一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成萊鮑迪苷a中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組畢赤酵母工程菌及將其用作全細胞催化劑合成萊鮑迪苷A的方法。本發(fā)明的重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達載體線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母而獲得：編碼蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQIDNO.3所示，編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的DNA序列如SEQIDNO.4所示。本發(fā)明的重組畢赤酵母工程菌實現(xiàn)Sus1的胞內(nèi)表達和UGT76G1的表面展示表達，將本發(fā)明重組畢赤酵母用作全細胞催化劑可有效地用于合成萊鮑迪苷A，不僅提高了萊鮑迪苷A的合成效率和原料使用率、節(jié)約生產(chǎn)成本，并為萊鮑迪苷A的生產(chǎn)加工開辟新的工業(yè)化途徑。
【專利說明】一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成萊鮑迪苷A中的應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術領域】，尤其涉及一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成萊鮑迪苷A中的應用。

【背景技術】
[0002]甜菊糖(Stev1l glycoside)是一種具有很多優(yōu)良特性的高甜度天然甜味劑,在食品、飲料、釀酒、醫(yī)藥、日用化工等領域均有著巨大的應用價值。甜菊糖帶有后苦味和甘草異味，混合物組分復雜，難以對其質(zhì)量規(guī)格進行統(tǒng)一，限制其應用。甜菊苷(Stev1side)和萊鮑迪苷A (Rebaud1side A)是甜菊糖中含量最豐富的兩種成分,分別占干葉重的5_10%和2-4%。萊鮑迪苷A (RA)是一種無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜昧劑，其甜度是蔗糖的150-300倍，熱值僅為蔗糖的I /300，而且口味純正，沒有后苦味；因而具有巨大的應用價值。目前制備高純度萊鮑迪苷A產(chǎn)品的方法有:培育高產(chǎn)萊鮑迪苷A的甜葉菊品種、樹脂吸附或重結(jié)晶提純?nèi)R鮑迪苷A、環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶等酶對甜菊糖進行改性，但都存在工藝繁瑣、成本高、效果不佳等缺點。那么，是否能夠從萊鮑迪苷A (RA)的生物合成途徑入手，結(jié)合基因工程技術、構(gòu)建一種以相應底物為基礎，通過發(fā)酵高效合成萊鮑迪苷A (RA)的工程菌，并將其運用于萊鮑迪苷A (RA)的合成加工領域，以提高萊鮑迪苷A (RA)的合成效率、節(jié)約生產(chǎn)成本，并為萊鮑迪苷A (RA)的生產(chǎn)加工開辟新的工業(yè)化途徑就顯得十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明所解決的技術問題在于克服現(xiàn)有技術中不足，提供一種共表達蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的重組畢赤酵母工程菌及其構(gòu)建方法。
[0004]本發(fā)明所解決的技術問題還在于將共表達蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的重組畢赤酵母工程菌作為全細胞催化劑用于合成萊鮑迪苷A。
[0005]為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種重組畢赤酵母工程菌，該重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達載體線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母而獲得:
編碼蔗糖合成酶基因的DNA序列如SEQ ID N0.3所示，
編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列如SEQ ID N0.4所示。
[0006]其中，所述表達載體包括胞內(nèi)表達載體和表面展示表達載體,所述胞內(nèi)表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶基因的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列。
[0007]優(yōu)選地，所述胞內(nèi)表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPICZA而獲得胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合后克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPIC9K而獲得的表面展示表達載體pGCW61- UGT76G1。
[0008]另外，本發(fā)明還提供了一種重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟: 步驟一、編碼基因的獲取:以蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的氨基酸序列為基礎，對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優(yōu)化，得到密碼子優(yōu)化的對應編碼序列；其中，蔗糖合成酶Susl氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼序列如SEQ ID N0.3所示；UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編碼序列如SEQ IDN0.4所示；
步驟二、表達載體的構(gòu)建:將步驟一獲取的編碼基因分別接入畢赤酵母的表達載體中，所述表達載體包括胞內(nèi)表達載體和表面展示表達載體，所述胞內(nèi)表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶Susl的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的DNA序列；
步驟三、表達載體轉(zhuǎn)化及重組畢赤酵母工程菌獲取:將表面展示表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌，再將胞內(nèi)表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌；或者，將將胞內(nèi)表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌；再將表面展示表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌。
[0009]優(yōu)選地，所述胞內(nèi)表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPICZA而獲得胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合后克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPIC9K而獲得的表面展示表達載體pGCW61- UGT76G1。
[0010]優(yōu)選地，所述步驟三具體包括:將表面展示表達載體PGCW61-UGT76G1經(jīng)Kpn2 I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GSl 15感受態(tài)細胞，并在MD平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而得到工程菌GS115/ UGT76G1 ;再將胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl經(jīng)Pme I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化上述GSl 15/ UGT76G1感受態(tài)細胞，并在博來霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌GS115/ Susl- UGT76G1。
[0011]另外，本發(fā)明還提供了一種全細胞催化劑，包含本發(fā)明的重組畢赤酵母工程菌。
[0012]優(yōu)選地，所述全細胞催化劑是通過如下步驟制備而成:
Cl)挑取上述重組畢赤酵母工程菌接種至BMGY培養(yǎng)基進行初級培養(yǎng)至0D600接近
5.0-6.0，離心收集細胞；
(2)然后將收集的細胞重懸到BMMY培養(yǎng)基至起始0D600接近0.5-1.0，于25_35°C條件下進行次級培養(yǎng)，次級培養(yǎng)過程中每天補加終濃度1%甲醇，發(fā)酵3天后在離心回收菌體；
(3)菌體凍干后即得到含重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑。
[0013]另外，本發(fā)明還提供了一種萊鮑迪苷A的合成方法，該方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷為原料，以本發(fā)明的全細胞催化劑為催化劑合成萊鮑迪苷A。
[0014]優(yōu)選地，該方法包括如下步驟:
(O按如下組分及其濃度制備反應體系；
50mM PBS緩沖液，
3mM MgCl2，
250 mM鹿糖，
0.5-lmM UDP,
3mg/mL甜菊苷；
(2)向反應體系中加入菌體量為300D含有重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑，于37°C進行反應12h后終止反應；
(3)每200ul反應液用600ul正丁醇萃取反應體系中的萊鮑迪苷A，吸取上層正丁醇萃取液而后進行純化分離得到萊鮑迪苷A。
[0015]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明優(yōu)點在于:
本發(fā)明構(gòu)建得到的重組畢赤酵母工程菌能同時實現(xiàn)蔗糖合成酶Susl的胞內(nèi)表達和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的表面展示表達。而從原理上講蔗糖合成酶Susl能夠?qū)⒄崽堑奶腔D(zhuǎn)移至Μ)Ρ上生成UDPG和果糖，而UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1能特異性地催化ST苷和M)PG反應合成RA。因此，利用本發(fā)明共表達蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的重組畢赤酵母能有效地將上述兩步反應聯(lián)合起來，以甜菊苷(ST)為原料、蔗糖為糖基供體，進行生物轉(zhuǎn)化高效合成合成萊鮑迪苷A (RA)。由本發(fā)明具體實施例中的實驗結(jié)果也充分表明采用本發(fā)明方案發(fā)酵獲得的全細胞催化劑可高效合成萊鮑迪苷A (RA)，其底物ST的轉(zhuǎn)化率達到95%以上，產(chǎn)量超過93%，不僅提高了萊鮑迪苷A (RA)的合成效率和原料使用率、節(jié)約生產(chǎn)成本，并為萊鮑迪苷A (RA)的生產(chǎn)加工開辟新的工業(yè)化途徑。
[0016]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】進一步詳細描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為重組畢赤酵母全細胞催化劑合成RA。A、B分別為反應前后的液相色譜檢測結(jié)果。ST和RA的出峰時間分別為6.1 min和7.8 min左右。
[0018]圖2為重組畢赤酵母全細胞催化劑循環(huán)使用能力的檢測。
[0019]圖3為合成體系中UDP添加量對RA產(chǎn)量的影響。

【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合具體制備實施例和應用實施例，對本發(fā)明作進一步詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0021]實施例1
基因Susl和UGT76G1的合成
以NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)公布的氨基酸序列為基礎,對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優(yōu)化，得到密碼子優(yōu)化的Susl和UGT76G1基因，其序列分別如Seq N0.3和Seq N0.4所示，通過生物技術公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)進行全基因合成，合成的基因克隆在PUC57質(zhì)粒(購自金斯瑞生物科技公司)上，得到質(zhì)粒pUC57-Susl和 pUC57- UGT76G1。
[0022]實施例2
胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl和展示表達載體pGCW61-UGT76Gl的構(gòu)建
根據(jù)Susl基因序列設計正向引物SF (含EcoR I酶切位點)和反向引物SR (含Not I酶切位點)。以實施例1中的質(zhì)粒PUC57- Susl為模板，SF和SR為引物進行PCR擴增。將膠回收純化后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進行雙酶切，與同樣經(jīng)過EcoR I和Not I雙酶切的質(zhì)粒pPICZA用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物化學轉(zhuǎn)化E.coli ToplO(購自美國Invitrogen英杰生命技術有限公司)，經(jīng)博萊霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切鑒定正確后，得到胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl。含有重組質(zhì)粒pPICZA-Susl的克隆菌株E.coli ToplO/ pPICZA-Susl加15%甘油于_80°C保存。
[0023]根據(jù)UGT76G1基因設計正向引物UF (含EcoR I酶切位點)和反向引物UR (含MluI酶切位點)。以實施例1中的質(zhì)粒PUC57-UGT76G1為模板，UF和UR為引物進行PCR擴增。將膠回收純化后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Mlu I進行雙酶切。根據(jù)畢赤酵母錨定蛋白Gcw61p的編碼基因設計正向引物GF (含Mlu I酶切位點)和反向引物GR (含NotI酶切位點)。以畢赤酵母基因組為模板，GF和GR為引物進行PCR擴增。將膠回收純化后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Mlu I和Not I進行雙酶切。將上述兩個片段與經(jīng)過EcoR I和Not I雙酶切的質(zhì)粒PPIC9K用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物化學轉(zhuǎn)化E.coli ToplO(購自美國Invitrogen英杰生命技術有限公司)，經(jīng)卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后，得到展示表達載體PGCW61-UGT76G1。含有重組質(zhì)粒pGCW61- UGT76G1 的克隆菌株 E.coli ToplO/ pGCW61_ UGT76G1 加入 15% 甘油于 _80°C保存。
[0024]實施例3
重組畢赤酵母工程菌GS115/Susl-UGT76Gl的構(gòu)建及全細胞催化劑的獲得將展示表達載體PGCW61-UGT76G1經(jīng)Kpn2 I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115 (購自美國Invitrogen英杰生命技術有限公司)感受態(tài)細胞,并在MD平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子；從而得到工程菌GS115/ UGT76G1。將胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl經(jīng)Pme I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化上述GS115/ UGT76G1感受態(tài)細胞，并在博來霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子；進而得到重組畢赤酵母工程菌GS115/ Susl- UGT76G1。
[0025]挑取上述重組畢赤酵母工程菌GSl 15/ Susl-UGT76G1接種至BMGY培養(yǎng)基，30°C，250rpm培養(yǎng)至0D600接近6.0,于6000rpm，4°C離心5min收集細胞，然后將收集的細胞重懸到BMMY培養(yǎng)基至起始0D600接近1.0，于30°C，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補加終濃度1%甲醇。發(fā)酵3天后在6000rpm，4°C離心5min回收菌體；菌體凍干后即得到重組畢赤酵母全細胞催化劑。
[0026]實施例4
重組畢赤酵母全細胞催化劑合成萊胞迪苷A
200ul反應體系包含以下成分:50mM PBS緩沖液，3mM MgC12，250 mM蔗糖，ImM UDP,3mg/mL ST (甜菊苷)。加入菌體量為300D重組畢赤酵母全細胞催化劑，于37°C進行反應。反應12h后停止反應,每200ul反應液用600ul正丁醇萃取產(chǎn)物RA。吸取上層正丁醇萃取液，用0.2um有機系尼龍膜過濾后用液相色譜檢測RA的合成。
[0027]甜菊苷(ST)和萊鮑迪苷A (RA)的出峰時間為6.1 min和7.8 min左右。由圖1可知，反應12h后大部分ST被消耗，同時RA大量生成。實驗表明Susl在重組酵母胞內(nèi)活性表達，反應物蔗糖和Μ)Ρ進入細胞后在Susl的作用下生成UDPG和果糖。生成的UDPG從胞內(nèi)運出，在表面展示UGT76G1的催化下與ST反應生成產(chǎn)物RA。進一步計算得到，ST的轉(zhuǎn)化率為95.56%,同時RA的產(chǎn)率為93.79%。
[0028]實施例5
重組畢赤酵母全細胞催化劑循環(huán)使用能力的檢測
循環(huán)使用能力是全細胞催化劑的一個重要性能指標，因而要對的重組畢赤酵母全細胞催化劑的循環(huán)使用能力進行評價。將實施3中獲取的重組畢赤酵母加入反應體系，控制RA合成體系中的菌體量為300D，將反應12h后的反應液于9000rpm離心2 min，上清液取出保存于-20 ° C待用，用于測量RA的產(chǎn)量。菌體用pH7.2的0.05M PBS緩沖液洗滌兩次，再次加入RA合成體系進行RA的合成。重復上述操作共進行五次反應，每個反應設3組平行，最后用液相色譜檢測RA的生成，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，以第一次RA產(chǎn)量為100%，第二次反應的RA產(chǎn)量略有降低，而第三次重復使用時RA產(chǎn)量下降至51.61%。因此，循環(huán)使用次數(shù)應控制在三次以內(nèi)，最好不要超過兩次。
[0029]實施例6
萊胞迪苷A合成體系中UDP添加量的優(yōu)化
RA合成體系中UDP的價格相對較高，為控制RA合成成本、提高合成反應的經(jīng)濟性，對反應體系中UDP的添加量進行優(yōu)化。在200ul反應體系中添加不同濃度的UDP (0,0.25、
0.5、0.75、lmmol/L)，全細胞催化劑的量控制為300D。37。C反應12h，液相檢測RA的產(chǎn)量。如圖3所示,體系中不添加UDP,合成反應無法啟動,沒有RA生成。隨著UDP添加量的增加，RA的合成也相應增加。添加量大于0.25 mmol/L時，RA的生成量變化并不明顯。在進行RA合成反應時，應綜合根據(jù)UDP的成本和RA的產(chǎn)量選擇適和的UDP添加量。
[0030]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，所述重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達載體線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母而獲得: 編碼蔗糖合成酶Susl的DNA序列如SEQ ID N0.3所示， 編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的DNA序列如SEQ ID N0.4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于:所述表達載體包括胞內(nèi)表達載體和表面展示表達載體，所述胞內(nèi)表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶Susl基因的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼Μ)Ρ-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的DNA序列。
3.如權(quán)利要求2所述的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于:所述胞內(nèi)表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pPICZA而獲得胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合后克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pPIC9K而獲得的表面展示表達載體pGCW61- UGT76G1。
4.一種重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、編碼基因的獲取:以蔗糖合成酶Susl和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的氨基酸序列為基礎，對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優(yōu)化，得到密碼子優(yōu)化的對應編碼序列；其中，蔗糖合成酶Susl氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼序列如SEQ ID N0.3所示；UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編碼序列如SEQ IDN0.4所示； 步驟二、表達載體的構(gòu)建:將步驟一獲取的編碼基因分別接入畢赤酵母的表達載體中，所述表達載體包括胞內(nèi)表達載體和表面展示表達載體，所述胞內(nèi)表達載體克隆有編碼蔗糖合成酶Susl的DNA序列，所述表面展示表達載體克隆有編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1的DNA序列； 步驟三、表達載體轉(zhuǎn)化及重組畢赤酵母工程菌獲取:將表面展示表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌，再將胞內(nèi)表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌；或者，將將胞內(nèi)表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而得到初級重組畢赤酵母工程菌；再將表面展示表達載體經(jīng)酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化初級重組畢赤酵母工程菌的感受態(tài)細胞，并在選擇培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述胞內(nèi)表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pPICZA而獲得胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl ;所述表面展示表達載體是將如SEQ ID N0.3所示的DNA序列與錨定蛋白Gcw61編碼基因融合后克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體PPIC9K而獲得的表面展示表達載體PGCW61- UGT76G1。
6.如權(quán)利要求5所述的重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟三具體包括:將表面展示表達載體PGCW61-UGT76G1經(jīng)Kpn2 I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115感受態(tài)細胞，并在MD平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而得到工程菌GS115/ UGT76G1 ;再將胞內(nèi)表達載體pPICZA-Susl經(jīng)Pme I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化上述GS115/ UGT76G1感受態(tài)細胞，并在博來霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進而得到重組畢赤酵母工程菌GS115/ Susl- UGT76G1。
7.—種全細胞催化劑，其特征在于:包含如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的重組畢赤酵母工程菌。
8.如權(quán)利要求7所述的全細胞催化劑，其特征在于，所述全細胞催化劑是通過如下步驟制備而成: Cl)挑取上述重組畢赤酵母工程菌接種至BMGY培養(yǎng)基進行初級培養(yǎng)至0D600接近5.0-6.0，離心收集細胞； (2)然后將收集的細胞重懸到BMMY培養(yǎng)基至起始0D600接近0.5-1.0，于25_35°C條件下進行次級培養(yǎng)，次級培養(yǎng)過程中每天補加終濃度1%甲醇，發(fā)酵3天后在離心回收菌體； (3)菌體凍干后即得到含重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑。
9.一種萊鮑迪苷A的合成方法，其特征在于:該方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷為原料，以權(quán)利要求7或8中所述的全細胞催化劑為催化劑合成萊鮑迪苷A。
10.如權(quán)利要求9所述的萊鮑迪苷A的合成方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (O按如下組分及其濃度制備反應體系； .50mM PBS緩沖液，
.3mM MgCl2， .250 mM鹿糖，
.0.5-lmM UDP, 3mg/mL甜菊苷； (2)向反應體系中加入菌體量為300D含有重組畢赤酵母工程菌的全細胞催化劑，于37°C進行反應12h后終止反應； (3)每200ul反應液用600ul正丁醇萃取反應體系中的萊鮑迪苷A，吸取上層正丁醇萃取液而后進行純化分離得到萊鮑迪苷A。
【文檔編號】C12N1/19GK104232496SQ201410477408
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】林影, 梁書利, 毛國紅, 劉曉肖, 王蓓蓓 申請人:廣州康琳奈生物科技有限公司