一種豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星dna分子標記的構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，該方法通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選到含有豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星重復序列的Unigene，然后在Unigene序列中檢測到微衛(wèi)星位點；根據(jù)位點兩端序列設計微衛(wèi)星標記的特異性引物，并檢測其多態(tài)性，開發(fā)豹紋鰓棘鱸多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記。并進一步驗證了其中7個豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記，本發(fā)明中的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記可應用于豹紋鰓棘鱸種群的種群遺傳結構和遺傳育種等研究。
【專利說明】一種豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微衛(wèi)星分子標記【技術領域】，具體涉及一種豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子 標記的構建方法。

【背景技術】
[0002] 豹紋觸棘S盧（PlectropomusIeopardus)隸屬于S盧形目、飽科、觸棘S盧屬，是我國 重要南方重要的養(yǎng)殖魚類。近些年來，高強度的捕撈壓力已經(jīng)使得豹紋鰓棘鱸資源處于 過度捕撈狀態(tài)。為了保護和管理豹紋鰓棘鱸漁業(yè)資源，研究其種群遺傳結構和遺傳變異 水平是非常必要的。微衛(wèi)星分子標記因具有多態(tài)性高、共顯性等優(yōu)點已經(jīng)成為目前海水 魚類群體遺傳分析最常用的手段。然而，迄今為止針對豹紋鰓棘鱸開發(fā)的微衛(wèi)星分子標 記只有 35 個（MolecularEcologyResources9:1485 - 1487!Conservationgenetics Resources5:1067 - 1069!ConservationgeneticsResources2:101 - 103)，數(shù)量非常有 限，亟待開發(fā)更多新的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星分子標記。另一方面，目前豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星開發(fā) 主要采用富集文庫法，需要進行DNA提取、基因組文庫構建、探針雜交富集、克隆篩選等步 驟，費時費力，通常只能得到數(shù)十個標記。因此急需一種豹紋鰓棘鱸高效的微衛(wèi)星分子標記 開發(fā)技術。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，該方法 高效、簡便，耗時短，能一次開發(fā)較多豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星分子標記。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：一種豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分 子標記的構建方法，含有以下步驟：
[0005] (1)豹紋鰓棘鱸轉(zhuǎn)錄組測序提取豹紋鰓棘鱸樣品的總RNA，經(jīng)含mRNA富集、片 段化mRNA、合成cDNA、末端修復以及加"A"連接工序，建立測序文庫，采用IlluminaHi SeqTM2000測序，獲得豹紋鰓棘鱸原始序列；
[0006] (2)豹紋鰓棘鱸Unigene的獲得及微衛(wèi)星位點的檢測將轉(zhuǎn)錄組測序獲得的原始序 列去除接頭和Q值< 10的低質(zhì)量片段序列后獲得高質(zhì)量序列，高質(zhì)量序列進行從頭組裝得 到豹紋觸棘S盧的Unigene,然后在Unigene序列中進行微衛(wèi)星位點查找，得到多個微衛(wèi)星位 占.
[0007] (3)選取多個微衛(wèi)星位點中的部分微衛(wèi)星位點進行驗證，根據(jù)該部分微衛(wèi)星位點 的兩端序列設計該微衛(wèi)星位點的特異性引物，提取豹紋鰓棘鱸基因組DNA，采用該微衛(wèi)星位 點的特異性引物進行PCR擴增，采用軟件CerVus2. 0進行檢測，檢測到的部分微衛(wèi)星位點 即為豹紋鰓棘鱸的部分微衛(wèi)星DNA分子標記，根據(jù)不同的微衛(wèi)星位點設計不同的特異性引 物，即可逐一驗證不同微衛(wèi)星位點的DNA分子標記。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明步驟（2)中采用軟件Trinity對高質(zhì) 量序列進行從頭組裝得到88813個豹紋觸棘S盧的Unigene,然后用軟件MicroSAtellite在 Unigene序列中進行微衛(wèi)星位點查找，得到14649個微衛(wèi)星位點，微衛(wèi)星位點查找時重復次 數(shù)為4?39,其中3716個為單核苷酸重復序列，6332個為二核苷酸重復序列，4020個為三 核苷酸重復序列，310個為四核苷酸重復序列，153個為五核苷酸重復序列，118個為六核苷 酸重復序列。
[0009] 實際上，根據(jù)不同的軟件或者不同的測序條件Unigene和微衛(wèi)星位點的數(shù)量會有 稍微的變化，以上僅為采用本發(fā)明中的軟件和測序條件而獲得的一種優(yōu)選的實施方式。
[0010] 本發(fā)明步驟（3)中優(yōu)選選取多個微衛(wèi)星位點中的7個微衛(wèi)星位點進行驗證，該7 個微衛(wèi)星位點的特異性引物如SEQID:1?14所示。
[0011] 實際上，根據(jù)檢測到的14649個位點設計特異性引物會有成千上萬，本發(fā)明提供 這7對引物只是做驗證，驗證根據(jù)這些檢測到的位點可以設計引物把它擴增出來，從而證 明這種方法可以檢測到大量的開發(fā)微衛(wèi)星位點并可以根據(jù)這些位點設計特異性引物。
[0012] 本發(fā)明對于剩余的其他位點，也需要設計其他引物擴增出來，本發(fā)明僅是隨機檢 測了其中的7個，就是說明可以采用本發(fā)明中的方法，對所有的微衛(wèi)星位點如14649個進行 確認。
[0013] 本發(fā)明步驟（3)中特異性引物的設計時引物長度優(yōu)選為20?25bp，退火溫度優(yōu)選 為50?60度，PCR擴增產(chǎn)物長度優(yōu)選在100?400bp。
[0014] 本發(fā)明步驟（3)中PCR擴增時采用的反應體系優(yōu)選為：在20μL反應體系中包括： 0.5以]?特異性引物，0.21111(1階？，1.511111%(：12，1\?0?1311打61'，川了&9〇嫩聚合酶以及50叩 模板DNA，反應程序：94°C5min，94°C30s，每個微衛(wèi)星位點的退火溫度30s，72°C30s，最后 延伸5min。
[0015] 本發(fā)明步驟（3)中獲得的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記可應用于豹紋鰓棘鱸種 群的種群遺傳結構和遺傳育種研究。
[0016] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：本發(fā)明可以一次性檢測到大量的開發(fā)微 衛(wèi)星位點并可以根據(jù)這些位點設計特異性引物，該方法高效、簡便，耗時短。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是實施例1中轉(zhuǎn)錄組測序獲得的豹紋觸棘S盧Unigene;
[0018] 圖2是實施例1中在Unigene序列中檢測到的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星位點；
[0019] 圖3是實施例1中位點DXl?DX7在30尾豹紋鰓棘鱸基因組DNA的 MICROSATELLITE分型圖。

【具體實施方式】
[0020] 下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
[0021] 實施例1
[0022] 豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，含以下步驟：
[0023] 1、豹紋鰓棘鱸轉(zhuǎn)錄組測序：
[0024] 采用常規(guī)Trizol法提取樣品總RNA，DNaseI酶消化總RNA中的DNA，通過帶有 Oligo(dT)的磁珠與mRNA的3'polyA在相互吸附從而富集mRNA，加熱下將mRNA與打斷試 劑作用后，在冰上用乙醇沉淀回收產(chǎn)物，在PCR儀上合成雙鏈cDNA，在Thermomixer中進行 末端修復，使修復產(chǎn)物在3'末端加上堿基A，再使adapter和加〃A〃產(chǎn)物連接，純化回收擴 增構建文庫，使用IlluminaHiSeq?2000測序。
[0025] 2、豹紋鰓棘鱸Unigene的獲得及微衛(wèi)星位點的檢測
[0026] 將轉(zhuǎn)錄組測序獲得的原始序列用去除接頭和低質(zhì)量（質(zhì)量值Q< 10)片段序列 之后獲得高質(zhì)量序列，再使用軟件Trinity對序列進行從頭組裝得到豹紋鰓棘鱸88813個 Unigene(圖1)，然后用軟件MicroSAtellite(MISA)在Unigene序列中檢測14649個微衛(wèi) 星位點，其中，3716個為單核苷酸重復序列，6332個為二核苷酸重復序列，4020個為三核苷 酸重復序列，310個為四核苷酸重復序列，153個為五核苷酸重復序列，118個為六核苷酸重 復序列，重復次數(shù)4-39 (表1，圖2)，選取其中的7個微衛(wèi)星位點，再用軟件Primer3根據(jù)這 7個微衛(wèi)星位點兩端序列設計微衛(wèi)星標記的特異性引物。
[0027] 3、豹紋鰓棘鱸多態(tài)性微衛(wèi)星位點的驗證
[0028] 提取30尾豹紋鰓棘鱸基因組DNA，用7對特異性引物進行PCR擴增，反應體系為 20μ?:0·5μΜ引物，0.2mMdNTP，1.5mMMgC12，lXPCRbuffer，lUTaqDNA聚合酶以及 50ng模板DNA。反應程序：94°C5min，94°C30s，每個SSR位點最佳退火溫度30s，72°C30s， 最后延伸5min。PCR產(chǎn)物用ABIPRISM3730DNA自動測序儀分離，片段長度用軟件 GeneMapper根據(jù)內(nèi)標R0X-500確定。軟件Cervus2. 0檢測7個微衛(wèi)星位點（DX1?DX7)的等 位基因數(shù)目為4-12,觀測雜合度和期望雜合度分別為0. 1180-0. 2432和0. 7568-0. 8820 (表 2,圖 3)。
[0029] 表1豹紋鰓棘鱸轉(zhuǎn)錄組測序檢測到的微衛(wèi)星位點
[0030]
[

【權利要求】
1. 一種豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，其特征是含有以下步驟： (1) 豹紋鰓棘鱸轉(zhuǎn)錄組測序提取豹紋鰓棘鱸樣品的總RNA，經(jīng)含mRNA富集、片段 化mRNA、合成cDNA、末端修復以及加"A"連接工序，建立測序文庫，采用Illumina Hi SeqTM2000測序，獲得豹紋鰓棘鱸原始序列； (2) 豹紋鰓棘鱸Unigene的獲得及微衛(wèi)星位點的檢測將轉(zhuǎn)錄組測序獲得的原始序列去 除接頭和Q值< 10的低質(zhì)量片段序列后獲得高質(zhì)量序列，高質(zhì)量序列進行從頭組裝得到豹 紋觸棘S盧的Unigene，然后在Unigene序列中進行微衛(wèi)星位點查找，得到多個微衛(wèi)星位點； (3) 選取多個微衛(wèi)星位點中的部分微衛(wèi)星位點進行驗證，根據(jù)該部分微衛(wèi)星位點的兩 端序列設計該微衛(wèi)星位點的特異性引物，提取豹紋鰓棘鱸基因組DNA，采用該微衛(wèi)星位點的 特異性引物進行PCR擴增，采用軟件Cervus2.0進行檢測，檢測到的部分微衛(wèi)星位點即為豹 紋鰓棘鱸的部分微衛(wèi)星DNA分子標記，根據(jù)不同的微衛(wèi)星位點設計不同的特異性引物，即 可逐一驗證不同微衛(wèi)星位點的DNA分子標記。
2. 根據(jù)權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，其特征是： 步驟（2)中采用軟件Trinity對高質(zhì)量序列進行從頭組裝得到88813個豹紋鰓棘鱸的 Unigene，然后用軟件MicroSAtellite在Unigene序列中進行微衛(wèi)星位點查找，得到14649 個微衛(wèi)星位點，微衛(wèi)星位點查找時重復次數(shù)為4?39,其中3716個為單核苷酸重復序列， 6332個為二核苷酸重復序列，4020個為三核苷酸重復序列，310個為四核苷酸重復序列， 153個為五核苷酸重復序列，118個為六核苷酸重復序列。
3. 根據(jù)權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，其特征是：步 驟（3)中選取多個微衛(wèi)星位點中的7個微衛(wèi)星位點進行驗證，該7個微衛(wèi)星位點的特異性 引物如SEQ ID :1?14所示。
4. 根據(jù)權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，其特征是：步 驟⑶中特異性引物的設計時引物長度20?25bp，退火溫度50?60度，PCR擴增產(chǎn)物長 度在100?400bp。
5. 據(jù)權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，其特征是：步驟 (3)中PCR擴增時采用的反應體系：在20 ii L反應體系中包括：0. 5 ii M特異性引物，0. 2mM dNTP，1.5mM MgCl2，lXPCR buffer，lU Taq DNA 聚合酶以及 50ng 模板 DNA，反應程序： 94°C 5min，94°C 30s，每個微衛(wèi)星位點的退火溫度30s，72°C 30s，最后延伸5min。
6. 據(jù)權利要求1所述的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記的構建方法，其特征是：步驟 (3)中獲得的豹紋鰓棘鱸微衛(wèi)星DNA分子標記可應用于豹紋鰓棘鱸種群的種群遺傳結構和 遺傳育種研究。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357547SQ201410476390
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權日:2014年9月17日
【發(fā)明者】蒙子寧, 謝楨楨, 于萃平, 李波, 劉曉春, 張勇, 林浩然 申請人:中山大學