一種豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒中含有由一條反轉(zhuǎn)錄引物和四條擴(kuò)增引物組成的引物組；所述反轉(zhuǎn)錄引物為序列表中序列1所示的單鏈DNA;所述四條擴(kuò)增引物為序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示的四條單鏈DNA。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的引物組及其試劑盒具有廣譜性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短等特點(diǎn)，適用于進(jìn)出境口岸及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上豇豆花葉病毒屬病毒的快速檢測(cè)與監(jiān)測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒及 其檢測(cè)方法，特別涉及用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的引物組、試劑盒及其檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] Slii花葉病毒屬（Comovirus)是類小 RNA 病毒目（Picornavirales)、伴生Slii病 毒科（Secoviridae)中的八個(gè)病毒屬之一，與蠶豆病毒屬（Fabavirus)、線蟲傳多面體病毒 屬（Nepovirus)組成紅豆花葉病毒亞科（Comovirinae),共有15種病毒成員、1種暫定種。 該類病毒的寄主范圍較窄，已發(fā)現(xiàn)的15種豇豆花葉病毒屬病毒中，有11種病毒僅侵染豆科 植物，如大豆、豇豆、蠶豆等；有3種病毒分別危害茄科、十字花科、葫蘆科等植物；其余2種 分別危害紅三葉草、塊根落葵?；ㄈ~和斑駁是該屬病毒為害的主要癥狀特征，通常不產(chǎn)生環(huán) 斑。該類病毒可以通過(guò)甲蟲介體傳播，尤其是金花蟲科的一些種類，甲蟲保毒能力達(dá)數(shù)日至 數(shù)周。另外，菜豆莢斑駁病毒（BPMV)、蠶豆染色病毒（BBSV)、蠶豆真花葉病毒（BBTMV)、豇 豆花葉病毒（CPMV)、豇豆重花葉病毒（CPSMV)、豌豆輕型花葉病毒（PmiMV)、南瓜花葉病毒 (SqMV)等7種病毒種類還可通過(guò)種子傳播。
[0003] 該類病毒中的多種病毒成員具有十分重要的經(jīng)濟(jì)重要性，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和生態(tài) 安全造成巨大的威脅。豇豆花葉病毒屬病毒的許多成員具有重大檢疫重要性，多種病毒被 世界各國(guó)列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物。其中，安第斯馬鈴薯斑駁病毒（APMoV)被歐洲 與地中海植物保護(hù)組織（EPPO)、加拿大、烏克蘭等國(guó)家或地區(qū)列為檢疫性有害生物；菜豆 莢斑駁病毒（BPMV)被我國(guó)（包括臺(tái)灣地區(qū)）等國(guó)家或地區(qū)列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生 物；菜豆粗縮花葉病毒（BRMV)被臺(tái)灣地區(qū)列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物；蠶豆染色病毒 (BBSV)被我國(guó)（包括臺(tái)灣地區(qū)）等國(guó)家或地區(qū)列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物；蠶豆真花 葉病毒（BBTMV)被摩洛哥、臺(tái)灣等國(guó)家或地區(qū)列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物；豇豆花葉 病毒（CPMV)被臺(tái)灣地區(qū)等列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物；豇豆重型花葉病毒（CPSMV)被 我國(guó)（包括臺(tái)灣地區(qū)）等國(guó)家或地區(qū)列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物；被臺(tái)灣地區(qū)列為禁 止進(jìn)境的檢疫性有害生物還有大豆屬花葉病毒（GMV)、豌豆輕型花葉病毒（PMiMV)JXSW 草斑駁病毒（RCMV)、南瓜花葉病毒（SqMV)、塊根落葵C病毒（UVC)。
[0004] 目前，在植物病毒日常檢測(cè)中，普遍采用血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，特別是ELISA 和RT-PCR方法。ELISA檢測(cè)需要特異的抗體，通常都是需要由專業(yè)的試劑公司制備和提供， 并且國(guó)內(nèi)外檢測(cè)試劑公司提供的ELISA檢測(cè)試劑種類十分有限。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外各 試劑公司提供的豇豆花葉病毒屬病毒抗體共有11種，但并不是常年供應(yīng)，有些病毒種類會(huì) 出現(xiàn)缺貨現(xiàn)象。RT-PCR方法是植物病毒檢測(cè)中使用非常廣泛的另外一種特異性檢測(cè)方法。 目前，世界各國(guó)密切關(guān)注的只有BPMV、CPMV、CPSMV、SqMV等幾種豇豆花葉病毒屬病毒，建立 了這些病毒的特異性RT-PCR。因此，多數(shù)的豇豆花葉病毒屬病毒種類沒(méi)有相應(yīng)的血清學(xué)，特 別是分子檢測(cè)方法。
[0005] 基于簡(jiǎn)并引物的通用RT-PCR檢測(cè)方法由于在一次實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)不同種類 的病毒（屬于同一個(gè)屬或同一個(gè)科的病毒），是一種廣譜的檢測(cè)方法，已越來(lái)越廣泛應(yīng) 用于植物病毒的檢測(cè)鑒定中。豇豆花葉病毒屬所在的伴生豇豆病毒科中，主要是針對(duì) 線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus)病毒開展通用性檢測(cè)。最早是Wetzel等（Wetzel T,Jardak R, Meunier L, et al.Simultaneous RT/PCR detection and differentiation of arabis mosaic and grapevine fanleaf nepoviruses in grapevines with a single pair of primers[J]. Journal of virological methods, 2002, 101(I):63-69.) 報(bào)道了用I對(duì)引物用于同時(shí)檢測(cè)南芥菜花葉病毒（ArMV)和葡萄扇葉病毒（GFLV)、隨后 Digiaro 等人（Digiaro M, Elbeaino T, Martelli G P. Development of degenerate and species-specific primers for the differential and simultaneous RT-PCR detection of grapevine-infecting nepoviruses of subgroups A, B and C[J]. Journal of virological methods, 2007, 141(1) :34-40.)建立用于檢測(cè)及區(qū)分葡萄上線蟲傳多面體病 毒屬不同亞組病毒的通用 RT-PCR 方法、而 Wei&Clover(Wei T, Clover G. Use of primers with 5' non-complementary sequences in RT-PCR for the detection of nepovirus subgroups A and B[J]. Journal of virological methods, 2008, 153(I):16-21.)則 建立了線蟲傳多面體病毒中亞組A和亞組B的通用RT-PCR方法。Ferrer等（Ferrer R M, Luis-Arteaga M, Guerri J, et al. Detection and identification of species of the genus Fabavirus by RT - PCR with a single pair of primers[J]. Journal of virological methods, 2007, 144(I):156-160.)、Panno 等（Panno S, Ferriol I, Rangel E A,et al. Detection and identification of Fabavirus species by one-step RT-PCR and multiplex RT_PCR[J]. Journal of virological methods, 2014, 197:77-82.)分別建立香 豆病毒屬（Fabavirus)的通用RT-PCR檢測(cè)方法。目前，還沒(méi)有針對(duì)豇豆花葉病毒屬的廣譜 性分子檢測(cè)方法，也沒(méi)有專門用于豇豆花葉病毒屬病毒廣譜的檢測(cè)試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用于廣譜檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的引物組。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的引物組，為引物組A或引物組B。
[0008] 所述引物組A具體由一條反轉(zhuǎn)錄引物和四條擴(kuò)增引物組成；所述反轉(zhuǎn)錄引物為序 列表中序列1所示的單鏈DNA ;所述四條擴(kuò)增引物為序列表中序列2、序列3、序列4和序列 5所示的四條單鏈DNA ;
[0009] 所述引物組B具體由四條擴(kuò)增引物組成；所述四條擴(kuò)增引物為序列表中序列2、序 列3、序列4和序列5所示的四條單鏈DNA。
[0010] 其中，序列1由18個(gè)核苷酸組成；序列2由40個(gè)核苷酸組成；序列3由42個(gè)核苷 酸組成；序列4由17個(gè)核苷酸組成；序列5由15個(gè)核苷酸組成。
[0011] 在所述引物組A中，既可以"各引物分別單獨(dú)包裝"，也可以"將所述反轉(zhuǎn)錄引物單 獨(dú)包裝于包裝A中，將所述四條擴(kuò)增引物一同包裝于包裝B中"。如果是前者，可為各引物 的配比可為任意比，如20:1:1:10:10。如果是后者，所述包裝B中，所述四條擴(kuò)增引物的摩 爾比為：序列表中序列2所示的單鏈DNA :序列表中序列3所示的單鏈DNA :序列表中序 列4所示的單鏈DNA :序列表中序列5所示的單鏈DNA具體為I : I : 10 : 10。
[0012] 在所述引物組B中，既可以各引物分別單獨(dú)包裝，也可以混合包裝。如果是前者， 可為各引物的配比可為任意比，如1 : 1 : 10 : 10。如果是后者，所述四條擴(kuò)增引物的摩 爾比為：序列表中序列2所示的單鏈DNA :序列表中序列3所示的單鏈DNA :序列表中序 列4所示的單鏈DNA :序列表中序列5所示的單鏈DNA具體為I : I : 10 : 10。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的試劑。
[0014] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的試劑，具體可包括所述引物組， 以及如下中的至少一種：dNTPs、Mg 2+、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑。
[0015] 在所述試劑中，各物質(zhì)可分別單獨(dú)包裝。
[0016] 在本發(fā)明中，所述DNA聚合酶具體為Taq DNA聚合酶；所述反轉(zhuǎn)錄酶具體為M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶。
[0017] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的試劑盒。
[0018] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的試劑盒，具體可含有所述引物組 或所述試劑，以及作為陽(yáng)性對(duì)照的豇豆花葉病毒屬病毒的病葉凍干粉末（如含有南瓜花葉 病毒的葉片凍干粉末）；和/或作為陰性對(duì)照的水。
[0019] 所述引物組或所述試劑或所述試劑盒在檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有豇豆花葉病毒 屬病毒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有豇豆花葉 病毒屬病毒的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有豇豆花葉病毒屬病毒的方 法，具體可包括如下步驟：
[0022] (1)從所述待測(cè)樣品中提取總RNA，采用所述反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到待 測(cè) cDNA ;
[0023] (2)以所述待測(cè)cDNA作為模板，用所述四條擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn) 物；
[0024] (3)根據(jù)所述PCR產(chǎn)物的大小按照如下方法確定所述待測(cè)樣品中是否含有豇豆花 葉病毒屬病毒：若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為590?650bp的DNA片段，則所述待測(cè)樣品中 含有或候選含有豇豆花葉病毒屬病毒，反之則所述待測(cè)樣品中不含有或候選不含有豇豆花 葉病毒屬病毒。
[0025] 在所述方法的步驟（2)中，用所述四條擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，所述四條擴(kuò)增引 物的摩爾比具體可為：序列表中序列2所示的單鏈DNA :序列表中序列3所示的單鏈DNA :序列表中序列4所示的單鏈DNA :序列表中序列5所示的單鏈DNA為I : I : 10 : 10。
[0026] 進(jìn)一步，步驟⑵的反應(yīng)體系中，Mg2+的終濃度為2. 5mmol/L ;dNTPs的終濃度為 0? 2mmol/L ;引物ComoV-2-F2-M4(序列2)和引物ComoV-2-R2-Ml (序列3)的終濃度均為 0.04iimol/L;引物M4(序列4)和引物Ml (序列5)的終濃度均為0.4iimol/L;Taq DNA聚 合酶的終濃度為〇.〇6U/iiL。
[0027] 在所述方法的步驟（2)中，所述進(jìn)行PCR反應(yīng)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，前5個(gè)循環(huán)的退 火溫度為42°C，后30個(gè)循環(huán)的退火溫度為45°C。
[0028] 更加具體的，步驟（2)的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性45s、42°C 退火45s、72°C延伸60s，如此共5個(gè)循環(huán)；94°C變性45s、45°C退火45s、72°C延伸60s，如此 共30個(gè)循環(huán)；最后72°C繼續(xù)延伸7min，反應(yīng)結(jié)束。
[0029] 在所述方法的步驟（1)中，所述進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為42°C。
[0030] 進(jìn)一步，步驟⑴的反應(yīng)體系中，所述總RNA的體積分?jǐn)?shù)為20 %，引物 Oligo (dT) 18 (序列1)的終濃度為I ii mol/L ;dNTPs的終濃度為0. 5mmol/L ;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 的終濃度為5U/ ii L ;RNA酶抑制劑的終濃度為IU/ ii L。
[0031] 在本發(fā)明中，以上所有的所述待測(cè)樣品均可為植物樣品，如感染了豇豆花葉病毒 屬病毒的植物葉片。
[0032] 所述引物組的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033] 所述制備方法包括將所述引物組中各單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
[0034] 所述引物組在制備所述試劑或所述試劑盒中的應(yīng)用同樣屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035] 在本發(fā)明中，以上所有的所述豇豆花葉病毒屬病毒均可為如下中的任一種或多 種：安弟斯馬鈴薯斑駁病毒、蠶豆真花葉病毒、菜豆莢斑駁病毒、豇豆花葉病毒、豇豆重花葉 病毒、蘿卜花葉病毒、南瓜花葉病毒、菜豆粗縮花葉病毒、蠶豆染色病毒、大豆屬花葉病毒、 豌豆綠斑駁病毒、豌豆輕花葉病毒、鶉豌豆花葉病毒、紅三葉草斑駁病毒、塊根落葵C病毒 和蕪菁環(huán)斑病毒。
[0036] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的引物組及其試劑盒具 有廣譜性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)周期短等特點(diǎn)，適用于進(jìn)出境口岸及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上豇 豆花葉病毒屬病毒的快速檢測(cè)與監(jiān)測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒的廣譜性檢測(cè)結(jié)果。M :DNA分子量 標(biāo)準(zhǔn)IOObp DNA Ladder ;1:安弟斯馬鈴薯斑駁病毒（DSMZ PV-0057) ;2:蠶豆真花葉病毒 (DSMZ PV-0098) ;3 :菜豆莢斑駁病毒（ACD V082-PV) ;4 :菜豆莢斑駁病毒（Agdia C1858); 5:豇豆花葉病毒（Agdia C1319) ;6:豇豆花葉病毒（Agdia C1860) ;7:豇豆重花葉病毒 (ATCC PV-273) ;8 :豇豆重花葉病毒（DSMZ PV-0050) ;9 :蘿卜花葉病毒（DSMZ PV-0355); 10 :南瓜花葉病毒（Agdia C2013) ;11 :空白對(duì)照。
[0038] 圖2為豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒的特異性驗(yàn)證結(jié)果。M :DNA分子量 標(biāo)準(zhǔn)IOObp DNA Ladder ;1 :菜豆莢斑駁病毒（Agdia C1858) ;2 :蠶豆萎蔫病毒1號(hào)（DSMZ PV-0067) ;3 :葡萄扇葉病毒（Adgen 1147-11) ;4 :桃叢簇花葉病毒（Agdia C1973) ;5 :懸鉤 子環(huán)斑病毒（DSMZ PV-0429) ;6 :番爺黑環(huán)病毒（Adgen 1068-11) ;7 :番爺環(huán)斑病毒（Agdia C1939) ;8 :煙草環(huán)斑病毒（Agdia C1714) ;9 :健康豇豆葉片；10 :健康菜豆葉片；11 :健康南 瓜葉片；12 :空白對(duì)照。
[0039] 圖3為豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。其中，A為本發(fā)明 實(shí)施例1試劑盒的檢測(cè)結(jié)果；B為對(duì)照檢測(cè)結(jié)果。A和B中，M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp DNA Ladder ;1 :南瓜花葉病毒cDNA KT1稀釋液；2 :南瓜花葉病毒cDNA KT2稀釋液；3 :南瓜花 葉病毒cDNA KT3稀釋液；4:南瓜花葉病毒cDNA KT4稀釋液；5:南瓜花葉病毒cDNA KT5稀 釋液；6 :南瓜花葉病毒cDNA KT6稀釋液；7 :南瓜花葉病毒cDNA KT7稀釋液；8 :南瓜花葉 病毒cDNA KT8稀釋液。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0041] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042] 安弟斯馬鈴薯斑駁病毒：德國(guó)菌種保藏中心（DSMZ)，保藏編號(hào)為DSMZ No.PV-0057。
[0043] 蠶豆真花葉病毒：德國(guó)菌種保藏中心（DSMZ)，保藏編號(hào)為DSMZ No. PV-0098。
[0044] 菜莢斑駁病毒：公司名稱：AC Diagnostics, Inc.;產(chǎn)品編號(hào)為V082-PV。
[0045] 菜S?莢斑駁病毒：公司名稱：Agdia, Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為L(zhǎng)ot No :C1858。
[0046] 豇豆花葉病毒：公司名稱：Agdia，Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為L(zhǎng)ot No :C1319。
[0047] 豇豆花葉病毒：公司名稱：Agdia，Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為L(zhǎng)ot No :C1860。
[0048] 豇豆重花葉病毒：美國(guó)菌種保藏中心（ATCC)，保藏編號(hào)為：ATCC No. PV-273。
[0049] 豇豆重花葉病毒：德國(guó)菌種保藏中心（DSMZ)，保藏編號(hào)為DSMZ No. PV-0050。
[0050] 蘿卜花葉病毒：德國(guó)菌種保藏中心（DSMZ)，保藏編號(hào)為DSMZ No. PV-0355。
[0051] 南瓜花葉病毒：公司名稱：Agdia，Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為L(zhǎng)ot No :C2013。
[0052] 蠶豆萎蔫病毒1號(hào)：德國(guó)菌種保藏中心（DSMZ)，保藏編號(hào)為DSMZ No. PV-0067。
[0053] 葡萄扇葉病毒：公司名稱：NEOGEN EUROPE Ltd-ADGEN Phytodiagnostics (在中國(guó) 注冊(cè)的公司名稱：安德珍生物技術(shù)（北京）有限公司），產(chǎn)品編號(hào)為Adgen No. 1147-11。
[0054] 桃叢簇花葉病毒：公司名稱：Agdia，Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為Agdia Lot No. C1973。
[0055] 懸鉤子環(huán)斑病毒：德國(guó)菌種保藏中心（DSMZ)，保藏編號(hào)為DSMZ No. PV-0429。
[0056] 番爺黑環(huán)病毒：公司名稱：Agdia, Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為L(zhǎng)ot No :1068_11。
[0057] 番爺環(huán)斑病毒：公司名稱：Agdia, Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為L(zhǎng)ot No :C1939。
[0058] 煙草環(huán)斑病毒病葉：公司名稱：Agdia，Inc.，產(chǎn)品編號(hào)為L(zhǎng)ot No :C1714。
[0059] 實(shí)施例I、豇豆花葉病毒屬病毒廣譜檢測(cè)試劑盒配置（50次檢測(cè)量）
[0060] 1)弓丨物 Oligo (dT)18 :濃度為 IOii mol/L，l 管（IOOiiL);
[0061] 2)反轉(zhuǎn)錄緩沖液：5X，1 管（250iiL);
[0062] 3) dNTPs :濃度為 10mmol/L，1 管（100 ii L);
[0063] 4)M_MLV 反轉(zhuǎn)錄酶：200U/ ii L，1 管（30 ii L);
[0064] 5) RNA 酶抑制劑：40U/ ii L，1 管（30 ii L);
[0065] 6)無(wú) RNA 酶 ddH20,1 管（ImL)；
[0066] 7)PCR 緩沖液（含 25mmol/L 的 Mg2+) :10X，1 管（300 ii L);
[0067] 8) Taq DNA 聚合酶：5U/ ii L，1 管（30 ii L);
[0068] 9)引物 ComoV-2-F2-M4 :濃度為 I ii mol/L，1 管（120 ii L);
[0069] 10)引物 ComoV-2-R2_Ml :濃度為 I ii mol/L，1 管（120 ii L);
[0070] 11)弓丨物 M4 :濃度為 10iimol/L，l 管（120iiL);
[0071] 12)弓丨物 Ml :濃度為 10 ii mol/L，1 管（120 ii L);
[0072] 13)陽(yáng)性對(duì)照樣品：含有南瓜花葉病毒的葉片凍干粉末，1管（0. Ig)。
[0073] 其中，引物Oligo(ClT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，其序列為：
[0074] 5, -AAAAAAAAAAAAAAAAAA-3,（序列 1)。
[0075] 引物 ComoV-2-F2-M4、ComoV-2-R2-Ml、M4 和 Ml 為四條 PCR 擴(kuò)增引物， ComoV-2-F2-M4和ComoV-2-R2-Ml中除了含有M4和Ml序列外，其余序列是根據(jù)豇豆花葉病 毒屬病毒RNA2上的CP基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的1對(duì)簡(jiǎn)并引物。四條擴(kuò)增引物的序列為：
[0076] ComoV-2-F2-M4 :5，-GTTTTCCCAGTCACGACGATGGBTGYCCHYAYYTRTRYGC-3,（序列 2);
[0077] ComoV-2-R2-Ml :5, -AGTCACGACGTTGTASSHMWWYTCRAADCCVBYRTTNGGHCC-3,（序列 3)。

【權(quán)利要求】
1. 用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的引物組，為引物組A或引物組B ; 所述引物組A由一條反轉(zhuǎn)錄引物和四條擴(kuò)增引物組成；所述反轉(zhuǎn)錄引物為序列表中序 列1所示的單鏈DNA ;所述四條擴(kuò)增引物為序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示的 四條單鏈DNA ; 所述引物組B由四條擴(kuò)增引物組成；所述四條擴(kuò)增引物為序列表中序列2、序列3、序列 4和序列5所不的四條單鏈DNA。
2. 用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的試劑，包括權(quán)利要求1所述的引物組，以及如下中 的至少一種：dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑。
3. 用于檢測(cè)豇豆花葉病毒屬病毒的試劑盒，含有權(quán)利要求1所述的引物組或權(quán)利要求 2所述的試劑，以及作為陽(yáng)性對(duì)照的豇豆花葉病毒屬病毒的病葉凍干粉末；和/或作為陰性 對(duì)照的水。
4. 權(quán)利要求1所述的引物組或權(quán)利要求2所述的試劑或權(quán)利要求3所述的試劑盒在檢 測(cè)待測(cè)樣品中是否含有豇豆花葉病毒屬病毒中的應(yīng)用。
5. -種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有豇豆花葉病毒屬病毒的方法，包括如下步 驟： (1) 從所述待測(cè)樣品中提取總RNA，采用權(quán)利要求1中所述的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)，得到待測(cè)cDNA ; (2) 以所述待測(cè)cDNA作為模板，用權(quán)利要求1中所述的四條擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲 得PCR產(chǎn)物； (3) 根據(jù)所述PCR產(chǎn)物的大小按照如下方法確定所述待測(cè)樣品中是否含有豇豆花葉病 毒屬病毒：若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為590?650bp的DNA片段，則所述待測(cè)樣品中含有 或候選含有豇豆花葉病毒屬病毒，反之則所述待測(cè)樣品中不含有或候選不含有豇豆花葉病 毒屬病毒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，用所述四條擴(kuò)增引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)時(shí)，所述四條擴(kuò)增引物的摩爾比為： 序列表中序列2所示的單鏈DNA :序列表中序列3所示的單鏈DNA :序列表中序列4 所示的單鏈DNA :序列表中序列5所示的單鏈DNA為I : I : 10 : 10。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述進(jìn)行PCR反應(yīng)共進(jìn) 行35個(gè)循環(huán)，前5個(gè)循環(huán)的退火溫度為42°C，后30個(gè)循環(huán)的退火溫度為45°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)的溫度為42 °C。
9. 權(quán)利要求1所述引物組的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括將權(quán)利要求1 所述引物組中各單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
10. 權(quán)利要求1所述引物組在制備權(quán)利要求2所述試劑或權(quán)利要求3所述試劑盒中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104212917SQ201410478602
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】廖富榮, 方志鵬, 林振基, 吳媛 申請(qǐng)人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心