液，置入磁力攪拌子，將刮除后所得到的含細(xì)胞及部分雜質(zhì)的溶液及表皮碎片置于E孔中，常溫下以100?1200rpm攪拌5-10分鐘，然后取出可抽取式80目?200目的過(guò)濾網(wǎng)，在E孔中即可獲得含分離細(xì)胞的溶液。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK104232475SQ201410475101
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】肖仕初, 田松, 夏照帆, 吳海斌, 鄭勇軍, 王志紅, 紀(jì)世召 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)